Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Porphyromonas gingivalis в качестве модельного организма для оценки интерактивности анаэробных бактерий с клеток-хозяев

25.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53408

⸱

17 декабря 2015 г.

 , 
1Philips Institute for Oral Health Research, Virginia Commonwealth University, 2Department of Microbiology and Immunology, Virginia Commonwealth University, 3Department of Biochemistry, Virginia Commonwealth University

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье представлены два протокола: один для измерения анаэробных бактерий, которые могут успешно вторгаться и выживать внутри хозяина, а другой для визуализации взаимодействия анаэробных бактерий с клетками хозяина. Это исследование может быть применено к любому культивируемому анаэробу и любому типу эукариотических клеток.

Аннотация

Анаэробные бактерии гораздо больше, чем аэробов во многих нишах человека, таких как кишечника, полости рта, влагалища и. Кроме того, анаэробные инфекции являются общими и часто из числа коренного населения. Способность некоторых анаэробных патогенных микроорганизмов к вторжению клетки человека дает им адаптивные меры побега врожденный иммунитет, а также модулируют поведение клеток-хозяев. Однако, убедившись, что анаэробные бактерии живут при экспериментальном исследовании событий может создать проблемы. Porphyromonas gingivalis, грамотрицательные анаэробы, способен вторжения различные эукариотических без фагоцитирующих клеток. В этой статье описывается, как успешно культура и оценить способность P. gingivalis вторгнуться пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVECs). Были разработаны два протокола: один для измерения бактерии, которые могут успешно вторжения и выжить в хосте, а другой для визуализации бактерий, взаимодействующих с клетками-хозяевами. Эти методы требуют использования в anaeРобик камера для подачи P. gingivalis с анаэробной среде для оптимального роста.

Первый протокол основан на анализе антибактериальной защиты, которая в значительной степени используется для изучения вторжение клеток-хозяев бактериями. Тем не менее, антибиотик анализ защита ограничена; только внутриклеточные бактерии, которые культивируемых после лечения антибиотиками и клетки-хозяина лизиса измерить. Для оценки всех бактерий, взаимодействующих с клетками-хозяевами, и живых и мертвых, мы разработали протокол, который использует флуоресцентной микроскопии для изучения хозяин-патоген взаимодействия. Бактерии флуоресцентно меченных с 2 ', 7'-бис- (2-карбоксиэтил) -5- (и-6) -carboxyfluorescein ацетоксиметил эфир (BCECF-AM) и использовали для инфицирования эукариотических клеток в анаэробных условиях. После фиксации с параформальдегидом и проницаемости с 0,2% Triton X-100, клетки-хозяева помечены TRITC фаллоидином и DAPI для обозначения клеток цитоскелета и ядра, соответственно. Несколько ИМАГЭС, принятые на различных координационных центров (Z-стека) получены для височно-пространственной визуализации бактерий. Методы, используемые в данном исследовании, могут быть применены к любому обрабатываемой анаэробной и любой эукариотической типа клеток.

Введение

Анаэробные бактерии колонизируют практически все поверхности человеческого тела. Хотя преобладает в флоры кишечной и мочеполовой путей, где концентрация кислорода низка, они также существуют на высоких уровнях на коже, во рту, носу, горле и 1. Анаэробные бактерии являются частой причиной эндогенных инфекций и часто изолированы от больных сайтов. Тем не менее, из-за их разборчивого природы, анаэробы может быть трудно выделить и культивировать. Исследования с участием анаэробных бактерий должно быть сделано в ограниченных условиях. Современные методы анаэробной-культуры позволяют исследователям имитировать настройки анаэробные, необходимые для изучения многих анаэробных лабораторных штаммов или клинических изолятов даже 2,3.

Патогенные бактерии анаэробные разработала динамичные отношения и сотрудничество с эволюцией клеток-хозяев, в которых они проживают. Большинство анаэробов чувствительны к убийству принимающей иммунного ответа до достижения infectiленные уровни. Тем не менее, некоторые патогенные бактерии выработали механизмы эвакуации из или подорвать иммунного ответа. Они достичь этой цели с помощью таких механизмов, как уклонение от иммунного распознавания, обезвреживания иммунных медиаторов, изменения клеточного иммунитета, вторжения клеток-хозяев, и изменения иммунных сигнализации 4. Porphyromonas gingivalis, грамотрицательная анаэробные причастны как в устной и внеротовые заболевания, Одним из примеров весьма адаптированной бактериальным патогеном, способной вызвать патогенные изменения в организме хозяина 5-7.

