Высокое разрешение Количественное запаха, руководствуясь поведения в Дрозофилы Использование Flywalk Парадигма

Summary

Автоматизированная система отслеживания Flywalk используется для высокого разрешения количественного запаха руководствоваться поведения в дрозофилы.

Abstract

В их естественной среде, насекомые, такие как уксус летать дрозофилы были засыпаны огромным количеством химически различных пахучих веществ. Чтобы усложнить ситуацию еще дальше, запахи, обнаруженные нервной системе насекомых, как правило, не одиночные соединения, но смеси, состав и коэффициенты концентрации меняться. Это приводит к почти бесконечное количество различных стимулов обонятельные, которые должны быть оценены нервной системы.

Чтобы понять, какие аспекты запах стимул определить свою оценку по лету, поэтому желательно, чтобы эффективно изучить запах наведением поведение по отношению к многим пахучих веществ и запахов смесей. Для непосредственно коррелируют поведение на нейронной активности, поведение должно быть количественно в сопоставимой времени и в одинаковых условиях стимулирования, как и в нейрофизиологических экспериментах. Тем не менее, многие используемые в настоящее время обонятельные биопробы в Drosophila neuroethology довольно специальванный либо в сторону эффективности или к резолюции.

Flywalk, автоматизированная доставка запах и система слежения, устраняет разрыв между эффективностью и разрешения. Это позволяет определить, когда именно запах пакет стимулировал свободно ходить муху, и определить динамическое animal's реакцию поведения.

Introduction

Главная цель любого neuroethological исследования, чтобы установить причинно-следственную связь между активностью состояний отдельных нейронов или нервных цепей и поведения организма. Для достижения этой цели нейронную активность и поведение должны быть проверены в одинаковых условиях стимулирования и эти условия стимулирования в идеале должны быть аналогичны тем, нервная система под пристальным превратилась в смысл. Особенно, когда дело доходит до поведенческих биопроб, эти требования исторически оказались весьма требовательны в дрозофилы обонятельный neuroethology.

После освобождения от источника, запах перья быстро распадаются на тонких нитях с турбулентной диффузии, вызванной движение воздуха является основным фактором, определяющим распределение запах ^1. В результате насекомое навигацию к источнику запаха испытывает периодическую стимуляцию с запахом пакетов перемежаются с переменными интервалами чистым воздухом. И то и другоеходьба и летающих насекомых - в том числе у дрозофилы - были продемонстрированы использовать эту прерывистый режим стимуляции для навигации по растущие с наветренной стороны от факела встречи и преимущественно движется боковой ветер в отсутствие запахов ^{2 - 5.} В то время как процедуры стимуляции физиологических экспериментов в значительной степени сходны насекомое может испытать в своей природной среде либо для обеспечения единого клубами запахов, вкрапленных длительных периодов чистого воздуха или динамических последовательностей стимуляции ^{6 - 11,} многие поведенческие биопроб, используемых в Drosophila neuroethology, таких как ловушки анализа , открытое поле арены или Т-лабиринт полагаться на запах градиентов ^{12 - 15.} Тем не менее, из-за запаха градиенты по определению являются переменными в концентрации в зависимости от расстояния от источника запаха, конкретное поведение не может быть отнесена к точной концентрации запаха, используя эти парадигмы. Кроме того, наклонзапах градиент критически зависит от физико-химических свойств одоранта. Градиент очень летучего соединения будет мельче, чем созданная менее летучего соединения и, следовательно, труднее отслеживать для организма, опираясь на измерения разности концентрации в пространстве в качестве единственного средства навигации ^{16 - 20,} которые могут привести к неправильному толкованию обонятельных предпочтений в частности в выборе анализов. Этот эффект также весьма вредно при расследовании поведение по отношению к запах смеси, потому что это приводит к различным соотношением компонентов смеси в каждой точке в пространстве и, следовательно, снова исключает четкую корреляцию между физиологией и поведением.

