Биомиметические Материалы для характеристики Бактерии-хозяин взаимодействий

Краткое содержание

Прикрепление бактерий к клеткам хозяина является ключевым этапом во время колонизации и инфицирования хозяина. Данный протокол описывает генерацию рекомбинантных адгезинов, связанных с полимерами, в виде биомиметических материалов, которые позволяют анализировать вклад отдельных адгезинов в эти процессы, независимо от других бактериальных факторов.

Аннотация

Прикрепление бактерий к клеткам хозяина является одним из самых ранних событий во время бактериальной колонизации тканей хозяина и, таким образом, ключевым этапом во время инфекции. Биохимическая и функциональная характеристика адгезинов, опосредующих эти первоначальные взаимодействия бактерий и хозяина, часто нарушается присутствием других бактериальных факторов, таких как компоненты клеточной стенки или секретируемые молекулы, которые мешают анализу. Данный протокол описывает производство и использование биомиметических материалов, состоящих из чистых рекомбинантных адгезинов, химически связанных с коммерчески доступными функционализированными гранулами полистирола, которые были успешно использованы для анализа биохимических и функциональных взаимодействий между отдельными бактериальными адгезинами и рецепторами клетки-хозяина. Также обсуждаются протоколы для различных химических соединений, позволяющих проводить направленную иммобилизацию рекомбинантных адгезинов на полимерных каркасах, а также для оценки эффективности связывания получаемых «бактериомиметических» материалов. Далее мы описываем, как эти материалы могут быть использованы в качестве инструмента для ингибирования патогенно-опосредованной цитотоксичности, а также обсуждаем масштабы, ограничения и дальнейшее применение этого подхода в изучении взаимодействий бактерий и хозяина.

Введение

Анализ взаимодействий между бактериальными адгезинами и рецепторами поверхности хозяина на границе хозяин-патоген является важным шагом на пути к нашему пониманию основных механизмов, управляющих бактериальной адгезией. В конечном счете, это поможет нам определить стратегии вмешательства в эти процессы во время инфекций. Проводя такие исследования, мы часто сталкиваемся с дилеммой: биохимический и биофизический анализ молекулярных механизмов связывания адгезина требует их отделения от других компонентов клеточной стенки, которые могут влиять на события адгезии. С другой стороны, использование рекомбинантных растворимых белков чрезмерно упрощает процесс адгезии, игнорируя закрепление белка в клеточной стенке бактерии и многовалентность связывания, достигаемую за счет отображения бактериальной поверхности. Точно так же, с точки зрения клетки-хозяина, встреча и связывание с отдельными молекулами адгезина не всегда оказывает одинаковое влияние с точки зрения организации плазматической мембраны, текучести мембраны и^{кластеризации} рецепторов, и это, в конечном счете, затрудняет оценку влияния адгезии на клеточную сигнализацию хозяина и результат взаимодействия бактерий и хозяина.

Недавно был разработан метод, в котором рекомбинантные очищенные адгезины или фрагменты адгезина направляются и ковалентно связываются с полимерными частицами, похожими по размеру на бактерии, имитируя таким образом бактериальное поверхностное отображение. Этот подход был использован для лечения целого ряда различных адгезинов, от грамотрицательных поливалентных молекул адгезии (MAMs)^{2, 3} до грамположительных адгезинов, включая фибронектин-связывающий белок Staphylococcus aureus (FnBPA)^{4, 5} и Streptococcus pyogenes F1 ^{6, 7}. Этот метод позволил препарировать фрагменты адгезина, важные для связывания клетки-хозяина, идентифицировать рецепторы поверхности хозяина и определить их поведение на поверхности клетки-хозяина, учитывая при этом как аффинность связывания, так и авидность ^{1, 8}. Кроме того, этот подход был использован для исследования эффективности иммобилизованных адгезинов и производных в качестве ингибиторов взаимодействий хозяина и патогена ^{8, 9}. Было продемонстрировано, что поверхностно-сопряженные производные многовалентной молекулы адгезии (MAM) 7 Vibrio parahaemolyticus могут быть использованы для ослабления ряда бактериальных инфекций in vitro, в том числе вызванных патогенами с множественной лекарственной устойчивостью, такими как Acinetobacter baumannii и метициллин-резистентный S. aureus (MRSA) ^{7, 9}.

Здесь мы описываем различные химические составы, которые могут быть использованы для иммобилизации адгезинов к коммерчески доступным функционализированным частицам полистирола. Благодаря широкому спектру доступных поверхностных функций, меток и размеров частиц, они являются полезным каркасом для производства бактериомиметических материалов для исследования адгезиновых взаимодействий с хозяином. Далее мы опишем методы для первоначальной характеристики реакции сопряжения и для расчета важных свойств получаемых материалов. Наконец, в качестве примера их применения обсуждается использование адгезинов, связанных с шариками, в качестве конкурентных ингибиторов бактериальных инфекций in vitro, а также будущие масштабы и ограничения этого подхода.