Карманы биопленки налета начисленные в глубоких трещинах, образующихся между зубами и десневой ткани слизистой оболочки может питать анаэробные бактерии, которые защищены от атмосферного кислорода 8. Эти зубодесневых карманов служить нишей для различных анаэробных патогенных микроорганизмов, таких как P. gingivalis 9. П. gingivalis является краеугольным камнем патоген, который способен переделыватьING устное микробное сообщество в целях содействия развитию и прогрессирования заболеваний пародонта 10. Это производит большое количество факторов вирулентности, которые активны в отношении широкого спектра хозяев, и белками обеспечивает механизмы для уклонения от защитных сил организма 11. Он также способен вторжения эпителиальные, эндотелиальные, фибробластов и клеток периодонтальной связки в пробирке 12-14 и в естественных условиях 15. Эффективно вторжения клеток-хозяев, Р. gingivalis может избежать иммунитет хозяина. Эффективное вторжение клетках-хозяевах позволяет не только бактерии, чтобы избежать защитные силы организма, но также служит в качестве резервуара для будущего повторной инфекции, а также изменяет клетки-хозяина. Исследования молекулярных механизмов, участвующих в адгезии и интернализации бактерии клетками-хозяевами необходимы. Исследования в нескольких лабораториях ориентирована на понимание молекулярных событий, связанных с интернализации P. gingivalis клетками-хозяевамиа также механизмов, используемых для подавления и захватить иммунный ответ и выжить враждебных защитными механизмами.

Есть много анализы, способные идентификации и характеристике патогенов, которые способны вторжения клеток-хозяев. Тем не менее, исследования в пробирке с анаэробных патогенов представляют многие экспериментальные проблемы для исследователя главным образом, потому что это трудно выполнить исследования, которые полагаются на громоздких инструментов в отсутствие кислорода. Это усугубляется тем, что эукариотические клетки требуют кислорода для роста и, следовательно, должны быть получены отдельно в культуре ткани инкубатора. Один из способов избежать таких препятствий будет проводить исследования под атмосферным кислородом, но, что бы сделать рост анаэробных бактерий невозможно. Другой способ заключается в использовании тепла убитых бактерий, чтобы заразить и изучить хост-клеточные взаимодействия. Тем не менее, существуют различия между тепловыми убитых и жизнеспособных бактерий, которые уменьшают релевантность хозяин-патоген interacti16. Это центральный учиться жизнеспособные бактерии с неизмененной выражения, взаимодействующего с клетками-хозяевами; Следовательно, способы культивирования P. для gingivalis в обстановке анаэробного даны. Кроме того, две простые рентабельные протоколы продемонстрировано оценки способности P. gingivalis быть усвоены пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVECs). Первый протокол основан на популярной антибиотиками анализа защиты. Хотя анализ прост, соображения при использовании анаэробных микроорганизмов приведены. Второй протокол требует использования флуоресцентного сканирующего микроскопа визуализировать взаимодействие и внутреннюю P. gingivalis. Каждый метод имеет свои ограничения и преимущества, которые будут обсуждаться, чтобы обеспечить исследователю план для изучения инвазивность анаэробных бактерий. Хотя в настоящее время рукопись изучает Р. gingivalis и HUVECs, эти протоколы могут быть использованы для многих других анаэробных бактерий, а такжеа для других типов клеток-хозяев.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Следующие протоколы будут описаны методы культивирования и изучения вторжение анаэробных видов, P. gingivalis; Однако, эти протоколы могут быть использованы для ряда анаэробных патогенных микроорганизмов. Хотя HUVECs используют этот протокол может быть использован для других эукариотических клетках и иммунных и неиммунных.

1. Анаэробный палата эксплуатации и техническому обслуживанию

Примечание: П. gingivalis является анаэробной чувствительны к нормальным уровнем кислорода, встречающихся в окружающем воздухе. Контролируемая анаэробная среда имеет жизненно важное значение для выращивания Р. gingivalis.

