Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Экспериментальные подходы к изучению Митохондриальная локализации и функции цикла ядерных клеток киназа, CDK1

11.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53417

⸱

25 февраля 2016 г.

 ,  ,  , 
1Radiation Oncology, University of California, Davis

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем, как изучать митохондриальную локализацию киназы (клеточного цикла) и как определить ее субмитохондриальное расположение, а также потенциальные митохондриальные субстраты/мишени. Принудительная экспрессия белков в митохондриях является полезным инструментом для изучения функциональных последствий митохондриальной локализации интересующего белка.

Аннотация

Хотя митохондрии обладают собственным транскрипционным механизмом, только 1% митохондриальных белков синтезируется внутри органеллы. Ядерно-кодируемые белки транспортируются в митохондрии в соответствии с их митохондриальными целевыми последовательностями (MTS); однако у большинства митохондриальных локализованных белков отсутствует идентифицируемая MTS. Тем не менее, тот факт, что MTS может инструктировать белки проникать в митохондрии, является ценным инструментом для изучения митохондриальных функций нормально ядерных и/или цитоплазматических белков. Недавно мы идентифицировали комплекс киназы клеточного цикла CyclinB1/Cdk1 в митохондриях. Для изучения митохондриальных функций этого комплекса было важно обеспечить сверхэкспрессию митохондрий и нокдаун этого комплекса без вмешательства в его ядерные или цитоплазматические функции. Пометив CyclinB1/Cdk1 с помощью MTS, мы смогли достичь митохондриальной сверхэкспрессии этого комплекса для изучения его митохондриальных мишеней, а также функций. Путем маркировки доминантно-негативного Cdk1 с помощью MTS было достигнуто ингибирование активности Cdk1, особенно в митохондриях. Потенциальные митохондриальные мишени комплекса CyclinB1/Cdk1 были идентифицированы с помощью протеомного подхода на основе геля. В отличие от традиционного 2D-анализа геля, мы использовали технологию двумерного разностного гель-электрофореза (2D-DIGE) с последующим окрашиванием фосфопротеинов для флуоресцентного мечения дифференциально фосфорилированных белков в митохондриальных клетках, экспрессирующих Cdk1. Идентификация фосфопротеиновых пятен, которые были изменены в диком типе по сравнению с доминирующими отрицательными митохондриями, несущими Cdk1, выявила идентичность митохондриальных мишеней Cdk1. Наконец, чтобы определить влияние митохондриальной локализации CyclinB1/Cdk1 на прогрессию клеточного цикла, был использован анализ пролиферации клеток с использованием синтетического аналога тимидина EdU (5-этинил-2'-дезоксиуридин) для мониторинга клеток по мере их прохождения через клеточный цикл и репликации их ДНК. В целом, мы продемонстрировали разнообразие доступных подходов к изучению митохондриальной локализации и активности киназы клеточного цикла. Это передовые, но простые в использовании методы, которые будут полезны для многих исследователей в области клеточной биологии.

Введение

У млекопитающих, прогрессию клеточного цикла зависит от высокоупорядоченных событий , контролируемых циклинов и циклин-зависимых киназ (CDKS) 1. Благодаря его цитоплазматическом, ядерной и центросомной локализации, CyclinB1 / Cdk1 способен синхронизировать различные события в митозе , таких как пробой ядерной оболочки и центросом разделения 2. CyclinB1 / Cdk1 защищает митотических клеток от апоптоза 3 и способствует митохондриальной деления, критический шаг для равномерного распределения митохондрий вновь образованных клеток дочь 4.

В пролиферирующих клетках млекопитающих митохондриальной АТФ генерируется с помощью окислительного фосфорилирования (OXPHOS) машины (цепи переноса электронов), который состоит из 5 из множества субъединиц комплексов; Комплекс I - комплекс V (CI-CV). Никотинамидадениндинуклеотид (NADH): убихинон оксидоредуктазы или комплекс I (CI) является самым крупным и наименее изученной из пяти комплексов 5. Комплекс сonsists из 45 субъединиц, 14 из которых образуют каталитическую сердцевину. После сборки, комплекс предполагает L-образную конструкцию с одной рукой , выступающая в матрице , а другой рукой внедренного во внутреннюю 6,7 мембраны. Мутации в CI субъединиц являются причиной множества митохондриальных нарушений 8. Функционально эффективность CI в OXPHOS требуется не только для общего митохондриального дыхания 9, но и для прогрессии цикла успешно клеток 10. Unravelling механизмы, лежащие в основе функционирования этой мембраносвязанного ферментного комплекса в отношении здоровья и болезни может способствовать разработке новых диагностических процедур и передовых терапевтических стратегий. В недавнем исследовании мы обнаружили, что CyclinB1 / комплекс Cdk1 транслоцируется в митохондрии в G2 (митоза) M фазы (Gap 2) / и фосфорилирует CI субъединиц для расширения производства митохондриальной энергии, потенциально, чтобы компенсировать повышенные энергетические потребности клеток во время клеточного цикл 11. Здесь мы шоwcase экспериментальных процедур и стратегий, которые могут быть использованы для изучения митохондриальной транслокацию в противном случае ядерных / цитоплазматические киназ, их митохондриальных субстратов, а также функциональные последствия их митохондриальной локализации с использованием CyclinB1 / Cdk1 в качестве примера.

К выводу, что CyclinB1 / комплекс Cdk1 транслоцируется в митохондрии при необходимости побудила исследования митохондриальной специфических оверэкспрессии и нокдаун этого комплекса. Для достижения митохондрии специфических экспрессию белков, можно добавить последовательность митохондрии ориентации (MTS) в N-конце белка, представляющего интерес. Митохондрии таргетингом последовательности позволяют сортировку митохондриальных белков в митохондрии , где они обычно проживают 12. Мы использовали таргетирования последовательность 87 оснований митохондрии, полученный из предшественника человеческого цитохром с оксидазы субъединиц 8А (COX8) и клонируют его в зеленый флуоресцентный белок (GFP) -tagged CyclinB1 или красный флуоресцентныйПротеин (ЗП) -tagged Cdk1, содержащих плазмид в кадре. Этот метод позволил нам целевой CyclinB1 и Cdk1 в митохондрии, в частности, изменение митохондриальной экспрессии этих белков, не затрагивая их ядерный пул. По флуоресцентно мечения эти белки, мы были в состоянии контролировать их локализацию в режиме реального времени. Кроме того, мы ввели MTS в плазмиду, содержащую RFP-меченый доминирующим отрицательным Cdk1, что позволило нам конкретно сбить митохондриальную экспрессию и функции Cdk1. Важно различать митохондриальных и ядерных функций киназ, которые имеют двойное локализаций как Cdk1. Инжиниринг МТС в N-терминала этих двойных функциональных киназ предлагает большую стратегию, которая легко использоваться и эффективно.

