Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Вода в масле: Новая система для сборки растворимых в воде Хлорофилл-связывающих белков с гидрофобными Пигменты

14.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53410

⸱

21 марта 2016 г.

 , 
1Department of Biological Chemistry, Weizmann Institute of Science, 2Migal-Galilee Research Institute

В этой статье

Краткое содержание

Эта рукопись описывает простую и высокую пропускную способность метода для сборки водорастворимых белков с гидрофобными пигментов, которая основана на воде в масле. Показана эффективность метода в сборке отечественных хлорофиллов с четырьмя вариантами рекомбинантного растворимого в воде-хлорофиллом связывающих белков (WSCPs) из Brassica растений , выраженных в Е. палочки.

Аннотация

Хлорофилл (ЧЛС) и бактериохлорофиллы (BChls) являются основными кофакторами, которые осуществляют сбор урожая фотосинтетический света и переноса электронов. Их функциональные возможности в значительной степени зависит от их конкретной организации в крупных и сложных белковых комплексов мультисубъединичный трансмембранных. Для того, чтобы понять, на молекулярном уровне, как эти комплексы облегчить преобразование солнечной энергии, важно понимать белок-пигмент, и пигмент-пигментных взаимодействия, а также их влияние на динамику возбужденными. Одним из способов получения такого понимания является путем построения и изучения комплексов ЧЛС с помощью простых водорастворимых рекомбинантных белков. Тем не менее, включающий липофильные ЧЛС и BChls в водорастворимые белки трудно. Более того, не существует общего метода, который может быть использован для сборки водорастворимых белков с гидрофобными пигментов. Здесь мы покажем простую и высокую пропускную способность системы, основанной на воде в масле, что позволяет задницуembly водорастворимых белков с гидрофобными ЧЛС. Новый метод был проверен путем сборки рекомбинантных версий растворимого в воде хлорофилла связывающего белка Brassicaceae растений (WSCP) с Хл. Показано , успешное проведение монтажных работ Хл А с использованием сырой лизаты WSCP , выражающие E. палочка клетка, которая может быть использована для разработки генетической системы экрана для новых водорастворимых белков Chl-связывающих, а также для изучения Хл-белковых взаимодействий и процессов сборки.

Введение

Гидрофобные пигменты, такие как хлорофиллы (ЧЛС), бактериохлорофиллов (BChls) и каротиноидов являются основными кофакторами в фотосинтезирующих реакционных центров и легких белков лесозаготовок, которые осуществляют перенос электронов, а также захватить световой энергии и передачи. Центры реакции и большинство Chl-связывающих уборочных комплексов легких являются трансмембранными белками. Fenna-Мэттьюз-Olson (Предприятию) белок не-кислородных бактерий фотосинтетический зеленовато-серой 1,2, а белок перидинина-Хл (РСР) динофлагеллят 3 являются исключительными примерами водорастворимых белков светособирающих. Водорастворимые хлорофилл связывающие белки (WSCPs) из Brassicaceae, Polygonaceae, маревых и Amaranthaceae растения 4, 5 являются еще одним уникальным примером, но в отличие от FMO и PCP, они не являются ни участвовать в легкой уборке , ни в какой - либо реакции первичного фотосинтетического , и их точное PHYsiological функции пока неясно , 5-8. Их высокое сродство Хл связывания привели к предложенной функции в качестве переходных носителей ЧЛС и производных Chl 9,10. В качестве альтернативы, была выдвинута гипотеза о том , что WSCP играет роль в продувочного ЧЛС в поврежденных клетках и защищает от Chl-индуцированной фотоокислительном повреждения 7,11-13. Совсем недавно было высказано предположение , что функции WSCP в качестве ингибитора протеазы и играет определенную роль в процессе сопротивления травоядных , а также регулирует гибель клеток во время развития цветка 14. WSCPs делятся на два основных класса в зависимости от их фотофизические свойства. Первый класс (класс I, например. От марь белая) могут подвергаться фотоконверсии при освещении. Класс WSCPs II из Brassica растений, которые не претерпевают фотоконверсии 5,10, далее подразделяются на класс IIa (например., Из капуста огородная, Raphanus Sativus) и IIb (например., От Lepidium virginicum ). Структура класса IIb WSCP из Lepidium virginicum была решена с помощью рентгеновской кристаллографии с разрешением 2,0 Å 8. Она показывает симметричный гомотетрамера, в котором белковые субъединицы образуют гидрофобную сердцевину. Каждая субъединица связывает одну Chl, что приводит к жесткой расположение четырех плотно упакованными CHLS в пределах core.This просто вся компоновка Хл делает WSCPs потенциально полезную модель системы для изучения связывания и сборки Хл-белковых комплексов, а также влияние соседних CHLS и белковые среды на спектральные и электронных свойств отдельных ЧЛС. Кроме того, она может предоставить шаблоны для построения искусственных Chl-связывающих белков, которые могут быть использованы для светособирающих модулей в искусственных устройствах фотосинтетических.