  1. Здесь поддерживать искусственно созданной атмосфере, обозначенный как смешанной анаэробной газа (80% N 2, 10% Н 2, 10% CO 2) в анаэробной камере винил (1А). Используйте шлюз (рис 1B) для передачи элементов из лабораторной среде с анаэробной камере. Шлюз работает вручную, застегиваетсялед продувка N 2 газа до введения смешанной анаэробной газ.
  2. Использование колонны для удаления сероводорода (рис 1c) для необслуживаемых удаления нежелательного сероводорода. Поставьте осушитель в камере для удаления H 2 O, созданный катализатора и, чтобы избежать аэрозолей, которые способствуют распространению загрязнения.
    Примечание: Сероводород является естественным метаболическим побочным продуктом многих анаэробных бактерий и его накопление является токсичным для бактерий и может привести к повреждению электроники и уменьшить срок службы катализатора.
  3. Использование блок вентилятора для циркуляции атмосферы камеры через палладиевого катализатора, который удаляет кислород в присутствии водорода (рис 1D).
    Примечание: рециркуляции атмосферное (НЕРА) фильтр удаляет загрязняющие вещества в воздухе с размером 0,22 мкм или больше.
  4. Культура анаэробные бактерии в 37 ° C инкубатора, который находится внутри анаэробныхкамера. Используйте стандартные асептических при работе внутри анаэробной камере.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Анаэробный винил камера и ее компонентов. (A) винил анаэробной камере запечатаны полностью из атмосферного кислорода обеспечивает рабочее пространство для двух лиц, в то время (32 х 78 в). Он содержит инкубатор при 37 ° С (задней средней). (Б) шлюз используется для передачи предметов из лабораторной среды в анаэробной камере. Изображенный автоматический воздушный шлюз работает через контроллер, который может быть запрограммирован на автоматическое выполнение вакуума и продувки процедуры, необходимые для создания анаэробной среде. (C) Сероводород удаления Колонка обеспечивает обслуживание без снятия с высокой пропускной способностью нежелательного сероводорода. (D) Две коробки катализатора вентиляторовустановленных по всему анаэробной камере, чтобы помочь распространить атмосферу камере через палладиевого катализатора, который в присутствии водорода, кислорода удаляет. Анаэробная камера устанавливается в соответствии с инструкциями изготовителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. Подготовка анаэробных бактерий

Примечание: P. gingivalis это aerotolerant и могут быть сохранены в аэробных условиях, но это не будет расти в присутствии кислорода при более высоких уровнях, чем 6% 17,18. Анаэробной камере необходимо для правильного выращивания P. gingivalis и другие анаэробные виды (рисунок 1). Правильное обучение и образование на анаэробного использования камеры требуется перед началом работы с microanaerobes 19.

  1. Равновесие все жидкие среды и пластины в анаэробных Conditионы, по крайней мере 12 часов до эксперимента, чтобы удалить остаточный кислород.
  2. Перевести P. gingivalis от -80 ° C морозильной камеры анаэробной камере, пусть оттепель.
  3. П. подряд gingivalis на Trypticase агар сои в крови пластин (TSA II с 5% овечьей крови). Обертка пластин в парафином и хранить при температуре 37 ° С в анаэробной инкубаторе в течение 4-7 дней.
  4. Привить P. gingivalis в 3 мл мозга сердца инфузии (BHI) бульоне с добавлением гемина и менадиона, обогащенных неселективных жидких сред для выделения и культуры анаэробных микроорганизмов и прихотливых, используя стерильные петли.
    Примечание: Для долгосрочного хранения, смешивания бактериальные культуры, приготовленные в BHI с глицерином или ДМСО (10-20% конечная концентрация) и место в -80 ° C морозильнике.
  5. Подготовьте стартера культуры P. gingivalis, делая разведение 1:10 и позволяя бактериям расти до середины логарифмической фазы.

Примечание: оптическую плотность бактерийриал подвески определяется и концентрация бактерий для каждого штамма должны быть рассмотрены регулируется. Для P. gingivalis подвеска на ОД 660 0,7 соответствует фазе середины журнала и ~ 7 х 10 8 клеток / мл. Условия роста, описанные в протоколе выше специфичны для P. gingivalis и, возможно, потребуется адаптировать для других бактериальных штаммов.

3. Культура клеток эндотелия

Примечание: Покупка объединяли первичных HUVECs и культуры в базальной среде, содержащей сосудистые эндотелиальные факторы роста (VEGF) при 37 ° С в 5% СО 2 в соответствии с инструкциями изготовителя.