В то время как уксус мух, как правило, объединять в брожения фруктов, они одиночные в их навигации к источникам питания и яйцекладки сайтов. Тем не менее, вместо того, тестирование отдельных животных многих поведенческих парадигмы используется в Drosophila neuroetholoгы изучить запах наведением поведение когорт мух и привлекательность оценивается как доля мух, выбирающих аромат по контрольной стимула. Эти когорты эксперименты внесли большой вклад в понимание летучей neuroethology и многие из наблюдений, сделанных с их помощью может быть подтвержден в одной мухи экспериментов. Тем не менее, было отмечено, что летит могут влиять друг на other's решение ^21, а в крайних случаях оценка запаха может перейти от безразличия к расторжению в зависимости от плотности населения ^22. Кроме того, результаты этих видов экспериментов часто предоставляют только конечную последовательность поведенческих решений, а не наблюдая, что муха делает в то время как это делает, что бы желательно при попытке соотнести поведение с нейронной активности. Эти когорты эксперименты довольно низким разрешением контрастируют с высоким разрешением методов одного мух, таких, как привязанные арен летных и беговыми дорожками, которые позволяютдля прямого наблюдения поведенческих реакций во время стимул представлен ^20,23,24. Тем не менее, эксперименты когорты по-прежнему популярны, потому что они очень эффективны и обеспечивают надежные результаты даже при сравнительно низкой размеров образца, потому что межиндивидуальную и между проб изменчивости частично в среднем из-за наблюдения за популяциями длительных периодов времени. В то время как на привязи полета и беговая дорожка, вероятно, предоставить золотой стандарт в отношении стимулов презентации и временное разрешение, арены, используемые предназначены для одиночных животных, и поэтому много времени, чтобы получить размеры образца необходимо для статистического анализа. Несколько иные подходы недавно были разработаны, которые позволяют эффективное приобретение поведенческих данных высокого разрешения в сочетании с четкой режима стимула. Они включают в себя без присмотра 3D-слежение нескольких мух уксуса в аэродинамической трубе в сочетании с точной 3D-модели запах шлейфа ⁵ , отслеживание нескольких отдельных мух в выборе камер, поставляемых с воздушных потоков с обеих сторон ^{25 и} парадигмы Flywalk ^26.

В Flywalk, 15 отдельных мухи расположены в небольших стеклянных трубок и постоянно контролируется с помощью накладных камеры под красных фонарей условиях. Запахи добавляются к непрерывному воздушного потока 20 см / сек, и проходить через стеклянных трубок с постоянной скоростью. Воздушный поток увлажняется, пропуская его через 250 мл флаконах, содержащих по дистиллированную воду (увлажнителей) перед входом в систему доставки запаха. В flies' позиции отражаются в квадратной области интереса (ROI), охватывающей большую часть длины труб запах (но не включая внешние края труб (примерно 5 мм с каждой стороны), где мухи не может двигаться дальше вверх или ветру) вокруг времени презентации запаха (фиг.1А, Б). Fly тождества поддерживается постоянным с помощью системы слежения тhroughout эксперимент на основе их Y-позиции (т.е. их пределы стеклянной трубки). Запах стимуляция достигается с помощью многокомпонентного стимул устройство, которое позволяет в презентации до 8 одноместных запахов и всевозможных смесей ^26,29 (рис 1B). Курс эксперимента управляется с помощью компьютера, регулирующей систему доставки и сбора запаха температуры и влажности информацию (компьютер 1, рис 1С). Этот компьютер также контролирует регистратора (начала / остановки записи) на втором компьютере, который непрерывно отслеживает лету позиции на 20 кадров в секунду (компьютерные 2). Fly позиции, статус запах клапана (т.е. временной точки открытия клапана), запах ID, температуру и влажность вокруг циклов запах стимуляции вошли на компьютере 2. Таким образом информация о запахом и летать позиции синхронизированы и экспортировать как .csv-файлов, которые могут быть дополнительно обработаны и проанализированы с помощью пользовательских написаны процедуры анализа. Потому каквся система управляется компьютером, без вмешательства человека не требуется во время экспериментальной сессии.

Protocol

Строительные и технические детали Flywalk были описаны в другом месте ²⁶ (в случае каких-либо проблем установления этого созданы, дополнительную информацию можно получить из МК). Здесь мы сосредоточимся на подробные инструкции по обращению парадигмы, которая поможет получить достоверные результаты.

1. Обращение Fly

1. Задняя летит в странах с низким культур средней плотности по пищевой среды ²⁷ при 12 ч: 12 ч света: темно режиме при 23-25 ​​° С и относительной влажности 70%. Для этого, позволяют 20-30 недавно появились взрослых мух, чтобы воспроизвести в большом флаконе пищевой в течение 1 недели, затем удалите взрослых мух и ждать потомства, чтобы появиться.
2. Соберите 30-40 недавно появились (возраст <24 ч) для взрослых мух и возраст их в новом флакон пищевой среду ²⁷ в течение 3-5 дней.
3. Двадцать четыре часа до начала поведенческого эксперимента: Перевести все 30-40, собранных ранее 3-5 г старый (см 2.2) летит к новому VIаль содержащий влажную вилку поролона или тонкой бумаги, используя влажную аспиратор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не обезболивания мух, используя _CO 2.