Строгие исследования нативных WSCPs не представляется возможным , поскольку комплексы , очищенные из растений всегда содержат гетерогенную смесь тетрамеров с различными комбинациями Хли Хл б 9. Таким образом, способ сборки рекомбинантно экспрессировать WSCPs с ЧЛС в пробирке требуется. Это сталкивается с проблемой незначительной растворимостью в воде ЧЛС , что делает невозможным собрать комплекс в пробирке путем простого смешивания водорастворимых апопротеины с пигментами в водных растворах. В пробирке сборки путем смешивания апопротеинов с мембранах тилакоидов 15 была продемонстрирована, но этот способ ограничен нативной ЧЛС, присутствующего в тилакои. Шмидт и др. сообщила о сборке нескольких CHL и ВСЫ производные WSCP из цветной капусты (CaWSCP) путем рекомбинантно экспрессии гистидин-меченый белок в Е. палочки иммобилизации его на колонку Ni-аффинной и введение CHL производных растворили в моющих средствах 11. Успешно восстановление рекомбинантных WSCPs из A. thaliana 6, и брюссельская капуста (BoWSCP), японская дикая редька (RshWSCP)d Вирджиния pepperweed (LvWSCP) аналогичным методом были также зарегистрированы.

Здесь мы представляем новый, общий, простой метод для сборки ЧЛС с WSCP, которые не требуют мечение или иммобилизации белков. Он опирается на приготовления эмульсий из их водных растворов водорастворимых апобелков в минеральном масле. Белки , таким образом , инкапсулированные в воде в масле (W / O) микрокапель с очень высокой удельной поверхностью по отношению к объему 16. Гидрофобные кофакторы затем растворяют в масле и легко введены в капельки из масляной фазы. Мы сообщаем об использовании способа сборки нескольких вариантов WSCP апобелков рекомбинантно экспрессировали в E. палочка с Хл. Продемонстрирована сборку из сырого лизата WSCP-гиперэкспрессией бактерий, которые могут быть использованы в качестве системы скрининга для разработки новых CHL связывающих белков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка CHL запаса Решения