  1. Семенной HUVECs в Т-75 колб на 2,5 х 10 5 клеток / колбу в 15 мл VEGF СМИ.
    Примечание: Проверка жизнеспособности с помощью разведении 1: 1 с 4,0% трипанового синего. Клетки с ослабленной мембраны сохранит трипановым синим, здоровые клетки с интактными мембран появится белый, если смотреть под световым микроскопом бинокулярного. СтраT 100 клеток, гарантировать, что более 80% клеток являются жизнеспособными 20.
  2. Заменить массовой информации каждые 2 дня с подогретого свежего VEGF СМИ, пока клетки достичь ~ 80% слияния.
  3. Вымойте клеток один раз подогретого PBS. Освободить клетки из Т75 колбы путем инкубации 2 мл трипсина-ЭДТА (0,25%) в течение 5 мин, после чего 2 мл раствора трипсина нейтрализующего.
  4. Соберите взвешенных HUVECs в 50 мл коническую трубку. Промойте каких-либо дополнительных клеток Т-75 колб с PBS и трансфер в 50 мл конические пробирки.
  5. Центрифуга клетки при 200 мкг в течение 10 мин.
  6. Удалить супернатант, приостановить осадок клеток в 10 мл подогретого VEGF средств массовой информации.
  7. Определить концентрацию клеток с помощью гемоцитометра или аналогичный подсчета клеток устройство.
  8. Рассчитать количество суспензии клеток, чтобы добавить либо 6-луночного планшета (400000 / лунку) или 12-луночный планшет с покровные (50000 / лунку). HUVECs будет готов к экспериментам на следующий день.

4. Выживание Анализ Вторжение / Взаимодействие(Покрытие)

Примечание: При выполнении этого теста, приготовить две 6-луночные планшеты эндотелиальных клеток, посеянных на 400000 клеток / лунку. Одна пластина будет использоваться для оценки бактерии, прикрепленные к и внутреннюю клетками-хозяевами. Другой пластины будет составлять внутриклеточных бактерий. Пластина 6-а позволяет трижды двух образцов должны быть выполнены в одном эксперименте. Для набросок этого протокола обратитесь к блок-схеме анализа выживаемости (рис 2).