Протокол

1. Химический Сцепление белков в полимерные гранулы

1. Тиол-амин направленного муфта
   Примечание: Этот протокол предназначен для соединения цистеина, содержащего белки в амин функционализованный полимерных гранул, с помощью сульфосукцинимидил 4- (п -maleimidophenyl) бутират (сульфо-SMPB), как сшивающего агента (Рисунок 1).
   
   Рисунок 1. Сшивка стратегию, используемую для направленного тиол-амина связи белков в полимерные шарики. Амин-модифицированные гранулы полистирола активируются сульфо-SMPB. Малеимид реагирует со свободными остатками цистеина направленно пару белков бисером. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
   1. Приготовление реагентов:
      1. Подготовьте PBS (100 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl, рН 7,0) и автоклав. Подготовьте запас 100x (0,5 М или 287 мг / мл в PBS) в ТСЕР (трис (2-карбоксиэтил) фосфин) непосредственно перед использованием.
      2. Подготовка 5x акции (10 мм или 4,58 мг / мл в дН ₂ O) в сульфо-SMPB непосредственно перед использованием.
      3. Подготовка 10x запас (500 мм или 88 мг / мл в PBS, рН 7,0) цистеина непосредственно перед использованием.
   2. Бисера активации:
      1. Смешайте шарик суспензии путем осторожного переворачивания и передачи необходимого количества бисера суспензии (например, 12 мл) в стерильную пробирку, содержащую 1,5 мл 1 мл стерильной PBS, рН 7,0.
      2. Аккуратно пипетки вверх и вниз, чтобы вымыть бисером и осадок центрифугированием в микроцентрифуге (2 мин при 16000 мкг).
      3. Осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить. Ресуспендируют осадком из гранул в 1 мл стерильной свежей PBS и повторить стадии промывки. Ресуспендируют осадком из гранул в 0,8 мл PBS.
      4. Добавить 200 мл свежеприготовленного 10 мМ сульфо-SMPB, чтобы получить конечную ОБОГАЩЕНИЯРацион 2 мм.
      5. Инкубируйте шарик подвески в течение 1 ч при 25 ° С на вращающемся колесе.
   3. Снижение белка:
      1. Во инкубационного периода стадии активации, подготовить белка для следующего шага соединительного так что он может быть немедленно добавлена ​​к активированным бисера.
         Примечание: Хотя это стадия восстановления не всегда требуется для GST (глутатион S-трансферазы) слитых белков, рекомендуется для обеспечения высокой эффективности связывания.
         1. Проверка концентрации белка, а также настроить его в конечной концентрации, требуемой для реакции сочетания. Примечание: 6 мМ в PBS белок, а объем 1 мл, как правило, используется.
         2. Добавить TCEP акции, чтобы получить конечную концентрацию 5 мм. Инкубируйте раствор в течение 30 мин при комнатной температуре.
            Примечание: реакционную смесь можно непосредственно использовать в последующей реакции сочетания.
         3. Сохранение небольшое количество (несколько мл) белкового раствора для определения про Концентрация Тейн и расчет эффективности связи (см раздел 2).
   4. Белок муфты шаг:
      1. Гранул активированные бусы центрифугированием (2 мин, 16000 х г в микроцентрифуге), и мыть гранул один раз в 1 мл свежей стерильной PBS.
      2. Ресуспендируют осадок в приготовленном растворе белка (например, 1 мл), с получением желаемого концентрации белка.
         Примечание: Концентрация белка во время стадии конденсации, будет зависеть от средней эффективности связывания (см раздел 2 для определения эффективности связывания) и желаемой плотности связи (как рассчитано в 1.1.4.3). Эффективность примерно 85% и желаемой конечной концентрации 5 мМ в 10 раз шарик суспензии, так концентрация белка в течение стадии конденсации должна быть примерно 6 мм.
      3. Вычислить плотность сцепления с использованием следующей формулы:
         JPG "/>, где
         ρ _{C Плотность} связь [количество белковых молекул / ^нм 2],
         концентрация белка конц белок [мг / мл],
         белок М _ш белок с молекулярной массой [Da],
         шарик конц концентрация шарик [количество бусин / L],
         Диаметр d шарик ^[нм 2]
         Число Авогадро
      4. Используйте плотность сцепления для расчета среднее расстояние лиганда:
         