Поскольку Cdk1 является клеточного цикла киназы, она имеет фундаментальное значение для определения прогрессии клеточного цикла, когда Cdk1 локализована в митохондриях. Для достижения этой цели мы использовали новую метоd контролировать содержание ДНК в клетках. Традиционные методы включают использование BrdU (бромдеоксиуридина), синтетический аналог тимидина, который встраивается в вновь синтезированной ДНК в фазе S клеточного цикла, чтобы заменить тимидина. Затем клетки, которые активно дублирующие их ДНК могут быть обнаружены с помощью анти-BrdU антителами. Одним из недостатков этого способа состоит в том , что она требует денатурации ДНК , чтобы обеспечить доступ к антителу BrdU с помощью жестких методов , таких как кислоты или термической обработки, что может привести к несоответствию между результатами 13,14. В качестве альтернативы, мы использовали аналогичный подход для наблюдения за активно делящиеся клетки с различным аналоговым тимидина, Эду. Обнаружение Эду не требует резкой денатурации ДНК, как мягкая обработка моющее средство позволяет реагент обнаружения для доступа к Эду во вновь синтезированной ДНК. Метод Эду оказался более надежным, последовательным и с потенциалом для анализа с высокой пропускной способностью 15.

И, наконец, тO определяют митохондриальных субстратов Cdk1, мы использовали инструмент под названием протеомики 2D-ПГЛП, который является продвинутой версией классического двухмерным электрофорезом в геле. Двумерный электрофорез разделяет белки по их изоэлектрической точке в первом измерении и молекулярной массой во второй. Так как пост-трансляционной модификации, такие как фосфорилирование влияет на изоэлектрической точки и молекулярную массу белков, 2D гели могут обнаружить разницу между фосфорилирования статусов белков в составе различных образцов. Размер (площадь и интенсивность) белка видит изменения с уровнем экспрессии белков, что позволяет количественное сравнение между несколькими образцами. Используя этот метод, мы смогли дифференцировать фосфорилированные белки дикого типа в сравнении с мутантным митохондрии, ориентированных CDK1 экспрессирующих клеток. Специфические белковые пятна, которые показали в дикого типа, но отсутствовавшие в митохондриях таргетингом мутантного препарата CDK1 были выделены иидентифицировали с помощью масс-спектрометрии.

В традиционных 2D-гелей, Трифенилметановые красители используются для визуализации белков на геле. 2D-ПГЛП использует флуоресцентный белок этикетки с минимальным влиянием на электрофоретической подвижности белка. Различные образцы белка могут быть помечены различными флуоресцентными красителями, смешивались и разделенных одинаковыми гелями, что позволяет совместное электрофорез нескольких образцов на одном геле 16. Это минимизирует гель-на-гель вариаций, что является серьезной проблемой в гель на основе протеомики исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Выделение Митохондрии из культивируемых клеток

  1. Получение изоляции буфера для клеток (IBC) буфера
    1. Готовят 0,1 М Трис / МОПС (трис (гидроксиметил) / 3- (N -morpholino) пропансульфокислоты): Растворить 12,1 г Трис в 800 мл дистиллированной воды, довести рН до 7,4 с помощью MOPS порошок, добавляют дистиллированную воду до общего объем 1 л и хранить при температуре 4 ° С
    2. Готовят 0,1 М EGTA (этиленгликоль-бис (2-аминоэтил эфир) этилендиаминтетрауксусной кислоты) / Трис: Растворить 38,1 г EGTA в 800 мл дистиллированной воды, довести рН до 7,4 с помощью Tris порошок, добавляют дистиллированную воду до общего объема 1 л и хранить при температуре 4 ° С.
    3. Готовят 1 М сахарозе: Растворить 34,23 г сахарозы в 100 мл дистиллированной воды, делают по 20 мл аликвоты и хранят при -20 ° С
    4. Подготовьте IB гр буфера: Приготовить 100 мл IB C буфер добавлением 10 мл 0,1 М Трис / MOPS и 1 мл 0,1 М EGTA / Трис до 20 мл; 1 М сахарозы. Добавить дистиллированную воду до общего объема 100 мл. Регулировка рН до 7,4.
  2. Подготовка буфера для лизиса клеток
    1. Подготовка буфера для лизиса, содержащего 20 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА (этилен диамино этилендиаминтетрауксусной кислоты), 1 мМ EGTA, 1% Тритон-Х-100, 2,5 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ β- глицерофосфат, 1 мМ ортованадат натрия. Добавить ингибиторы протеиназы 1 мкг / мл лейпептина и 1 мМ PMSF (фенилметилсульфонилфторид) непосредственно перед использованием.
  3. Выделение Митохондрии
    1. Урожай 3 х 10 7 клеток охлажденным льдом 1x PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), рН 7,4 и центрифугируют клетки при 600 мкг в течение 10 мин при 4 о С. Жидкость над осадком сливают и вновь приостановить осадок в 5 мл охлажденного льдом буфера И.Б. гр.
    2. Перемешать клеток с использованием измельчителя ткани стекло / стекло в течение примерно 10 мин. Передача гомогената в 15 мл пробирку и центрифугируют при 600 х г в течение 10 мильп при 4 о С. Для функционального митохондриях, используйте стекло / тефлоновую муфту, как это менее вредно для митохондрий, чем мясорубки ткани стекла / стекла.
    3. Соберите супернатант в 1,5 мл пробирки и центрифуге при 7000 мкг в течение 10 мин при 4 о С. Передача супернатант в 1,5 мл пробирку и сохранить как цитозоле белка.
    4. Промывают осадок (митохондрии) дважды 200 мкл охлажденного льдом буфера IB гр и центрифуге при 7000 х г в течение 10 мин при 4 о С.
    5. Удалите супернатант и повторно приостанавливать осадок в буфере для лизиса клеток и использовать его сразу или хранить при температуре -80 ° С для дальнейшего использования. Если необходимы функциональные митохондрии, повторно приостанавливать осадок в оставшейся буфера после удаления надосадочной жидкости. Разбавление митохондриальной фракции далее может привести к потере функции митохондрий. Хранить на льду и использовать препарат в течение 1 - 3 ч для достижения наилучших результатов.
    6. Разрушать ультразвуком ресуспендировали осадок в течение тридцати-3 сек всплесков вледяная баня, центрифуге при 10000 мкг в течение 5 мин, и сохраните супернатант в качестве митохондриальной фракции.