  1. Подготовка анаэробные бактерии, как описано выше (см раздел 1), пока они не достигнут рост среднего журнала (OD 660 0,5-0,7).
  2. Центрифуга бактерии в 5000 мкг в течение 10 мин.
    Примечание: Если центрифуга вне анаэробной камере, носить бактериальных образцов в плотно закрытой 15 мл трубки, заверните крышку с парафином, чтобы предотвратить утечку кислорода.
  3. Поместите гранулированный P. gingivalis назад в камеру, отбросить супернатант. Промыть PBS, пеллетные бактерии снова перед ресуспендированием в VEGF менядиаметр Подготовка суспензии для всех штаммов бактерий, которые будут испытаны на OD 660 0,7, что соответствует фазе середины логарифмического (~ 7 х 10 8 клеток / мл). Бактерии готовы к инфекции.
  4. Передача 6-луночные планшеты, содержащие от HUVECs инкубаторе тканевых культур в анаэробной камере. Удалить СМИ и мыть три раза PBS с анаэробным. Добавляют 2 мл анаэробной VEGF сред в каждую лунку и поместить пластин при 37 ° С в анаэробной инкубаторе в течение 20 мин, чтобы уравновесить температуру инфекции.
    Примечание: Пластинчатые бактерий на чашках с кровяным агаром, чтобы обеспечить те, используемые для инфекции являются однородной и не загрязнены на инфекции.
  5. Инфицирования клеток-хозяев с бактериями при множественности инфекции (МВД бактерии: хостов) на 100: 1.
    Примечание: ЭКПВЧ количество клеток определяется путем проведения трипановый тест исключения на одной скважине до заражения. Бактериальный количество клеток определяли с помощью как оптической плотности (например, OD 0,5 = 5 х 10 8 клеток / мл). Вacterial концентрации доводили до правильного МВД на основании концентрации HUVECs 21.
  6. Поместите 6-луночных планшетах с инфицированными HUVECs в анаэробной инкубатора и позволяют бактерии взаимодействуют с клетками-хозяевами в течение 30 мин.
  7. Подготовьте сапонин в BHI (1,0% вес / объем) внутри анаэробной камере и фильтруют через фильтр 0,2 мкм.
  8. Выживание обоих подключенных и усвоенных бактерий.
    1. Удалить пластины из инкубатора, аспирация средств массовой информации, мыть три раза PBS с анаэробным и добавить 2 мл 1,0% фильтруют сапонин (полученный, как описано на стадии 4.8). Выдержите в течение 15 мин, чтобы позволить хост лизис клеток.
    2. Собрать дно каждой лунки с клеточным скребком. Собирают смесь клеток из каждой лунки и сделать 1: 1 разбавление в BHI.
    3. Продолжить, чтобы серийные разведения образца. В зависимости от вида бактерий и концентрации, настроить серийные разведения. Начните с 1: 100 или 1: 1000 разведения.
    4. Пластина 200 мкл требуемой концентрации по чашках с кровяным агаром. Оберните тон пластины парафильмом и место в анаэробной инкубаторе при 37 ° C.
    5. После семи дней инкубации при 37 ° C, снимите тарелки и рассчитывать колониеобразующих единиц (КОЕ), используя световой короб вручную рассчитывать колонии.
      Примечание: КОЕ перечислены. Для больших количеств КОЕ изображения могут быть приняты и программное обеспечение может быть использовано для облегчения перечисление КОЕ.
  9. Выживание интернализованных бактерий.
    1. Удалить пластины из инкубатора. Промыть три раза PBS с анаэробным и добавить 2 мл среды с VEGF, дополненной антибиотическим (300 мкг / мл гентамицина и 400 мкг / мл) метронидазола.
    2. Инкубировать в течение 1 часа. Будьте уверены, чтобы проверить антибиотики, чтобы они на 100% эффективен в убийстве нужный бактериальный штамм и убедиться, что они не проникают клетки-хозяева, 22,23.
    3. Аспирируйте СМИ, добавьте 2 мл отфильтрованной 1,0% сапонина. Выдержите в течение 15 мин, чтобы позволить хост лизис клеток.
    4. Очистите дно каждой достл с клеточным скребком. Соберите смесь клеток из каждой лунки и сделать 1: 1 разбавление в BHI.
    5. Готовят серийные разведения образца (1: 100, 1: 1000).
    6. Пластина 200 мкл требуемой концентрации по чашках с кровяным агаром. Оберните пластин в парафильмом и место в анаэробной инкубатора.
    7. После семи дней инкубации при 37 ° C удалить пластины и рассчитывать КОЕ.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Схематическое изображение протокол, используемый для выживания анаэробных бактерий с эукариотических клетках. Оба анализа на общую выживаемости бактерий и выживание бактерий интернализированных могут быть выполнены одновременно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

5. Интернационализация бактерий в хост Сезаполняет (флуоресцентной микроскопии)

Примечание: P. gingivalis помечен 2 ', 7'-бис- (2-карбоксиэтил) -5- (и-6) -Carboxyfluorescein, ацетоксиметил эфир (BCECF-AM). BCECF-AM не является флуоресцентной мембраны проницаемой для красителя; превращение его в флуоресцеина BCECF помощью действием внутриклеточных эстераз может указывать на жизнеспособность клеток. P. gingivalis помечен BCECF-AM красителя, а затем использовали для инфицирования эукариотических клеток. После инфицирования клетки фиксировали и помечены DAPI и TRITC-фаллоидином. DAPI пятно использовали для окрашивания ядра эукариотической клетки также маркировать бактериальной клеточное ядро, которое обеспечивает встречное меру для выявления нежизнеспособных бактерий, которые могут не метаболически скола BCECF-AM. Клетки-хозяева выделены TRITC-фаллоидином, красный актина красителя.