      5. Инкубируйте белок-бусинка подвески в течение 2 ч при 25 ° С на вращающемся колесе.
         Примечание: НекоторыеБелки не могут быть стабильными при комнатной температуре. В этих случаях реакция может быть проведена при температуре 4 ° CO / N.
      6. Отключение оставшихся активированных групп на шариках добавлением цистеина запас до конечной концентрации 50 мМ и инкубируют подвески в течение 30 мин при 25 ° С на вращающемся колесе. Гранул шарики центрифугированием (2 мин, 16000 XG в микроцентрифуге).
      7. Хранить супернатант для определения концентрации белка и расчет эффективности связывания (см раздел 2).
      8. Промыть осадком из гранул в два раза с помощью 1 мл PBS и ресуспендируют в 1 мл PBS, чтобы свежие получением конечного продукта.
         Примечание: приведенный выше протокол, как правило, дают по 1 мл объединенного белка, в конечной концентрации 5 мМ белка, который может быть использован в качестве материала для 10x последующих экспериментах (см раздел 3).
      9. Чтобы перейти к разделу 3 протокола, работать с 100 мл / мл борта складе, или в конечной концентрации 500 нМ белка. Примечание: хорошая отправная точка для этого procedurе составит 2 × 10 ¹² бусины / мл, в результате чего средняя плотность сочетание 3 × 10 ^-4 белков / нм ² или средней шагом 57 нм на шарик диаметром 2 мм.
2. Тиол-карбокси направленного муфта
   Примечание: Этот протокол предназначен для соединения цистеин, содержащий белки карбоксильных функционализированных полистирольных шариков. Карбоксильная фрагмент сначала активируют с использованием 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC) / N-гидроксисукцинимид (NHS), амин модифицированного и затем сшивают с помощью сульфо-SMPB (рисунок 2).
   
   Рисунок 2. Сшивка стратегию, используемую для направленного тиол-карбоксильной связи белков в полимерные шарики. Карбоксилированная полистирольные гранулы сначала активируют EDC и NHS модифицированный с образованием полуустойчивых NHS-эфира. После амин-связь ethylenediаминов приводит к свободной аминогруппе, который реагирует с сульфо-SMPB. Малеимидные активирована шарики может реагировать со свободными остатками цистеина направленно пару белков бисером. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
   1. Приготовление реагентов:
      1. Подготовьте PBS (100 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl, рН 7,0) и автоклав.
      2. Подготовьте запас 100x (0,5 М или 287 мг / мл в PBS,) из ТСЕР непосредственно перед использованием.
      3. Подготовка 10x запас (20 мм или 4 мг / мл в PBS) ЭДК (1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид) непосредственно перед использованием.
      4. Подготовка 10x запас (50 мм или 6 мг / мл в PBS) в NHS (N-гидроксисукцинимида) непосредственно перед использованием.
      5. Подготовка 5x акции (10 мм или 4,58 мг / мл в дН ₂ O) в сульфо-SMPB непосредственно перед использованием.
      6. Б сразу Подготовьте 10x запас (500 мм или 88 мг / мл в PBS, рН 7,0) цистеинаEfore использование.
   2. Бисера активации:
      1. Смешайте шарик суспензии путем осторожного переворачивания и передачи необходимого количества бисера суспензии (например, 12 мл) в стерильную пробирку, содержащую 1,5 мл 1 мл стерильной PBS, рН 7,0.
      2. Аккуратно пипетки вверх и вниз, чтобы вымыть бисером и осадок центрифугированием в микроцентрифуге (2 мин при 16000 мкг).
      3. Осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить.
      4. Ресуспендируют осадком из гранул в 1 мл стерильной свежей PBS и повторить стадии промывки.
      5. Ресуспендируют осадком из гранул в 0,8 мл PBS.
      6. Добавить 100 мл 10х EDC складе (2 мм конечная концентрация) и сразу 100 мл 10х NHS раствора (5 мм конечная концентрация) в шарик суспензии.
      7. Инкубируйте шарик подвески в течение 30 мин при 25 ° С на вращающемся колесе.
      8. Вымойте бисером раз в 1 мл PBS и ресуспендируют в 0,8 мл стерильной PBS свежие.
      9. Добавить 200 мл этилендиамина и вклubate борта подвеску в течение 1 ч при 25 ° С на вращающемся колесе.
      10. Промыть шарики один раз с помощью 1 мл PBS и ресуспендируют бусины в 0,8 мл свежей PBS.
      11. Действуйте из раздела 1.1.2.4 (активация шарик с сульфо-SMPB), как описано в разделе 1.1.2 и следуйте дальнейшим протоколу, описанному в разделе 1.1 (Тиол-амин направленного связи). Выполнение белковый препарат и шаги связывающих белки таким образом, идентичны описанным в разделе 1.1.
          Примечание: Типичная эффективность связывания с использованием этого протокола несколько ниже по сравнению с разделе 1.1, следовательно, регулировать начальную концентрацию белка соответственно для достижения той же плотности сцепления (прибл 75%)..