2. Со-иммунное CDK1, CyclinB1 и COXIV, белок митохондриальной Resident

  1. Grow 5 х 10 4 клеток на покровные в 24-луночные планшеты O / N или до 70% слияния. Аспирируйте среды и промыть клетки дважды 500 мкл охлажденного льдом 1 х PBS, рН 7,4.
  2. Закрепить клетки с 500 мкл охлажденного на льду 4% параформальдегида при комнатной температуре в течение 10 мин. Аспирируйте фиксирующий раствор и промыть клетки с 500 мкл 1 х PBS 3 раза, 5 мин каждая при осторожном встряхивании при комнатной температуре.
  3. Клетки проницаемыми с 0,2% Тритона Х-100 в 500 мкл PBS в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте раствор и промыть клетки 3 раза, 5 мин каждый с 500 мкл PBS. Добавить блокирующий раствор (500 мкл, 1% БСА (бычий сывороточный альбумин) в PBS, содержащем 1% Tween 20) в течение 30 мин при комнатной температуре.
  4. Развести первичных антител 1: 250 (по объему) в 5001; л блокирующего раствора и инкубировать клетки с желаемыми первичными антителами, индуцированными у разных видов, чтобы избежать перекрестной передачи сигналов (CyclinB1 (мышь) и COXIV (кролик) или Cdk1 (мышь) и COXIV (кролик) при комнатной температуре в течение 30 - 60 мин или O / N при 4 о С.
  5. Промыть покровные с помощью 500 мкл 1 х PBS, 3 раза, 5 мин каждый раз, а затем инкубируют с вторичным антителом, разбавленное 1: 1000 в 500 мкл блокирующего раствора при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего промывали 500 мкл PBS 3 раза, 5 мин каждый.
  6. Установите покровные с 20 мкл анти-выцветанию решение для монтажа и герметизации слайдам с помощью лака для ногтей. Изображение слайды с помощью флуоресцентного микроскопа сразу же или держать в темноте при 4 ° С в течение 1 - 2 недель.

3. Карбонат натрия Извлечение неповрежденном Митохондрии

  1. Растут примерно 20 х 10 7 клеток, сбора урожая, мыть один раз PBS и изолировать митохондрии , как описано в разделе 1. Разделите митохондриальной изолирует на два номиналаTS до последнего центрифугирования для осаждения митохондрии (до стадии 1.3.4); сохранить половину для использования в качестве общего митохондрий (этап 3.2), использовать другую половину для извлечения карбоната натрия (следующие шаги 3.3-3.6), чтобы отделить растворимых и мембраносвязанных белков.
  2. Лизировать Всего митохондрии гранул с 30 мкл буфера для лизиса клеток и хранить лизат при -80 о С до использования в иммуноблоттинга.
  3. Добавить 250 мкл 0,1 М Na 2 CO 3 (карбонат натрия), рН 11,0, к другой половине митохондриальной гранулы и инкубировать на льду в течение 30 мин.
  4. Центрифуга при 100000 х г в течение 20 мин. Соберите супернатант и перейдите к шагу 3.5. Lyse осадок с помощью 30 мкл буфера для лизиса клеток и разрушать ультразвуком как на этапе 1.3.6. Хранить при температуре -80 ° С до использования в иммуноблоттинга.
  5. Добавить равный объем 20% свежеприготовленного трихлоруксусной кислоты (ТСА) к надосадочной жидкости для осаждения белков и держать на льду в течение 30 мин.
  6. ЦентробежнаяУГЭ при 15000 мкг в течение 10 мин. Жидкость над осадком сливают, растворить осадок в 80 мкл буфера для лизиса клеток и хранят при -80 ° С до использования в иммуноблоттинга.

4. Разделение внутренней и внешней мембранах митохондрий (Выделение Mitoplasts)

  1. Растут примерно 20 х 10 7 клеток, урожай, мыть один раз PBS и изолировать митохондрии , как описано в разделе 1. Отделите митохондриальных фракций на 10 равных частей до последнего центрифугирования для осаждения митохондрии (до стадии 1.3.4).
  2. Растворить каждую гранулу в 30 мкл указанной концентрации гипотонического буфера сахарозы (1 мМ ЭДТА, 10 мМ MOPS / КОН (гидроокись калия), рН 7,2; концентрация сахарозы в пределах от 25 - 200 мм), с добавлением или без 50 мкг / мл трипсина ( Таблица 1) и инкубировать в течение 30 мин на льду.
  3. Добавить 3 мкл 10 мМ PMSF (до конечной концентрации 1 мМ PMSF) с помощью трипсина, содержащим ампул, чтобы остановить тон усвоением трипсина и инкубировать на льду в течение 10 мин.
  4. Центрифуга при 14000 мкг при 4 ° С в течение 10 мин. Перенести супернатант в новую пробирку, лизировать осадок в 30 мкл буфера для лизиса клеток, разрушать ультразвуком , как на этапе 1.3.6, и хранят при -80 о С.