  1. ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: Выполните все этапы подготовки хлорофилла в химической капот, под зеленым светом (520 нм) или в темноте, чтобы минимизировать фотоповреждения. Всегда добавляйте азот или аргон перед замораживанием пигментов для хранения. Убедитесь, что все растворители аналитической степени чистоты.
  2. Взвесьте около 5 мг лиофилизированных клеток спирулины или других цианобактерии клеток , содержащих только Хл в мембранах тилакоидов и раздавить его , используя ступку и пестик.
  3. Нагрузка измельченные клетки на стеклянную колонку и промывают около 50-100 мл 100% ацетона, чтобы удалить каротиноиды. Откажитесь элюированного оранжевый / зеленый фракции.
    Примечание: Если оранжевая фракция не элюируют 100 мл ацетона продолжают промыванием клеток с ацетоном, пока зеленая фракция не начнет элюции.
  4. Обмен ацетона со 100% -ным метанолом и собирают зеленую фракцию , содержащую Хл. Объем элюированного fractион может варьироваться от 50-100 мл. В начале, элюированной фракции имеет темно-зеленый цвет, который меняется в бледно-зеленый цвет в конце элюирования. Когда цвет элюированной фракции превращается в бледно-зеленый цвет остановить вымывание.
  5. Упаривают метанол, используя роторный испаритель, пока экстракт не высохнет. Не прикладывать тепло к решению; убедитесь, что температура воды ванны испарителя не превышает 30 ° C.
    Примечание: Время испарения зависит от объема метанола фракции упариванием и может варьироваться от 10-60 мин. Важно, чтобы полностью высушить экстракт.
  6. Растворите пигменты из высушенного экстракта в небольшом объеме диэтилового эфира (около 5-10 мл), и фильтруют через вату. Убедитесь, что пигменты полностью растворяют в эфире перед фильтрованием.
  7. Упаривают диэтиловый эфир до тех пор, пигменты полностью не высохнут (10-30 мин).
    Примечание: Сухие пигменты могут быть продувают и держали под азотом или аргоном при -20 ° С, в темноте до дальнейшей обработки.
  8. Растворите сухие пигменты в самом маленьком объеме возможной 100% метанола (около 1 мл), даже если не все полностью приостановлено. Добавляют 4 мл ацетона, к раствору, и вылить стакан осторожно, чтобы полностью растворить пигменты.
  9. С помощью пипетки Пастера, загрузить образец осторожно на колонку ДЭАЭ сефарозе, уравновешенную 100% ацетона.
  10. Элюции каротиноиды (оранжево-желтая полоса) с 100% ацетона. Затем элюции Хл (зеленая полоса) с 3: 1 об / об ацетон / метанол.
    Примечание: объем ацетона и ацетон / метанол, приблизительно эквивалентна объему ДЭАЭ сефарозе наносили на колонку.
  11. Проверьте CHL чистоту с помощью тонкослойной хроматографии с использованием 68: 25: 5: 2 дихлорметан / н-гексан / изопропанол / метанол (об / об) в качестве элюента смесь 17.
  12. Растворитель испар ют с помощью роторного испарителя , пока Хл полностью высохнет (10-60 мин).
    Примечание: Сухой Хл можно продуть азотом или аргоном и хранили в атмосфере аргона при -20 ° С в темноте.
  13. Подготовка CHL исходного раствора путем повторного растворения сухого Хл а в 2-4 мл 100% этанола.
    Примечание: Коэффициент экстинкции Хл при 663 нм , составляет 74400 см -1 М -1 (83,3 см -1 (мг / мл) -1) в этаноле. Типичный раствор должен иметь внешний диаметр, соответствующий 1860 в концентрации 25 мМ (23 мг / мл). Добавление 20 мкл этого запаса в эмульсию , содержащую 5 мл органической фазы и 1 мг WSCP в 1 мл водного раствора приводит фазы в смеси с 10 - кратным мольным избытком Хл а против WSCP.

2. Подготовка органической фазы эмульсии

Примечание: Органическая фаза эмульсии состоит из минерального масла, содержащего 4,5% (об / об) Спан 80, и 0,4% (об / об) твина 80.

  1. Взвешивают в 50 мл трубки 0,2 г ТWEEN 80, 1,8 г Span 80, и 38 г минерального масла. Тщательно перемешать все компоненты и остывают на льду.
    Примечание: Органическая фаза может быть сохранена в 4 ° С в течение одной недели.

3. Подготовка Водную фазу эмульсии

Примечание: Водная фаза эмульсии может состоять или из очищенного WSCP или неочищенного экстракта бактерий с гиперэкспрессией WSCP.