2. Определение эффективности Сцепление

Примечание: Для определения концентрации белка, использовать реагент Брэдфорд ^{10 и} колориметрические анализы следующим образом:

1. Аккуратно переверните Брэдфорд реагент по электронной Nsure однородность реагента.
2. Использование 10 мг / мл маточного раствора BSA, готовят белковые стандарты, охватывающие концентрации от 0,1 до 1,5 мг / мл BSA в буфере.
3. Добавить 250 мл реагента Брэдфорда в лунки 96-луночного планшета в. Подготовьте достаточно скважин для всех образцов, стандартов белка и отрицательных контролей (только буфер).
4. Добавляют 5 мл образца белка (белков или стандартов буфере, за отрицательный контроль) к реагенту в 96-луночный планшет.
5. Инкубируйте планшет на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение 10 мин.
6. Измерьте оптическую плотность при 595 нм с использованием планшет-ридер.
7. Создание стандартной кривой концентрации БСА против A595 нм и использовать это для определения концентрации белка в начальных и супернатантных образцов.
8. Рассчитайте концентрацию связанного белка следующим образом:
   
9. Рассчитать эффективность сочетания, как:
   00eq4.jpg "/>

3. Использование бисера в сочетании-адгезины в конкурентных анализах

1. Приготовление:
   1. Семя 1 мл на лунку клеток HeLa в концентрации 150000 клеток / мл в 24-луночного планшета за день до соревнований анализа, чтобы клетки, чтобы достичь примерно 80% слияния до начала эксперимента.
   2. Настройте каждый экспериментальный состояние в трех экземплярах. Включить скважин для отрицательных контролей (отсутствие бактерий, добавленные в конкурентных анализах), положительных контролей (бисер управления в сочетании с фьюжн-тега добавленной только во время соревнований анализов) и управления лизиса (для цитотоксичности экспериментов).
   3. Привить 5 мл LB морской (MLB) культуру с новой колонии V. parahaemolyticus и расти O / N на 30 ° C, встряхивая.
   4. Подготовьте достаточное бисером сочетании МАМ, как описано в разделе 1. (муфта). Разрешить на 100 мл 10-кратным борта складе на лунку.
2. Конкурс анализ:
   1. На день competitионный эксперимент, измерения ОП ₆₀₀ бактериальной культуры.
   2. Подготовьте инфекции носитель путем разбавления бактериальные культуры в среде DMEM бесцветного без добавок, предварительно нагревают до 37 ° С, содержащей 10% об / об шарик подвеска (либо Адгезин связью шарики или бусины управления), чтобы дать МВД 10. Подготовить 1 мл / хорошо и 10-20% избыточный объем каждого образца. Примечание: Для указанных условий (24-луночного планшета, В. parahaemolyticus, МВД 10), необходимого объема O / N культуры, которые будут добавлены в каждую лунку (мл / мл) рассчитывается как 3 / OD ₆₀₀ культуры. Например, 1 мл среды инфекции, как правило, содержат 100 мл шарик подвеска, несколько мл бактериальной культуры и быть сделано до 1 мл бесцветной, без добавок DMEM.
   3. Удалить старую среду из лунок и промыть культивируемые клетки HeLa путем добавления 1 мл стерильной PBS, предварительно нагревают до 37 ° С в каждую лунку.
   4. Удалить PBS и добавить 1 мл среды инфекции на лунку. Также настроен управления, добавив решения продолжениеAining контрольные шарики и бактерии (положительный контроль) или адгезина бусы и отсутствие бактерий (отрицательный контроль), или DMEM, содержащей 0,1% Тритон Х-100 (контроль лизиса, необходимую только для измерений цитотоксичность).
   5. Инкубируйте планшет в инкубаторе тканевых культур при 37 ° С в течение требуемого периода времени (например, 4 ч для измерения цитотоксичности или 1 ч в течение измерений адгезии).
      Примечание: Оба бактериальной адгезии и цитотоксичность на клетках-хозяевах могут быть использованы в качестве чтения отверстиями для эффективности торможения. Если моменты времени цитотоксичности и адгезии измерений совпадают, оба анализы могут быть выполнены с использованием образцов из той же скважине, так цитотоксичность определяется с использованием культурального супернатанта и крепления анализы использовать образцы, полученные из оставшихся клеток слоя.
3. Измерения цитотоксичности:
   1. В указанных временных точках (например, 4 ч после инфекции), удалить три раза 200 мл каждого из 24-колодец и передачи96-луночного планшета.
   2. Спин 96-луночных планшетах при 1500 х г, 5 мин и передачи 100 мл из каждой лунки в свежем 96-луночного планшета. Добавить 100 мл СМИ, используемых во время инфекции экспериментов в свежих скважин 96-луночного планшета в трех экземплярах (это будет использоваться в качестве заготовок).
   3. Провести лактатдегидрогеназы (ЛДГ) выпуск анализа, используя набор обнаружения ЛДГ цитотоксичности и, следуя инструкциям изготовителя.
      1. Вкратце, рассчитать количество реагента, необходимое шагом 25 (например, если 62 образцов должны быть измерены, составляют достаточно смесь реагентов для 75 и т.д.).
      2. Например, для 100 образцов, смешать 11.25 мл реагента А с 250 мкл реагента Б. инвертировать, не вихрь, чтобы избежать пенообразования.
      3. Поместите смесь в резервуаре, чтобы иметь возможность пипетки с пипеткой многоканальной. Добавить 100 мкл смеси реагентов к каждому образцу.
      4. Инкубируйте пластины при комнатной температуре и читать оптическую плотность при 490 нм на планшет-ридере при 10, 20, 30 мин. Анализ набора данных, для которых поглощение контрольного образца лизиса высока, но все еще в пределах линейного диапазона ридере (обычно 2-3 единиц оптической плотности).
      5. Экспресс результаты в виде% цитотоксичности, используя следующую формулу для преобразования:
         