5. Построение Митохондрии ориентированных на GFP / RFP-меченый CyclinB1 / Cdk1 векторы и подтверждение их митохондриальной локализации

  1. Клонирование митохондрии таргетингом последовательность (МТС; полученный из предшественника человеческого цитохром с оксидаза субъединица 8А (COX8) между нуклеотидами 76 - 161) в кадре в N-конце GFP или RFP на NheI и BamHI сайты pEGFP-N1 или pERFP -n1 векторы с использованием стандартных методик молекулярного клонирования.
  2. При разработке ПЦР-праймеров для генов CyclinB1 и Cdk1, добавлять сайты ферментов рестрикции BamHI распознавания (полужирным шрифтом) к 5'-праймеров ПЦР.
    Форвард Cdk1 BamH15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
    Обратный CDK1 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG CAT СТТ СТТ ААТ CTG ATT
    Форвард CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG АТС CAA TGG CGC TCC GAG ТСА
    Обратный CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CTG CAC СТТ ТГК CAC AGC C
  3. Амплификации генов Cdk1 и CyclinB1 с использованием этих праймеров в соответствии со стандартными методами. Переваривать продукты ПЦР с 1 мкл рестриктазы BamHI при 37 ° С в течение 2 часов. Запуск переваривания продуктов на 1% агарозном геле. С помощью лезвия бритвы, вырезать правильные фрагменты -sized ДНК, и очищают ДНК из геля с использованием набора для экстракции геля.
  4. Дайджест 1 мкг МТС-pEGFP-N1 и MTS-pERFP-N1 плазмид с 1 мкл BamHI фермента при 37 ° С в течение 2 ч. Добавить 1 мкл теленок-INTESкишечные щелочной фосфатазы (МЦК) в течение 30 мин при 37 ° С. Запуск продуктов расщепления на агарозном геле 1% и очищают линейные плазмиды из геля, как описано в шаге 5.3.
  5. Настройка реакции лигирования путем добавления 1 мкл плазмиды со стадии 5.4 и 5 мкл Cdk1 или CyclinB1 со стадии 5.3 до 3 мкл лигазы буфера, 0,5 мкл T4 лигазы и 20,5 мкл дН 2 O. Выдержите O / N при температуре 4 ° С.
  6. Transform кишечной палочки компетентных клеток DH5 & alpha ; с 10 мкл смеси лигировани с помощью стандартной методики и выращивать бактерии на 10 мг / мл канамицина , содержащих LB агаром O / N при температуре 37 ° С для получения колоний.
  7. Выбирают колонию из O / N выращенных пластин с помощью стерильной пипетки, вставьте наконечник в 5 мл канамицина-LB, содержащей трубки и инкубировать O / N. Изолировать плазмиды использованием минипрепаративную комплекты в соответствии с протоколом производителя, и последовательность плазмиды с использованием стандартных методик.
  8. Трансфекцию экспоненциально растущей MCF10A клетки (1,5 × 10 4 клеток высевали на 96-луночные планшеты) с МТС-Cdk1-ОПП или МТС-CyclinB1-GFP плазмид с шагом 5,7 путем приготовления / соотношение реагента плазмидной трансфекции 1: 2 (w: V, 100 нг : 0,2 мкл) в 100 мкл serum- и среды антибиотик бесплатно.
  9. Инкубируйте клетки в плазмиде смеси / реагента в течение 48 ч при 37 ° С в СО 2 инкубатор с контролем влажности (5% СО 2, 95% относительной влажности).
  10. Готовят 1 мМ маточного раствора митохондриальных красного и зеленого флуоресцентных красителей путем растворения 50 мкг порошка в 100 мкл ДМСО. Разбавьте растворы 1: 400 в 1x PBS для получения 2,5 мкм рабочих растворов. Маточные растворы можно хранить при -20 ° С в течение года.
  11. Смешайте 2 мкл 2,5 мкМ красного красителя с 98 мкл культуральной среды для получения конечной концентрации 50 нМ.
  12. Заменить клеточной культуральной среды CyclinB1-GFP клеток, несущих MCF10A (генерируемых на этапе 5.8) с красным красителем, содержащую среду в течение 2 мин. ПовторитьТакая же процедура с зеленым красителем для Cdk1-RFP подшипник MCF10A клеток.
  13. Промыть два раза с 100 мкл 1 х PBS, чтобы избавиться от избытка раствора для окрашивания, добавляют 100 мкл 1x PBS в 96-луночного планшета.
  14. Визуализируйте митохондрии и CyclinB1-GFP (возбуждение 488 нм и эмиссии при 494 - 536 нм) и Cdk1-RFP (возбуждение 560 нм и эмиссии при 565 - 620 нм) на 96-луночные планшеты под флуоресцентным микроскопом при 40-кратном увеличении.