  1. Автоклав покровные. Консерванта добавить покровные в 12-луночные планшеты перед посевом клеток на эндотелиальных 5 х 10 4 клеток / лунку. (Подготовлено день до эксперимента)
  2. У эндотелиальные клетки, приготовленные на 18 мм (# 1,5) толщиной круговые покровные в 12-луночных планшетах, как описано выше.
  3. Подготовка анаэробные бактерии, выращенные в фазе середины журнала (OD 660 = 0,5-0,7), как описано в разделе 1.
  4. Промыть бактерии 2x с анаэробным PBS путем центрифугирования при 5000 х г и суспендирующие осадок в PBS в 5-7 х 10 8 клеток / мл.
  5. Добавить 20 мкл 0,2 мМ BCECF-AM к 2 мл бактериальной суспензии (5-7 х 10 8 клеток / мл) в конечной концентрации BCECF-AM 2 мкм.
  6. Выдержите при 37 ° С в течение 30 мин в темноте.
  7. Передача пластины с эндотелиальных клеток, посеянных на 18 мм (# 1.5 толщина) круговыми покровные из инкубатора культуры тканей в анаэробной камере. Промыть PBS и обмена с анаэробной VEGF СМИ.
    Примечание: Убедитесь, что HUVECs здоровы под световым микроскопом. HUVECs должно быть ~ 80% сливной, морфология должна быть сопоставима с производителями.
  8. Центрифуга помечены бактерии при5000 мкг в течение 10 мин для удаления остаточного BCECF-AM красителя. Приостановить в 2 мл анаэробной VEGF СМИ.
  9. Инфицирования клеток-хозяев с мечеными бактерий при MOI 100: 1 (бактерий: хоста).
  10. Инкубируют в анаэробной камере при 37 ° С в течение 30 мин.
  11. После заражения клеток с мытья три раза PBS, и зафиксировать в свежеприготовленной 4,0% параформальдегидом в течение 10 мин.
    Примечание: После установки клетки, эксперимент может быть проведен вне анаэробной камере.
  12. Промыть покровные ЗФР три раза.
  13. Добавить 1 мл 0,2% Тритон Х-100 в течение 10 мин.
  14. Промыть покровные ЗФР три раза.
  15. Добавить 50 мкл TRITC фаллоидином (50 мкг / мл), чтобы покровные в течение 45 мин.
  16. Вымойте покровные три раза, снять с 12-луночного планшета и место на слайде с мягкой монтажный комплект, содержащий DAPI среды. Печать стороны с лаком для ногтей.
    Примечание: Слайды можно хранить в течение нескольких месяцев в темноте. Избегайте попадания света, чтобы предотвратить фото-отбеливание.
  17. Просмотр слайдовс использованием конфокальной микроскопии.
    1. Здесь используют систему 34 канала спектральной (детектор массива 32-канала и два боковых ГУП детекторы, плюс проходящего света детектор) настроен вокруг AxioObserver (перевернутой) стоять с моторизованным этапе XY. Система имеет пять лазеров: синий диод (405 нм), Многоканальный Аргон (458, 488, 514 нм), зеленый диод (561 нм), красный He-Ne (633 нм) и 440 нм импульсного лазера. Одета пожизненную систему флуоресценции с 2 гибридных детекторов GaAsP (для FRET-FLIM).
    2. Обнаружение флуоресценции от DAPI и TRITC в одном канале с использованием двухдиапазонного фильтр с длинами волн возбуждения 340-380 нм и 540-560 нм, и эмиссионным фильтром 435-485 нм и 570-590 нм соответственно. Обнаружение флуоресценции от BCECF-AM с использованием фильтра с длиной волны возбуждения 440-500 нм и эмиссии фильтра 510-590 нм.
      Примечание: для управления BCECF-AM должны быть сделаны на каждом бактериального штамма изучается, чтобы обеспечить надлежащей маркировки жизнеспособных бактерий. Во-первых проверить, что nonviabле бактерии DAPI-положительных и BCECF-отрицательным. Во-вторых, убедитесь, что живые бактерии могут усваивать BCECF-AM в флуоресцеина BCECF. Переменные концентрации бактерий или BCECF-AM красителя может должны быть проверены для оптимальной маркировки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протоколы, описанные выше, были использованы в изучении хозяин-патоген взаимодействия между P. gingivalis и эндотелиальные клетки. П. gingivalis W83 и П. gingivalis V3150 неся удаление PG0228 были использованы в исследовании. PG0228 прогнозируется кодирует белок, который может изменить уровни РНК и белков, которые могут в конечном итоге влияет взаимодействие P. gingivalis с клетками-хозяевами. Чтобы исследовать влияние на Р. PG0228 , способность родительских штаммов и мутантн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Все вышеперечисленные методы могут быть использованы для разработки конкретных анализов для оценки взаимодействия анаэробных бактерий с эукариотических клетках. Тем не менее, есть несколько соображений, чтобы успешно выполнять эксперименты. Во-первых, являются микробные штаммы быть использованы в исследовании.