  1. Приготовление водной фазы, содержащей очищенный WSCP.
    1. Grow бактерии Е. coli BL21 , не содержащих плазмиду WSCP 12 в 1 л LB среды при 37 ° С до OD 0,3-0,6.
    2. Индуцируют экспрессию белка путем добавления 1 мМ IPTG. После индукции бактерии растут при температуре 30 ° С в течение 12-16 ч.
    3. Урожай бактерий путем центрифугирования при 5000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
    4. Растворить осадок в буфере для связывания и соникатные на льду (30 сек на 15 сек, выключен, в пять раз). С помощью 10 мл буфера для Осадок, полученный после центрифугирования 250 млLB среду с клетками с гиперэкспрессией белка.
      Примечание: В зависимости от способа очистки, связывающим буфером может состоять из 100 мМ фосфатного буфера, рН 7,2 или 50 мМ Трис, рН 7,5, 500 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА.
    5. Спин вниз Клеточный лизат при 12000 х г в течение 30 мин при 4 ° C.
    6. Очищают WSCP с помощью аффинной хроматографии. В зависимости от тега, слитого с WSCP, очищают рекомбинантные белки с использованием соответствующего коммерчески доступную систему аффинной хроматографии для очистки белков в соответствии с инструкциями производителя.
    7. Для приготовления эмульсии, используют очищенный WSCP в 50 мМ фосфатного буфера, рН 7,8. Убедитесь в том, что окончательное количество белка для восстановления составляет 0,5-1,0 мг на 1 мл буфера.
  2. Приготовление водной фазы, содержащей сырой бактериальный лизат с WSCP.
    1. Рост клеток Е. coli BL21 , не содержащие плазмиды , экспрессирующие WSCP в 250 мл LB среде при температуре 37 ° С до OD 0,3-0,6.
    2. Индуцируют экспрессию белка с1 мМ IPTG и выращивать бактерии в течение ночи при температуре 30 ° C.
    3. Урожай бактериальные клетки центрифугированием при 5000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
    4. Растворить осадок в 1-2 мл 50 мМ натрий-фосфатного буфера рН 7,8, гомогенат (30 сек на 15 сек выкл, три раза) и центрифугировать при 12000 х г в течение 30 мин при температуре 4 ° С.
    5. Готовят водную фазу эмульсии путем смешивания 0,125 мл супернатанта с помощью 0,875 мл 50 мМ натрий-фосфатного буфера с рН 7,8.