4. Измерение бактериальной адгезии:
   1. В указанных временных точках (например, 1 час после инфекции), удалить носитель из слоя клеток.
   2. Тщательно промыть слой клеток стерильной, подогретого PBS (по крайней мере, 3-4 промывками 1 мл PBS каждый), чтобы удалить любые не-присоединены клетки.
   3. Хост Lyse клеток путем добавления 1 мл стерильной 1% объем / объем Triton X-100 в PBS раствора на лунку. Инкубируют планшет при 37 ° С в течение 5 мин.
   4. Внесите каждый образец вверх и вниз несколько раз перед передачей содержимого каждой лунки, чтобы отделить 1,5 мл трубки. Готовят 10-кратным серийных разведений образцовв стерильной PBS (например, использовать 100 мл образца и 900 мл PBS).
   5. Тарелка 100 мл каждого образца на MLB агар и распространение с помощью мобильного разбрасыватель. Оптимизация, которая разведений к пластине в зависимости от бактериальных штаммов и момент времени. Примечание: Для описанной экспериментальной установки, 10 ⁵ или 10 ⁶ разведения сгиба дать подходящее количество КОЕ.
   6. Планшеты инкубируют при 37 ° CO / N и перечислить бактерии путем подсчета колоний.

Результаты

Имени В. parahaemolyticus адгезин MAM7 содержит семь тандемных млекопитающих запись клеток (MCE) домены, участвующие в признании хозяин поверхностных рецепторов. Мы использовали полистирольные шарики в сочетании с рекомбинантным, очищенные фрагменты охватывая собой все семь тандем MCE домены (MAM7) или только домена первого MCE (MAM1), чтобы проверить способность этих материалов, чтобы конкурировать с V. parahaemolyticus для клетки-хозяина связывания и в результате эффективность этих материалов в качестве ингибиторов адгезии. Клеток HeLa были инфицированы V. parahaemolyticus штамм POR1 и цитотоксичность в результате инфекции в пробирке оценивали после 4 часов (рисунок 3). Лечение клеток HeLa с 0,1% Triton X-100 (положительный контроль лизиса) привело к полному лизису клеток, неинфицированных клеток отображается очень низкие уровни цитотоксичности. В пробирке инфекции необработанных клеток с POR1 в результате очень высоких уровней клеточного лизиса, и это ингибируется MAM7-COupled бусы, но не MAM1 связью или GST-связанных шариков управления (Рисунок 3).

Рисунок 3. Характеристика Vibrio parahaemolyticus индуцированную цитотоксичность в эпителиальных клетках в течение конкурентных анализах. Клетки обрабатывали В. parahaemolyticus (VP), обозначается (+) или не бактерии (-) в присутствии различных конкурирующих субъектов (. комп), как не указано. Они не включены либо не комп. (-), Бисер (MAM7 MAM7), бисер (MAM1 MAM1) или управления GST шарики (GST). В качестве контроля, клетки обрабатывали либо с Triton X-100 (Triton, управления лизиса), или влево неинфицированных (uninf). ЛДГ релиз после 4 ч измеряли, как описано в разделе 3, а результаты нормализованы с контрольными Triton (100%) и заготовок (0%), как описано выше. Результаты средства ± SEM от трех повторностей опытов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Перечень V. parahaemolyticus прикреплен к либо необработанных клеток HeLa, или клеток, инкубированных с MAM7-, MAM1- или контроля GST бисером, показали, что MAM7 бусы, но не MAM1- или GST- шарики управления вытеснять В. parahaemolyticus для прикрепления к принимающей рецепторы клеточной поверхности (рис 4).