Это имеет решающее значение в сравнении с двумя штаммами как анализа выживаемости, а также с помощью анализа микроскопии, что они находятся в аналогичных фазах роста и достичь подобных...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить доктора Хироси Миядзаки, доктора Скотта Хендерсона, доктора Тодда Киттена, доктора Джастина Хатчерсона, доктора Кэтрин Хауреги и Коллина Р. Берри. Эта работа была поддержана грантами NIH NIDCR R01DE016124, R01DE018039 и R01DE023304 J.P. Lewis.

Микроскопия была проведена на кафедре анатомии и нейробиологии микроскопии VCU, частично при финансовой поддержке основного гранта Центра NIH-NINDS (5P30NS047463).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Виниловая анаэробная камера-тип BCoy Лабораторные изделияМодель 2000 инкубатор 
TSA II Trypticase Соевый агар с 5% овечьей крови BBL221261
эндотелиальные клетки пупочной вены человека 10-донорский пулLifeLine TechnologyFC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete KitLifeLine TechnologyLL-0003
TrypKitLifeLineLL-0013
СапонинRiedel-de Haen16109
Гентамицина сульфат солиSigma-AldrichG-1264
МетронидазолSigma-AldrichM-3761
BCECF-AMLifeTechnologiesB1150
TRITC Phalloidin Sigma-AldrichP1951
18 мм Круглые покровные стеклаЭлектронная микроскопия Sciences72222-01
VectaShield Монтажная среда с DAPIVector LaboratoriesH-1200