6. Идентификация дифференцированно фосфорилированных белков с помощью 2D-Dige

  1. Базовые приготовления
    1. Изолировать митохондрии и лизировать митохондриальные фракции, как в шаге 1.3. Добавить равный объем 20% ТХУ (трихлоруксусной кислоты в воде) к каждому образцу и вихря на 15 сек. Инкубируйте образцы на льду в течение 30 мин, как белки выпадают в осадок из раствора.
    2. Центрифуга образцов при 9300 х г при 4 ° С в течение 5 мин, удаления надосадочной жидкости, и добавить 60 мкл холодного ацетона (100%) с последующимцентрифугирование при 9300 х г при 4 ° С в течение 5 мин.
    3. Повторите шаг ацетон стирки (этап 6.1.2) еще один раз, удалить супернатант и повторно приостанавливать образцы в 50 мкл ПГЛП мечения буфера (7 М мочевина, 2 М тиомочевины, 4% CHAPS, 30 мМ Трис, рН 8,5).
  2. Подготовьте флуоресцентными красителями
    1. Подготовка маточного раствора: Растворите красители (5 нмоль) в 5 мкл свежей диметилформамида (ДМФ) до конечной концентрации 1 нмоль / мкл. Хранить раствор красителя запас при -20 ° С до использования в течение нескольких месяцев.
    2. Подготовка рабочего раствора: Разрешить красители устанавливать при комнатной температуре в течение 5 мин. Развести 1 мкл красителя с 4 мкл ДМФ до конечной концентрации 200 пмоль / мкл. Держать на льду во время использования. Примечание: Рабочий раствор можно хранить при -20 ° С в течение 3 -х недель.
  3. Этикетка Белки
    1. Смешайте 1 мкл рабочего раствора красителя, на 12,5 мкг белка. Масштабирование по мере необходимости. Для объединенных стандартов, добавьте 61, л су2 рабочего раствора до 300 мкг белка объединенных.
    2. Вихревые в течение 30 сек и центрифугировать при 4 ° С в течение 30 с при 12000 х г. Инкубируют на льду в темноте в течение 30 мин. Остановить маркировку путем добавления 1 мкл 10 мМ лизина на 1 мкл рабочего раствора, используемого. Хорошо перемешать и инкубировать на льду в темноте в течение 10 мин.
    3. Бассейн индивидуально помечены образцы и смешать с регидратации буфером (7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4% CHAPS, 1,2% destreak, 1% pharmalytes, бромфенол синий). Общий объем будет 125 мкл.
    4. Образцы Vortex в течение 30 сек и позволяют установить образцы при комнатной температуре в течение 30 мин. Нагрузка 125 мкл образцов на 7 см рН 4 - 9, изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) полосы.
  4. Первое измерение электрофорез
    1. Поместите держатели полосы (гробы) на электродной пластины, убедившись, что держатели полосы являются абсолютно чистыми и сухими. Пипетировать 125 мкл образцов в гроб, распространяясь равномерно по всему гробу.
    2. Использование выщипыватьRS, возьмите полоску ИЭФ, осторожно удалите защитную пластиковую защитную крышку, и поместите его (гель стороной вниз) в Гроб / регидратации буфера. Избегайте образования пузырьков. Медленно заполнить гроб с телом (1 - 1,5 мл) с минеральным маслом и поместить гроб покрывает на гробах.
    3. Начинают изоэлектрического фокусирования в соответствии с протоколом в таблице 2:
      Примечание: После того , как прогон завершения, полоски могут храниться в пластиковых пробирках при температуре -80 ° С или непосредственно перешли к уравновешивания и втором измерении.
  5. Второе измерение - додецилсульфата натрия в полиакриламидном геле (SDS-PAGE)
    1. уравновешивание
      1. Оттепель SDS буфера для уравновешивания (8 мл на полоски, 6 М мочевины, 30% глицерина, 2% SDS). Взвесить дитиотреитола (DTT; 10 мг DTT на 1 мл SDS буфера для уравновешивания). Растворите DTT в 4 мл SDS буфера для уравновешивания.
      2. Взвесить IAA (иодацетамида, 25 мг ИУК на 1 мл SDS буфера для уравновешивания).Растворите IAA в 4 мл SDS буфера для уравновешивания.
      3. Melt 1 мл герметизирующие раствора агарозы в водяной бане для последующего использования.
      4. Если полоски были заморожены, позволяют им оттаять полностью. Поместите полоски сторону геля вверх в лоток reswelling. Добавляют 4 мл SDS буфера для уравновешивания с ДТТ в каждой полосе и инкубировать в течение 15 мин при осторожном встряхивании.
      5. Слейте все уравновешивающим буфером SDS с DTT. Добавляют 4 мл SDS буфера для уравновешивания с МАА в каждой полосе и инкубировать в течение еще 15 мин при осторожном встряхивании. После уравновешивания с буфером IAA, нальет уравновешивающим буфером SDS.
    2. SDS-PAGE
      1. Берем мини - гели, снимите расческу и промыть гель и лунки с DDH 2 O. Удалите белую ленту в нижней части геля перед запуском. Сориентируйте полосу на геле правильно, ориентация гель имеет решающее значение для точечной резки.
      2. Поместите квартиру гель на прилавке с небольшую тарелку вверх и гель верхней стороной электроннойxperimenter. Положите полоску на высокую тарелку с конца анодной (++ заканчивается с штрих-кодом) с видом на левую сторону геля. С помощью линейки, медленно толкать полосу вниз на поверхность геля. Избегайте образования пузырьков между полосой и гелем. Выдерживают гель вверх в стеклянной пластине стенда.
      3. Добавить 1 мл горячего раствора агарозы запечатывание к открытию кассеты. Убедитесь, что все пузырьки воздуха выдавливается с помощью плоской линейки. Собрать аппарат и запустить гель при постоянной 125 В в течение 90 мин.
      4. Когда гель завершения работы, поместите гель на биомолекулярной томографа с 2 мл DDH 2 O и сканировать гель в режиме обнаружения флуоресценции с лазерным возбуждением 635 нм и 665 нм фильтром эмиссии.
    3. фосфопротеином Окрашивание
      1. Закрепить гель с 50% метанола и 10% -ной смеси уксусной кислоты (10 мл) в течение 30 мин дважды. Промывают 10 мл воды в течение 10 мин три раза, и пятно с 10 мл фосфопротеинкиназы пятно в течение 60 - 90 мин, а затемОбесцвечивание с 10 мл раствора destain в течение 30 минут три раза.
      2. Мытье с 10 мл воды 5 мин дважды и изображение геля с помощью сканера гель-лазера при 532 нм / 560 нм возбуждения / испускания.
    4. Переваривания белков и идентификации
      1. Акцизной все дифференциально экспрессированные белки пятна из геля в лунки микропланшета с использованием роботизированного спот-подборщика в соответствии с инструкциями производителя, и добавляют 100 мМ бикарбоната аммония (2 мл) в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы destain гелевые части. Высушить с 2 мл 100% ацетонитрила моют два раза и сушат в вакуумном концентраторе в течение 30 мин.
      2. Увлажняет кусочки геля с помощью 100 мкл 13 нг / мкл модифицированного свиного трипсина в 50 мМ бикарбоната аммония в течение 16 ч при 37 ° С. Собирают супернатанты и далее извлекать белки со 100 мкл 5% -ной трифторуксусной кислоты в 50% ацетонитрила в течение 30 мин.
      3. Концентрат пептидов до 5 мкл с помощью вакуумной центрифуге ОБОГАЩЕНИЯrator и анализировать с матрицей лазерной десорбцией Ионизация - Время полета - тандем масс - спектрометрического анализа (MALDI TOF-MS / MS) 17.