Рисунок 4. Характеристика прикрепление бактерий во сравнительных экспериментах. Hela клетки инфицировали В. parahaemolyticus POR2 (Ур +), при отсутствии (-) или наличие конкурирующих субъектов следующим образом: MAM7 шарики (MAM7), бисер (MAM1 MAM1) или управления GST шарики (GST), (ср.). Бактериальной адгезии измеряли через 1 час, а описано в разделе 3. Результаты средством ± SEM из трех параллельных экспериментов. Средства (FLTR в КОЕ / мл) 2,3010 ^6, 1,5310 ^{5, 6} 2,0510, 2,1210 ^6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Адгезины сочетании с флуорофорных помечены бисером привести в поколение материалов, которые имитируют адгезию бактерий к клеткам-хозяевам и мощные инструменты для визуализации клетки (рис 5). Использование MAM7 связью люминесцентные синие шарики, мы охарактеризовали процесс MAM7-опосредованной привязанность к эпителиальных клеток. Крепление MAM7 к клеткам-хозяевам в результате перестройки актина и формирование стресс-фибрилл, которые были совместно визуализированы с помощью родамин-фаллоидина окрасить для F-актина (рис 5B).

_upload / 53400 / 53400fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Подготовка и использование флюорофора помечены биомиметических шарики для целей визуализации. (А) Подвеска люминесцентных синих шариков биомиметических (справа трубки, 10x акций) и буфер управления (левая труба). (Б) Присоединение MAM7-связанных шариков в Хеле клетки приводит актина перестановок и формирования стресс волокна. Приложение люминесцентных синих бус и в результате актина стресс волокна (красные, с пятнами родамина-фаллоидином) были обследованы с помощью микроскопии. Бар, 10 мкм. Изображения в панели B были адаптированы из Лим и др. ¹ и воспроизводится в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Здесь мы описываем два протокола, которые могут быть использованы для соединения тиолсодержащих белков аминов или карбоновых кислот, модифицированный полистирольных шариков, соответственно. Благодаря легкости процедуры, соединительный тиол-амин является предпочтительным, но в зависимости от желаемой спецификации шарик (диаметр, свойства флуоресценции), использование аминных функционализированных шариков не может быть возможным, и мы поэтому включены протокол, который будет преобразовывать карбоксилат - в остатке амина, чтобы дать исследователю максимальную гибкость в выборе эшафот. Хотя оба тиол-амин и тиол-карбоксильной муфты работа для любого цистеина, содержащего белок, направленное сцепление (то есть, иммобилизация белка на его N-конце, имитируя поверхность дисплея) требует белка без цистеиновых остатков, которые получают в виде GST синтеза белок, или который содержит один терминал остаток цистеина введен сайт-направленного мутагенеза. Если несколько реактивных цистеина содержитсяв белке, это приведет к случайным иммобилизации, которые могут препятствовать функции белка. Многие бактериальные Адгезины не содержат цистеина, естественно. Для других они могут быть удалены с помощью сайт-направленного мутагенеза, хотя это потребует обширных анализов для обеспечения естественной структурой и функцией, сохраняются в мутанте. Для слитых белков GST, очищенный GST-метка в сочетании с гранулами можно использовать в качестве подходящего отрицательного контроля. Используя несвязанных бусы в качестве контроля следует избегать, так как они часто имеют более высокую склонность к комкованию или присоединиться к клеток неспецифически. Упрощенный вариант протокола 1,2., Используя только EDC, может быть использован для соединения с карбоксильными белков функционализированных полимерных гранул, однако в этом случае муфта проходит через первичные амины в белке, и поэтому не гарантирует направленного муфту.

ТСЕР в качестве восстанавливающего агента, не должны быть заменены другими коммерчески доступными и обычно используемых восстанавливающих агентов, таких как dithiothreitol (ДТТ) или 2-меркаптоэтанол (ВМЕ), ​​как тиолы, содержащиеся в них будет конкурировать с связывающих белки в тиол-малеимид стадии конденсации. PBS может быть заменен другими буферами, но с учетом следующих соображений: Буферы могут не содержать первичные амины (так Трис-буферы, содержащие не подходят). Использование буферов, содержащих очень низкие (<10 мм) концентрации соли приводит к борту комков, а также следует избегать. Чистота Белок является также важным фактором во время этой процедуры, и для достижения высококачественных данных, чистые белки должны быть использованы. Мы регулярно очистки белков в несколько стадий, в том числе по меньшей мере на этапе аффинной очистки и гель-фильтрации, но в некоторых случаях ионообменной хроматографии, как это делается на третьей стадии. В результате чистота белков, используемых для соединения, как правило, 90% или выше, о чем судили по SDS-PAGE.