4. Монтаж WSCP с Хл в Emulsion

  1. Передача 5 мл масла-поверхностно-активное вещество, приготовленное в стеклянный флакон и охладить его на льду. Перед пипеткой, убедитесь, что все компоненты органической фазы тщательно перемешивают и нет разделения фаз между поверхностно-активных веществ и минеральных масел.
  2. Добавить 1 мл охлажденной льдом водной фазы, полученной как описано в разделе 3 по 5 мл органической фазы.
  3. Смешайте обе фазы с помощью гомогенизатора тканей в течение 2 мин при 9,500 оборотах в минуту на льду.
  4. Важным шагом: Начиная с этого этапа на выполните все дальнейшие шаги в зеленом свете (520 нм) с целью минимизации фотоповреждения. Добавьте 20 мкл 25 мМ Chl исходного раствора (смотри раздел 1.13) к эмульсии. Дисперсные Смахивающее и переворачивая стеклянный пузырек. Убедитесь, что Хл равномерно распределяется в эмульсии.
  5. Выдержите эмульсии в течение 1-2 ч на льду в темноте.
  6. Для того, чтобы разрушить эмульсию и отдельные капли воды из органической фазы переноса эмульсии 1,5 мл пластиковые пробирки и центрифуге при 14000 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Если сборка прошла успешно, нижнюю водную фазу должны иметь зеленый цвет.
  7. Утилизировать верхнюю фазу масла и добавьте 1 мл минерального масла. Хорошо перемешайте минеральное масло с гранулированным эмульсии путем вихря или с помощью тщательно переворачивая трубку. Спин вниз образца при 14000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторите этот шаг до получения прозрачного мениском, разделяющей водную и рудничныемасляные фазы Al, без какой-либо промежуточной эмульсии получается.
  8. Выполните этот шаг в химической капот. После того, как водные и минеральные масляные фазы четко разделены, удалить минеральное масло и добавляют 1 мл насыщенного водой диэтилового эфира. Vortex и спином вниз образца при 14000 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторите этот шаг дважды.
  9. После второго центрифугирования, удалить диэтиловый эфир и оставить пробирки открытыми в течение 5-20 мин в капюшоне.
  10. И, наконец, загрузить водную фазу , содержащую WSCP / CHL комплекс на колонку для обессоливания и элюции с помощью буфера , пригодных для дальнейших экспериментов.
    Примечание: Белок стабилен в Трис и не содержащие фосфатов буферов в широком диапазоне рН (6,0-7,5). Образец можно хранить при температуре 4 ° С в защищенном от света до одного месяца.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рекомбинантные WSCP апопротеины были собраны с Хл в W эмульсий / O в соответствии с протоколом , описанным в предыдущем разделе. Протокол был реализован с использованием водной фаз , содержащих либо в чистом виде WSCPs или лизаты клеток E.coli с гиперэкспрессией WSCP (рисунок 1). Протокол является простым, быстрым и не требует никакого специального оборудования, кроме гомогенизаторе тканей.

Поглощение...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наша цель состояла в том, чтобы разработать новую общую систему для сборки водорастворимых хлорофилл-связывающих белков с гидрофобными пигментов. Здесь показано , что новая система восстановление на основе W / O эмульсии общий подход доказал свою работу для сборки WSCP апобелков из брюссельской капусты, цветной капусты, японского хрена и Вирджинии pepperweed рекомбинантно экспрессируется в E. палочки. Здесь результаты представлены от восстановления 1 мг WSCP с 10-кратным мольным избытком Хл. Тем не менее, также...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

DN признает поддержку со стороны 7РП ЕС проектов PEPDIODE (GA 256672) и REGPOT-2012-2013-1 (Г.А. 316157), и личный исследовательский грант (№ 268/10) от научного фонда Израиля. Мы благодарим профессора Шмуэля Рубинштейн, школа инженерных и прикладных наук, Гарвардский университет, Кембридж Массачусетс, США для принятия конфокальной микроскопии изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Минеральное маслоSigmaM5904
Span80Sigma85548
Tween80SigmaP8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact картриджиBio Rad10011164Affinity хроматография для очистки WSCP с нативной последовательностью.
Его колонка Trap HFGE Healthcare Life Science17-5248-02Аффинная хроматография для очистки WSCP с помощью His-tag
DEAE Sepharose Fast FlowGE Healthcare Life Science17-0709-01Хроматографическая среда для очистки хлорофилла

Ссылки

  1. Bryant, D. A., Frigaard, N. -U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
  2. Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria. Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).
  3. Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates. Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).
  4. Renger, G., et al. Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes. J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).
  5. Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein. Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).
  6. Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique. Planta. 236, 251-259 (2012).
  7. Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants. J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).
  8. Horigome, D., et al. Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein. J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).
  9. Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -P., Reinbothe, S. A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide. Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).
  10. Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower. J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).
  11. Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives. Biochemistry. 42, 7427-7433 (2003).
  12. Takahashi, S., et al. Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera). Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).
  13. Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish. J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).
  14. Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).
  15. Hughes, J. L., et al. Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls. J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).
  16. Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions. BBA - Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).
  17. Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation. J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).
  18. Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts. Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).
  19. Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum. Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

WSCP
Вода в масле: Новая система для сборки растворимых в воде Хлорофилл-связывающих белков с гидрофобными Пигменты
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.