7. In Vitro киназы

  1. Получение подложках
    1. Sub-клон Комплекс I (CI) субъединицами (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6 и NDUFA12), которые определены как дифференцированно фосфорилированных мишеней CDK1, в pGEX-5X-1 вектор для генерации глутатион-S-трансферазы (GST) -tagged бактериальная экспрессия плазмид 11. Очищают CI субъединиц с использованием высокого сродства глутатиона столбцы следующие ниже протокола.
      1. Культура GST-меченый CI - субъединицу , не содержащий кишечной палочки штамма BL-21 в Лурии-Бертани (LB) бульоне с 50 мкг / мл ампициллина , в шейкере при 37 ° С до оптической плотности (ОП) было достигнуто 0,6. Добавить изопропил-Bd-тио-галактопиранозида (IPTG) к культуЮр при конечной концентрации 0,1 мМ и инкубируют еще в течение 3 часов.
      2. Центрифуга при 600 мкг в течение 10 мин, чтобы собрать бактерии и повторно приостанавливать в 5 мл 1 х PBS буфера, содержащего 5 мМ ДТТ, 1 х ингибитор протеиназы коктейлем, и 0,1% лизоцим. Лизиса клеток путем обработки ультразвуком в течение двадцати 5 с очередями, и удалить остатки клеток центрифугированием при 600 х г в течение 10 мин.
      3. Собирают супернатант и инкубировать с глутатион-агарозных 4B бусин в объемном соотношении 4: 1 (надосадочной: Шарик) в течение 1 ч при комнатной температуре.
      4. Элюируйте GST-слитые белки из гранул с 3 мл глутатион буфера для элюции (10 мМ восстановленного глутатиона в 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0) и подвергают Элюированные белки диализу в молекулярной пористой мембранной трубки (молекулярная масса отсечки 12 -14 кД) с 1 х PBS / 1 мМ ЭДТА. Храните очищенные белки при - 80 ° С.
  2. Cdk1 киназы
    1. До начала киназы задницуау, установить нагревательные блоки до 30 ° C и 100 ° C. Оттепель коммерческий CyclinB1 комплекс ферментов и субстратов на льду / Cdk1.
    2. Подготовка реакционной смеси на льду. Так как 32 P АТФ изотоп участвует, подготовить все реакционные смеси в 1,5 мл пробирок с винтовыми крышками , содержащими кольца O , чтобы предотвратить распространение радиоактивности.
      Внимание: Соблюдайте правила радиационной защиты материала. Используйте толщиной 8 мм оргстекла экранирование и работу по крайней мере, на расстоянии вытянутой руки. Протрите любую загрязненную область с водой.
    3. Приготовьте реакционного буфера 30 мкл , содержащем 1 х Cdk1 буфер (50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 2 мМ ДТТ, 1 мМ EGTA, 0,01% Brij 35, рН 7,5), 0,6 мМ холодного АТФ, 0,1 мкКи 32Р АТФ, 2 единицы CyclinB1 / Cdk1 и 6 мкг белка субстрата. Отрегулируйте громкость до 30 мкл с DDH 2 O. Для получения положительной контрольной реакции, замените субстрат с 0,01 мМ гистона H1, хорошо известного CyclinB1 / Cdk1 подложке.
      1. Для получения отрицательного Controл реакции, (1) заменить субстрат с GST белка только и (2) заменить субстрат с 0,01 мМ гистона H1 + 0,5 мкМ RO-3306, селективного ингибитора CDK1.
    4. хорошо перемешайте с пипеткой и центрифугу, чтобы принести всю жидкость в нижней части трубки, сводя к минимуму риск загрязнения. Инкубируют при 30 ° С в течение 60 мин.
    5. Добавить 6 мкл 5х буфера для образцов SDS , чтобы остановить реакцию , и денатурации при 100 ° С в течение 10 мин. Выполнить образцов на 10% -ном SDS-PAGE при 160 V в течение 2 часов, или до тех пор, пока фронт красителя достиг конца геля. Перенесите гель на хроматографическую бумагу и обернуть полиэтиленовой пленкой.
      Внимание: Все жидкости в контакте с радиоизотопы должны рассматриваться как радиоактивные отходы и утилизировать в поли бутыль 5-галлона предоставляемых услуг в области здравоохранения и безопасности окружающей среды в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
    6. Expose гель для рентгеновской пленки в течение 1 дня или до 1 недели при температуре -20 ° С в зависимости от удельной активности радиоизотопныеи фермент.

8. сайт-направленного мутагенеза, чтобы генерировать доминантный негативный Cdk1 (D146N)

  1. Дизайн мутагенеза праймеров; Два праймера, комплементарные друг другу, содержащим мутантный сайт (G будет заменен нуклеотидную для кодирования N вместо D аминокислоты) фланкированного 20 оснований на каждой стороне 11.
  2. Готовят 50 мкл полимеразной цепной реакции (ПЦР) , содержащей 1х реакционного буфера, 2,5 мМ дНТФ, 10 мкМ праймеров (вперед и назад), 40 нг матрицы, и DDH 2 O. Добавить 2,5 ед ДНК полимеразы в реакцию.
  3. Выполните следующую программу ПЦР: 95 ° C 3 мин, 95 ° C 30 сек, 55 ° C 30 мин, 68 ° C 6 мин; 16 циклов (Примечание: 68 ° C Время инкубации определяется размером ДНК 1 мин / кб требуется для ДНК ≤ 10 кбайт для увеличения ДНК, 2 мин / кбайт плюс 10 секунд за один цикл..). Следуйте на 68 ° C 7 мин и удерживать при 4 ° С до готовности к использованию.
  4. Добавить2 мкл ДПН I рестриктазы (10 ед / мкл) и 5,7 мкл DPN Я буфер, хорошо перемешать с нежным крана с пальцем и инкубировать реакции при 37 ° С в течение 1 часа.
  5. Передача 10 мкл Dpn I обработанных продуктов ПЦР в 50 мкл компетентных клеток DH5 & alpha для трансформации. Инкубируют на льду в течение 30 мин, а затем 45 сек теплового шока при 42 ° С и 5 минут на льду. Добавьте 500 мкл LB и встряхивают при температуре 37 ° С в течение 1 ч перед металлизированный на LB-агар пластин. Выдержите O / N при 37 о С.
  6. Выберите колонию из O / N выращивают агаром с использованием стерильного желтый наконечник пипетки, падение наконечник в пробирку , содержащую 5 мл LB, и расти O / N в C шейкере 37 °. Изолировать плазмиды с использованием набора минипрепаративную и последовательность плазмиды для подтверждения мутации в соответствии с протоколом производителя.