Рекомендуется для определения концентрации белка и в исходном реакционной смеси, а также гое супернатант после завершения реакции. Это поможет определить кажущуюся концентрацию шарик связью белка, и, следовательно, плотность сцепления. Определение обоих значений также позволит Расчет эффективности связи. Это может быть принято во внимание при подготовке исходного раствора белка в последующих реакциях, чтобы достичь желаемой конечной концентрации, и соединительный плотность. Брэдфорд реагент особенно подходит для определения концентрации белка до и после реакции сочетания, поскольку ни один из веществ в реакции не мешает образованию комплекса красителя в концентрациях, используемых. Если более низкие концентрации белка, которые будут использоваться, этот метод может должны быть заменены более чувствительный метод обнаружения, однако внимание следует обратить на то, что должен быть совместим с веществами, содержащимися в реакции сочетания. Также рекомендуется использовать свежеприготовленные реагенты и обрабатывать порошкообразные реагенты с осторожностью (например, магазинв герметичном контейнере и использовать шарики кремнезема, чтобы избежать реагенты извлекает влагу), так как качество реагентов будут влиять на эффективность связывания. Если эффективность сочетания ниже, чем ожидалось, возможные способы устранения включают в себя увеличение начальных шарик и концентрации протеина. Если используются более высокие концентрации, концентрация реагентов сочетания должна быть увеличена пропорционально, чтобы обеспечить достаточную молярного избытка. Изменение концентрации шарик / белок, как правило, лучше шаг к оптимизации, а не увеличения времени реакции. Поскольку протоколы борта связи являются длительными, мы обычно готовят крупную партию материала. Аликвоты суспензии можно быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -20 ° С в течение нескольких месяцев. Размороженные аликвоты не следует замораживать и должны храниться при температуре 4 ° С и использовали в течение 1-2 дней. Однако, это будет варьироваться в зависимости от характера и стабильности белка, используемого в качестве должны быть проверены на небольшой партии изначально.

бисера-сочетании Адгезины могут быть использованы для многих приложений, как описано ниже. Этот протокол описан анализ, который обычно используется для измерения ингибирования бактериального связывания и патогенных опосредованной цитотоксичности на клетках-хозяевах. Анализ обычно проводится для измерения потенциала борта связью MAMS конкурентно ингибировать инфекцию Hela эпителиальных клеток с морской пищевыми патогена Vibrio parahaemolyticus, с использованием либо уменьшение прикрепление бактерий к клеткам-хозяевам или уменьшить цитотоксичность в считывани , В обоих случаях, подготовка и конкуренции анализы следовать тот же протокол. В зависимости от считывания, различные штаммы V. parahaemolyticus используются: цитотоксическое напряжение POR1 используется для измерения цитотоксичности, в то время как не-цитотоксических штамм POR2 используется для измерения адгезии бактерий, так как гибель клеток и клеток отряд компрометирует процедуру количественного прикрепленные бактерии.

Первоначально Compeренции были поставлены опыты в ступенчатом протокола, где клетки-хозяева были сначала предварительно инкубировали с бусами перед добавлением бактерий. Для В. parahaemolyticus и спецификации шарик используемые (2 мкм шарики, соединенные с MAM7), оба шарики и бактерии могут быть добавлены одновременно без изменений в результате цитотоксичности. Т.е., в этом экспериментальной установки, шарики вытеснить бактерии для связывания клетка-хозяин. В зависимости от геометрии видов бактерий и шарик, используемой, может быть хорошие причины для поддержания адгезии шарик и бактериальную инфекцию, как две отдельные стадии. Например, чтобы инфицировать клетки с неподвижных бактерий, пластины обычно центрифугировали после добавления инфекции сред. Тем не менее, центрифугирование чашках, содержащих шарик суспензии следует избегать, так как это приводит к весьма неравномерного распределения шариков на клеточный слой. Если используются меньшие размеры частиц, бусы займет больше времени, чтобы поселиться на поверхности клеток, в этом случае суfficient время должно быть разрешено для крепления борта до заражения. При бактериальной адгезии используют в качестве считывать, образцы должны быть приняты в моменты времени, когда клетки-хозяева, существенно не повреждены заражение штаммом, а открепления клеток и лизиса может поставить под угрозу количественное прикрепленных бактерий.

Вместо перечисления адгезию бактерий разрежающим покрытия, образцы альтернативно может быть обработан для получения изображений (рисунок 5). В этом случае культуры тканей должно быть высевали стекла покровные стекла, а не непосредственно в лунки. Кроме того, могут быть использованы флуоресцентные шарики и бактерии, экспрессирующие флуоресцентный белок, наряду с инфекцией специфических маркеров клеток-хозяев. Например, конкуренция эксперименты обычно изображается с помощью флуоресцентного красного родамин-фаллоидина окрасить актина цитоскелета клетки-хозяева "The и оценить морфологические изменения, обусловленные инфекцией, вместе с люминесцентными синий бисер и люминесцентныезеленый (GFP выражения или SYTO18 окрашенных) бактерии.