2. Подготовка установки Flywalk

1. Используйте 250 мл бутылки как увлажнители. Заполните увлажнители с 100 мл дистиллированной воды.
2. Подготовка запах флаконов.
   1. Подготовьте 500 мкл 10 ^-3 разведений чистого запахов этилацетат, бутират ацетата, изопентил и 2,3-бутандион в минеральном масле растворителем.
   2. Прикрепите две шаровые клапаны за запаха флаконе. Обратите внимание, что проверку клапанов позволяет только однонаправленной воздуха. Таким образом, подключить обратные клапаны таким образом, что воздух может войти в пузырек с одной стороны и оставить его на другой стороне.
   3. Удалить крышку 200 мкл ПЦР реакционную трубку. Пипетировать 100 мкл каждого разбавления запаха в отдельную пробирку и реакционный поместить пробирки в отдельные пробирки запах. Также подготовить один запах флакон, содержащий только растворитель минеральной OIл.
   4. Плотно запечатать запах флаконов, закрыв их с помощью вилки из нержавеющей стали и резиновые прокладки.
   5. Подключите 5 флаконов запах (4, содержащие запахи и 1, содержащие минеральное масло) в системе доставки запах. Убедитесь, что для подключения их в правильном направлении потока. Неправильное подключение не только угрозу запланированный эксперимент, но он также может загрязнять систему доставки.
3. Проверка на наличие утечек путем герметизации выпускное отверстие смесительной камеры стимула устройства. Убедитесь, что все воздушные потоки до стимула устройства в настоящее время постепенно падает до нуля. Если нет, проверьте на наличие утечек, которые сейчас могут быть идентифицированы по шипящим звуком воздуха, выходящего из системы.
4. Тщательно передачи 15 индивидуальных мух до 15 отдельных стеклянных трубок, используя аспиратор и тесные стеклянные трубки с обеих сторон с использованием соответствующих адаптеров.
   Примечание: Поскольку система должна герметично закрываться для успешных экспериментов, убедитесь, что адаптеры подходят стеклянные трубки плотнои обратите внимание, что стеклянные трубки может нарушить во время этого шага. Позаботьтесь, чтобы избежать травм, нося защитные перчатки и защитные очки.
5. Подключите стеклянных трубок для установки Flywalk и, отсюда, подождите, по крайней мере, за 15 минут до начала эксперимента, чтобы мухи приучить к новой среде.
6. После установки стеклянных трубок: проверить считывания вниз по течению метров цифровых потоков на компьютере 1 Если 16 воздушные потоки после стеклянных трубок добавить до воздушного потока, поступающего в систему. Кроме того, проверьте на компьютере 1, если влажность составляет от 60% до 80%.
7. Дизайн протокол стимулом управления последовательность и сроки запах стимулов, представленных мух. Чтобы получить, например, описанным данных, присутствующих 4 запахов и управления (минеральное масло), отдельно и все возможные тройных и четвертичные смесей запахов одновременно в 40 раз каждый. Установите длительность импульса до 500 мс при межстимульный интервале 90 сек и случайный стимул последовательность.
8. Включите LiИсточник GHT (LED-кластер; λ = 630). Убедитесь, что для обеспечения достаточного света для эффективного отслеживания без повышения температуры внутри стеклянных трубок.
9. Настройка область интереса следящей системы путем перетаскивания кадр по области, которая будет контролироваться таким образом, что все 15 стеклянные трубки включены и примерно 5 мм из торцы трубок исключены.
10. Настройка 14 параллельных линий разделения между отдельными трубками в системе отслеживания путем изменения их Y-позиции в соответствующем сценарии, чтобы сохранить лицо летит идентифицировать в течение всего эксперимента. Убедитесь, что положение их таким образом, что всегда есть одна стеклянная трубка между двумя такими разделительной линии, так как только один муха будет отслеживаться между любым набором двух линий.
11. Убедитесь, что для установки параметров камеры таким образом, что летит надежно отслеживаться на протяжении стеклянных трубок. Если мухи теряются по краям области, представляющей интерес, увеличить яркость или коэффициент усиления трекинга сoftware. Избегайте механических вибраций системы слежения. Трек с использованием коммерческого программного обеспечения в соответствии с протоколом производителя.
12. Начните эксперимент, начиная протокол стимул. Запись flies' XY-координаты в 20 кадров в секунду (кадров в сек) и войти сочетании со статусом запах клапана в текстовых файлах.

Анализ данных 3.

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги в анализе данных автоматизированы с помощью пользовательских написан подпрограмм в R. Поскольку эти шаги имеют решающее значение для получения значимых результатов анализа, тем не менее быть представлены в шаг за шагом образом. Исходные данные для анализа являются .csv-файлы, содержащие синхронизированной информации о статусе запах клапана, номер импульса в эксперименте и 15 полетов рентгеновских позиций в см на общей оси времени в течение одного запаха стимуляции цикла. Пользовательский код для анализа данных могут быть предоставлены по запросу.