9. Определение фазы клеточного цикла Длины с EDU инкорпорации Пробирной

  1. сортировки клеток
    1. Трansfect 2 х 10 5 клеток с указанными векторами (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-масс-ОПП или MTS-Cdk1-дп-RFP) в 6-луночного планшета с использованием 1: 2 (вес: v , 2,5 мкг: 5 мкл) соотношение ДНК: Трансфекция Реагент смесь, полученную в 2,5 мл serum- и антибактериальной свободной культуральной среды в течение 48 часов. Живые клетки сортировки, стабильно экспрессирующих GFP-меченый Cdk1 и RFP меченых белков CyclinB1 с помощью проточной цитометрии.
      1. Вымойте клеток с 1 х PBS, добавляют 100 мкл трипсина в чашку и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 5 мин. Добавляют 2 мл культуральной среды для сбора клеток и передавать их через фильтр с диаметром 70 мкм, чтобы сформировать одноклеточной суспензии. Промыть одноклеточной суспензии с 500 мкл 1% фетальной телячьей сыворотки в PBS (FCS / PBS) перед их загрузкой на проточном цитометре.
      2. Настройка параметров сортировки следующие протоколы : 18 , установленных стробирования для двойных положительных клеток , окрашенных с обоими GFP и RFP. Собирают отсортированные клетки выходят из цитометра в трубку содернин среда для культивирования клеток и использовать эти клетки для анализа прогрессии клеточного цикла с маркировки EDU импульсов погоня, как в протоколе 9.2.
  2. Измерение длины клеточного цикла с использованием анализа Edu Этикетировочное проточной цитометрии
    1. Семенной сортируется клетки в 6-луночные планшеты при плотности 2,5 × 10 5 клеток на лунку и культуры O / N при 37 ° С в СО 2 инкубаторе. Добавить ОБР в культуральной среде при конечной концентрации 25 мкМ. Инкубировать при 37 о С в СО 2 инкубаторе в течение 1 часа.
    2. Вымойте клеток с 1% BSA в 500 мкл PBS и собирают их в 1,5 мл пробирку с 2 интервалами ч в общей сложности 10 - 12 часов.
    3. Центрифуга клетки при 350 мкг в течение 5 мин, отбросить супернатант. Выбить гранул путем добавления 100 мкл раствора (фиксирующей предоставленного производителем в комплекте маркировки EDU) в течение 15 мин при комнатной температуре и хорошо перемешать.
    4. Промыть клетки с 1 мл 1% BSA в PBS, в три раза. ЗакрепитьКлетки снова с 0,5 мл 70% этанола O / N при 4 о С.
      Примечание: фиксация Этанол имеет решающее значение для гашения внутренней GFP / RFP флуоресценции из-за экспрессии рекомбинантного меченого белка.
    5. Центрифуга клетки снова при 350 мкг в течение 5 мин и промывают осадок с помощью 1 мл 1% BSA в PBS один раз. Повторное приостановить клеток в 1 мл пермеабилизации буфера (0,1% Тритон-Х-100, 1% БСА, 0,2 мг / мл РНКазы А на PBS) в течение 20 мин при комнатной температуре.
    6. Промыть клетки с 1 мл 1% БСА в PBS один раз. Добавить 0,5 мл реакционного коктейля в каждую пробирку и хорошо перемешать. Инкубируют реакционную смесь при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте.
    7. Промыть 1 мл 1% BSA в PBS один раз и ДНК пятна с 50 мкг / мл пропидиума йодида (PI) в 1 мл 1% BSA в PBS.
    8. Анализ клеток с помощью проточной цитометрии следовать Edu-позитивного населения. Присутствует разброс точек участок Edu-меченых клеток окрашиваются по содержанию ДНК (PI окрашивания, по оси Х) и Эду (Alexa 647 окрашивания, Y-оси).
      1. Используйте APC канал для Alexa647-EDU с использованием фильтра верхних частот 670/30 полосы со всеми света представлено менее 685 нм, что фильтр удара; и фикоэритрин канал (PE) для PI с фильтра нижних частот 581/15 полосы перед ним со всеми света представлено менее 600 нм удара этот фильтр.
      2. Вставьте первую пробирку, содержащую клетки в проточной цитометрии и использовать стандартную стратегию стробирования для приобретения: Участок FSC-Area X SSC-зона для морфологии с последующим PI (PE) канал X Alexa647-Edu (APC канал) для окрашивания клеток. Запись данных для всех трубок один за другим, приобретающего 10000 событий в выборке.
      3. Определить распределение фазы клеточного цикла клеток и длины фазы с использованием проточной цитометрии программного обеспечения для анализа данных в соответствии с установленными протоколами 11,30.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Суб-митохондриальной локализации CyclinB1 и Cdk1