Ссылки

  1. Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
  2. Willis, A. T. Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
  3. Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J. The anaerobic culture of clinical specimens: a 14-month study. J. Med. Microbiol. 10 (1), 49-61 (1977).
  4. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41 (3), 188-202 (2008).
  5. Mayrand, D., Holt, S. C. Biology of asaccharolytic black-pigmented Bacteroides species. Microbiol. Rev. 52 (1), 134-152 (1988).
  6. Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Life below the gum line: pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (4), 1244-1263 (1998).
  7. Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases. Periodontol. 2000. 5 (1), 78-111 (1994).
  8. Listgarten, M. A. Structure of the microbial flora associated with periodontal health and disease in man. A light and electron microscopic study. J. Periodontol. 47 (1), 1-18 (1976).
  9. Ximénez-Fyvie, L. A., Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Comparison of the microbiota of supra- and subgingival plaque in health and periodontitis. J. Clin. Periodontol. 27 (9), 648-657 (2000).
  10. Darveau, R. P., Hajishengallis, G., Curtis, M. A. Porphyromonas gingivalis as a potential community activist for disease. J. Dent. Res. 91 (9), 816-820 (2012).
  11. Holt, S. C., Kesavalu, L., Walker, S., Genco, C. A. Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontol. 2000. 20 (1), 168-238 (1999).
  12. Lamont, R. J., Yilmaz, öZ. In or out: the invasiveness of oral bacteria. Periodontol. 2000. 30 (1), 61-69 (2002).
  13. Lamont, R. J., et al. Porphyromonas gingivalis invasion of gingival epithelial cells. Infect. Immun. 63 (10), 3878-3885 (1995).
  14. Belton, C. M., Izutsu, K. T., Goodwin, P. C., Park, Y., Lamont, R. J. Fluorescence image analysis of the association between Porphyromonas gingivalis and gingival epithelial cells. Cell. Microbiol. 1 (3), 215-223 (1999).
  15. Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
  16. Kaufmann, S. H. Immunity to intracellular bacteria. Annu. Rev. Immunol. 11 (1), 129-163 (1993).
  17. Diaz, P., Rogers, A. The effect of oxygen on the growth and physiology of Porphyromonas gingivalis. Oral Microbiol. Immunol. 19 (2), 88-94 (2004).
  18. Lewis, J. P., Iyer, D., Anaya-Bergman, C. Adaptation of Porphyromonas gingivalis to microaerophilic conditions involves increased consumption of formate and reduced utilization of lactate. Microbiology. 155, 3758-3774 (2009).
  19. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. J. Vis. Exp. (79), e50787(2013).
  20. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. , (2001).
  21. Koch, A. L., Crandall, M. Photometric measurement of bacterial growth. The American Biology Teacher. 30 (6), 481-485 (1968).
  22. Wikins, T. D., Holdeman, L. V., Abramson, I. J., Moore, W. E. Standardized single-disc method for antibiotic susceptibility testing of anaerobic bacteria Antimicrob. Agents Chemother. 1 (6), 451-459 (1972).
  23. Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C., Turck, M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45 (4), 493-496 (1966).
  24. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J. Clin. Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  25. Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by endothelial cells induces apoptosis. Infect. Immun. 66 (12), 5994-5998 (1998).
  26. Naito, M., et al. Determination of the genome sequence of Porphyromonas gingivalis strain ATCC 33277 and genomic comparison with strain W83 revealed extensive genome rearrangements in P. gingivalis. DNA Res. 15 (4), 215-225 (2008).
  27. Goebel, W., Kuhn, M. Bacterial replication in the host cell cytosol. Curr. Opin. Microbiol. 3 (1), 49-53 (2000).
  28. Gospodarowicz, D. III C. Extracellular matrix and control of proliferation of vascular endothelial cells. J. Clin. Invest. 65 (6), 1351-1364 (1980).
  29. DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PloS One. 5 (9), e13039(2010).
  30. Sellers, J. R., Cook, S., Goldmacher, V. S. A cytotoxicity assay utilizing a fluorescent dye that determines accurate surviving fractions of cells. J. Immunol. Methods. 172 (2), 255-264 (1994).
  31. Van Veen, H. W., et al. Generation of a proton motive force by the excretion of metal-phosphate in the polyphosphate-accumulating Acinetobacter johnsonii strain 210A. J. Biol. Chem. 269 (47), 29509-29514 (1994).
  32. Jackson, V. N., Halestrap, A. P. The kinetics, substrate, and inhibitor specificity of the monocarboxylate (lactate) transporter of rat liver cells determined using the fluorescent intracellular pH indicator, 2',7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein. J. Biol. Chem. 271 (2), 861-868 (1996).
  33. He, J., et al. Role of Porphyromonas gingivalis FeoB2 in metal uptake and oxidative stress protection. Infect. Immun. 74 (7), 4214-4223 (2006).
  34. Anaya-Bergman, C., et al. Porphyromonas gingivalis ferrous iron transporter FeoB1 influences sensitivity to oxidative stress. Infect. Immun. 78 (2), 688-696 (2010).
  35. Ueshima, J., et al. Purification, gene cloning, gene expression, and mutants of Dps from the obligate anaerobe Porphyromonas gingivalis. Infect. Immun. 71 (3), 1170-1178 (2003).
  36. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. JoVE. (79), (2013).
  37. Cordes, T., Maiser, A., Steinhauer, C., Schermelleh, L., Tinnefeld, P. Mechanisms and advancement of antifading agents for fluorescence microscopy and single-molecule spectroscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (14), 6699-6709 (2011).
  38. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , (2010).
  39. Gursoy, U., Könönen, E., Uitto, V. Prevotella intermedia ATCC 25611 targets host cell lamellipodia in epithelial cell adhesion and invasion. Oral Microbiol. Immunol. 24 (4), 304-309 (2009).
  40. Sengupta, D., et al. Interaction of Prevotella intermedia strain 17 leucine-rich repeat domain protein AdpF with eukaryotic cells promotes bacterial internalization. Infect. Immun. 82 (6), 2637-2648 (2014).
  41. Reyes, L., Herrera, D., Kozarov, E., Roldán, S., Progulske-Fox, A. Periodontal bacterial invasion and infection: contribution to atherosclerotic pathology. J. Clin. Periodontol. 40, S30-S50 (2013).
  42. Grant, M. M., et al. Oxygen tension modulates the cytokine response of oral epithelium to periodontal bacteria. J. Clin. Periodontol. 37 (12), 1039-1048 (2010).
  43. Biedermann, A., Kriebel, K., Kreikemeyer, B., Lang, H. Interactions of Anaerobic Bacteria with Dental Stem Cells: An In Vitro Study. PloS One. 9 (11), e110616(2014).
  44. Kriebel, K., Biedermann, A., Kreikemeyer, B., Lang, H. Anaerobic Co-Culture of Mesenchymal Stem Cells and Anaerobic Pathogens-A New In Vitro Model System. PloS One. 8 (11), e78226(2013).
  45. Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
  46. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gòmez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectro. 63, 218-231 (2015).
  47. Iyer, D., et al. AdpC is a Prevotella intermedia 17 leucine-rich repeat internalin-like protein. Infect. Immun. 78 (6), 2385-2396 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

HUVECBCECF AM
Porphyromonas gingivalis в качестве модельного организма для оценки интерактивности анаэробных бактерий с клеток-хозяев
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.