Диапазон борта связью адгезинов, в том числе золотистый стафилококк FnBPA, Streptococcus Пирролидонилпептидаза F1 FUD и Vibrio parahaemolyticus МАМ, были использованы в качестве биомиметических материалов для изучения адгезии, торможение прилипания и вклад адгезии к патоген-опосредованной цитотоксичности ^{1, 7, 8.} Одним из преимуществ использования такого подхода является простота визуализации событий крепления, так как полимерные гранулы, используемые в качестве строительных лесов доступны в широком диапазоне цветов (например, синего, красного флуоресцентного, синий, зеленый, оранжевый). Таким образом, маркировка прямой белок, который может помешать функции, можно избежать. Кроме того, поверхность муфты имитирует поливалентный отображение адгезинов на бактериальной поверхности, таким образом, отражает более физиологически соответствующие конформации по сравнению с растворимых белков.

По сравнению с использованием неповрежденных исследований бактерии или bacteriаль-мутанты, подход шарик обходит проблемы, связанные с бактериального роста. Например, долгосрочные (например, O / N), исследования бактериальной адгезии к клеткам-хозяевам, используя нетронутыми бактерии часто скомпрометирована явлений, сопровождающих рост бактерий - подкисление истощения среднего роста и питательных веществ негативно влияет на клетки-хозяева и бактериальные репликации в конечном итоге ставит под угрозу качество изображения.

Совсем недавно, использование бортовых связью адгезинов была расширена, чтобы включить их использование в качестве инструмента для аффинной очисток принимающих сотовой факторов, участвующих в процессах ниже по течению бактериального прикрепления сигнализации. В. parahaemolyticus MAM7, путем связывания с фосфатидные кислоты в клетке-хозяине мембраны, вызывает RhoA активацию и актина перестановки ^{1, 3.} МАМ связью шарики, которые используются для очистки и идентификации белков, участвующих в платформах сигнальных собранных в результате МАМ-клетки-хозяина связывания. Так шарики могутлегко отделить от супернатанта стадией короткого центрифугирования, и интересующий белок ковалентно связан, это хороший способ для достижения отделение от примесей белков и обогащать соответствующие белковые комплексы, которые могут быть использованы для последующих применений, таких как протеомики или Западной истребив учением бывшее о.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагенты
Трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP)	Sigma	646547	Danger; коррозионный можно купить в виде раствора или свежеприготовленного
Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)бутират (Sulfo-SMPB)	Fisher	PN22317	Danger; токсичный
L-цистеин	Sigma	30089	Danger; токсичный
Латексные шарики, аминомодифицированный полистирол, флуоресцентный синий - водная суспензия, 2,0  μ m средний размер частиц	Sigma	L0280	вреден; доступен ряд альтернативных размеров частиц и цветов
1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC)	Thermo scientific	22980
N-гидроксисукцинимид (NHS)	Thermo scientific	24500
Карбоксилат-модифицированные гранулы полистирола	Sigma	CLB9	вредные; доступен ряд альтернативных размеров и цветов частиц
этилендиамин	Sigma	E26266	Опасность; легковоспламеняющийся, коррозионный, токсичный, сенсибилизирующий
бычий сывороточный альбумин (BSA)	Promega	W3841
Bradford реактив	Sigma	B6916	Опасность; коррозионный и токсичный
Дульбекко s Модифицированный Eagle' s Средний - высокий уровень глюкозы - с содержанием глюкозы 4 500 мг/л и бикарбоната натрия, без; L-глутамин, пируват натрия и фенол красный, жидкий, стерильно-фильтрованный, подходит для клеточной культуры	Sigma	D1145	для экспериментов по инфекции
DMEM	Sigma	D6429	для поддержания культивируемых клеток хозяина
Фетальная бычья сыворотка, тепло инактивированная	Sigma	F9665	для среды для тканевых культур
Пенициллин-стрептомицин - Раствор стабилизированный, с 10 000 единиц пенициллина и 10  мг стрептомицина/мл, стерильно-фильтрованный, биореагент, подходит для клеточных культур	Sigma	F9665	добавка для среды для тканевых культур
PBS	Sigma	D8537
LDH Набор для детектирования цитотоксичности	Takara	MK401
Plasticware
резервуары для реагентов (25 мл)	SLS	F267660
24-луночные планшеты	Greiner	662160
96-луночные планшеты	Greiner	655182
Оборудование
гемоцитометр
микроцентрифуга
планшет считыватель
тканей оборудование для культивирования			тканей
многоканальный пипетка