1. Открыть CSV-файл, найти временную точку открытия клапана означало по чаNGE в колонке, представляющей состояние клапана.
2. Рассчитать линейную функцию запаха положении виде
   F (T) = S * T + I
   где т время в цикле стимуляции, с скорость ветра (здесь 20 см / сек) и перехват я может быть рассчитана с использованием временной точкой запах входит трубы в положении 0 (открытия клапана плюс задержки).
3. Найти временную точку, в которой запах и летать X-позиция пересекаются для каждого летать и установить на этот раз точку в 0. Примечание: Таким образом муха позиции выровнены друг individual's столкнуться с запахом.
4. Исключить мух, сидящих на самых краях области интереса.
5. Рассчитать скорость от X-позиции путем деления смещение вдоль оси х на интервале времени (100 мс) и порядок повторного цикла для каждого стимуляции.
6. Чтобы получить сократить время обучения, как показано на рисунке 2Е расчета средней скорости тайм-курс для каждого лету и запаха и от тех, среднее время курс для данного запаха.
7. Чтобы получить чистую смещение, как показано на фиг.3С расчета чистой смещение в течение 4 с после запаха импульса для каждого события отслеживания и впоследствии средней чистой перемещения в лету и запаха.

4. Процедура очистки

1. Clean Glass трубы
   1. Удалить мух и адаптеры от стеклянных трубок и замочить стеклянные трубки в производстве моющих средств.
   2. Промыть стеклянные трубки под проточной дистиллированной воде и высушить их с помощью сжатого воздуха.
   3. Тепло стеклянные трубки при 200 ° С в течение 8 час.
2. Чистый Запах Система доставки
   1. Удалить все запахи флаконы и трубки из центральной камеры смешивания.
   2. Удалить трубок адаптеры из смесительной камеры.
   3. Чистый смесительная камера путем промывки его с моющим раствором и лабораторного растворителей (например, этанол, ацетон). Выполните следующие действия в лабораторных капотом.
   4. Сухой смесительной камере при использовании сжатого воздуха и нагревают его при 200 ° С в течение 8 ч.
3. Чистый Запах Флаконы и обратные клапаны
   1. Удалить стали пробку (отбрасывание резиновая прокладка) и обратные клапаны с запахом флаконах и замочить всех компонентов очистки лаборатория решения.
   2. Соникатные компоненты в ультразвуковой ванне и промыть их дистиллированной водой.
   3. Очистите все компоненты, за исключением обратных клапанов с этанолом и ацетоном. Выполните следующие действия в лабораторных капотом.
   4. Сухих компонентов при использовании сжатого воздуха и нагревают их при 200 ° С в течение 8 ч.
   5. Чистые клапаны с внутренней стороны промывки их этанолом и ацетоном с помощью шприца (рассмотреть направление потока). Выполните следующие действия в лабораторных капотом носить лабораторные очки. Потому что ацетон нападает резиновые детали, немедленно сухие обратные клапаны путем промывки их сжатым воздухом.
   6. Удалить остатки запахов пульсирующим воздухом через обратные клапаны в течение нескольких дней. Используйте инкубатор на 60 ° С и 1 сек воздух на / 1 сек воздуха от режима для этого операции очистки.

Results

Из мухи могут свободно распределить их в стеклянных трубках между запах импульсов и импульс запаха проходит через стеклянные трубки с постоянной скоростью мухи столкнулись запах в различные моменты времени в зависимости от их положения х в момент стимуляции. В результате, приступы противопотоковой траекторий вызываемых 500 мсек импульса привлекательной 10 ^-3 разбавления этилацетата с задержкой примерно на 1 сек для мух на ветру конца своих стеклянных трубок по сравнению с теми, мух, сидящих ближе к против вет...

Discussion

Хотя система Flywalk оказывается весьма сложной, на первый взгляд, как только установлен и запущен его легко использовать и производит очень надежные результаты. Чтобы подчеркнуть состоятельность результатов, полученных с биопроб, можно сказать, что представительные результаты, показанные здесь, были получены почти 2 года после некоторых результатов, показанных в предыдущем исследовании ²⁹ с модифицированной установке с использованием нового программного обеспечения отслеживания и источник света. Тем не менее...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Настройка Flywalk	Пользовательские		данные доступны по запросу
Стимульное устройство	Пользовательские		данные доступны по запросу
Светодиодный кластер	Пользовательские		данные доступны по запросу
HD Pro Webcam C920	Logitech, Лозанна, Швейцария
2 компьютера
Flywalk Перезагружено программное обеспечение v1.0	Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net)
Программное обеспечение Labview 11.0	National Instruments, Остин, Техас
Стандартный корм	для мух Пользовательский
Стандартные флаконы	от мух Greiner bio-one GmbH, Фрикенхаузен, Германия
Стандартные флаконы	от мух Greiner bio-one GmbH, Фрикенхаузен, Германия
аспиратор	Custom
минеральное масло	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
ароматизаторы	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
200 &микро; l Реакционные пробирки для ПЦР	Biozym Scientific GmbH, Ольдендорф, Германия