экстракция Карбонат натрия используется для определения того, является ли белок, расположенный внутри митохондрий или на наружной поверхности, а именно наружной мембраны. После того, как белок показан для локализации внутри митохондрий, дальнейшее определение суб-митохондриальной локализации может быть сделано с помощью mitoplasting в сочетании с протеазы пищева...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Как и белки , предназначенные для других внутриклеточных органелл, митохондриальные белки обладают мишенью таргетингом сигналы в их первичной или вторичной структуры , которые направляют их органеллы с помощью сложного белка транслокации и складных машин 21,22. Митохондрии нацеливающие последовательности (MTS) , полученные из исключительно митохондриальных белков - резидентов , таких как COX8 могут быть добавлены к N-концу любой последовательности гена целевой специфических белков в митохондрии 11,23,24....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами NIH CA133402, CA152313 и Управлением науки Министерства энергетики DE-SC0001271. Мы благодарим Лабораторию общих ресурсов проточной цитометрии Калифорнийского университета в Дэвисе, финансируемую CA0933730 NCI P30, и гранты NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 и S10 RR 026825, а также техническую помощь г-жи Бриджит Маклафлин и г-на Джонатана Ван Дайка за их помощь в проведении экспериментов по проточной цитометрии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
32P ATP PerkinElmerBLU002001MC 
Антимышиное вторичное антителоInvitrogen A-11003Alexa-546 конъюгированное
вторичное антитело против кроликаInvitrogen A11029Alexa-488 конъюгированный
АТФResearch Organics1166AДля анализа in vitro киназы
антитела Cdk1Технология клеточной сигнализации9112
Cdk1 киназный буферNew England BiolabsP6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging KitLife TechnologiesC10337Для анализа клеточного цикла с мечением
EdUТехнологияклеточной сигнализацииIV 4844SДля иммуноокрашивания митохондрий
Антитела к циклину B1Santa Cruz Biotechsc-752
Комплекс ферментов CyclinB1/Cdk1New England BiolabsP6020SИзбегайте замораживания/размораживания
CyDye DIGE Набор для мечения фторомHealthcare Life Sciences25-8009-83
Гель DIGE и буферный набор DIGE GE Здравоохранение Медико-биологические науки28-9480-26 Диметилформамид AA
 Sigma Aldrich319937DMF
DithiothreitolBio-Rad161-0611DTT
dNTPEMD Millipore71004Для сайт-направленного мутагенеза
Dpn I ферментСтратаген200519-53Для сайт-направленного мутагенеза
Жидкость для покрытия сухой полоскиGE Healthcare Life Sciences17-1335-01Используется в качестве минерального масла
ЭДТАJ.T. Baker4040-03
EGTAAcros Organics409910250
Eppendorf Vacufuge ConcentratorFisher Scientific07-748-13Используется в качестве концентратора вакуумных центрифуг
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01Монтажный раствор против выцветания
Fortessa Flow CytometerBD Biosciences649908Для клеточного цикла анализ с мечением EdU
Histone H1Calbiochem382150Для анализа in vitro киназы
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704Для очистки фрагментов ДНК из агарозных гелей
Immobiline DryStrip GelsGE Healthcare Life Sciences18-1016-61IEF (изоэлектрическая фокусировка) полоски
Immobilized GlutathioneThermo Scientific15160Глутатион-агарозные шарики
ЙодоацетамидСигма ОлдричI1149IAA
IPGphor 3 Изоэлектрическая фокусирующая единицаGE Healthcare Life Sciences11-0033-64IPGphor держатели полосок
Изопропил-b-D-тио-галактопиранозид RPI Corp156000-5.0IPTG
ЛейпептинSigma AldrichL9783Для буфера для лизиса клеток
Lipofectamine 2000Life Technologies11668027Реагент для трансфекции
ЛизинSigma AldrichL5501Для мечения CyDye
ЛизоцимEMD Chemicals5960
Mitoctracker Red/GreenInvitrogen M7512/M7514Митохондриальные флуоресцентные красители
MOPSEMD Chemicals6310
pEGFP-N1Clonetech6085-1GFP-экспрессирующий вектор
PfuStratagene600-255-52
pGEX-5X-1 GE Healthcare Life Sciences28-9545-53GST-экспрессирующий вектор
фенилметилсульфонилфторидShelton ScientificIB01090PMSF
фосфат буферный физиологический растворLife Technologies14040PBS
Spectra/Por 4 диализная трубкаSpectrum Labs132700в виде пористой мембранной трубки для диализа
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel StainLife TechnologiesP-33300Для окрашивания фосфопротеинов на 2D гелях
Коктейль ингибиторов протеиназыCalbiochem539134Для буфера для лизиса клеток
QuikChange набор для сайт-направленного мутагенезаStratagene200519-5
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104MiniPrep Набор для изоляции плазмид
RO-3306Alexis Biochemicals270-463-M001Ингибитор Cdk1
RotenoneMP Biomedicals150154Комплекс I
Карбонат натрияFisher ScientificS93359
Хлорид натрияEMD ChemicalsSX0420-5Для буфера для лизиса
клеток Ортованадат натрияMP Biomedicals159664Для буфера для лизиса клеток
Пирофосфат натрия декагидратAlfa Aesar33385Для лизиса клеток Буфер для лизиса
натрия β-глицерофосфатAlfa AesarL03425Для буфера для лизиса клеток
SpectraMax M2e Молекулярные приборыM2EСчитыватель микропланшетов
СахарозаFisher Scientific57-50-1
Измельчитель тканей ПестикKimble Chase885301-0007Для выделения митохондрий
Трубка для измельчителя тканейKimble Chase885303-0007Для выделения митохондрий
раствор трихлоруксусной кислотыSigma AldrichT0699TCA
TrisMP Biomedicals103133
Triton-x-100TeknovaT1105
ТрипсинCalbiochem650211
Typhoon ImagerGE Healthcare Life Sciences28-9558-09Лазерный гелевый сканер для 2D-DIGE
UbiquinonSigma AldrichC7956
антител ЦОГ GE

Ссылки

  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12 (6), 658-665 (2000).
  3. Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26 (2), 301-310 (2007).
  4. Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17 (11), 563-569 (2007).
  5. Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
  6. Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221 (3), 1027-1043 (1991).
  7. Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197 (3), 563-576 (1991).
  8. Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29 (4), 499-515 (2006).
  9. Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 1930-1935 (2010).
  10. Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40 (3), 356-361 (2008).
  11. Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29 (2), 217-232 (2014).
  12. Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123 (6), 1010-1016 (1998).
  13. Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3'-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52 (4), 433-440 (2011).
  14. Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58 (1), 45-52 (2004).
  15. Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic 'click' reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49 (1), 525-527 (2010).
  16. Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3 (9), 1758-1766 (2003).
  17. Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. , Unit 10.25(2009).
  18. Davies, D. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. Macey, M. G. , Humana Press. 257-276 (2007).
  19. van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
  20. Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1 (2), 859-869 (2006).
  21. Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353 (5), 1011-1020 (2005).
  22. Karniely, S., Pines, O. Single translation--dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6 (5), 420-425 (2005).
  23. Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5 (3), 166-175 (2013).
  24. Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5 (8), e12341(2010).
  25. Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73 (7), 626-636 (2008).
  26. Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13617-13622 (1996).
  27. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  28. Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382 (3), 669-678 (2005).
  29. Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8 (23-24), 4886-4897 (2008).
  30. Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. , (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Киназа Cdk1митохондриальная гиперэкспрессия2D-DIGE анализанализ с использованием EdU-маркировкипроточная цитометрияэкстракция карбонатом натриясубмитохондриальное фракционированиемитохондриальная последовательность таргетированияанализ пролиферации клеток
Экспериментальные подходы к изучению Митохондриальная локализации и функции цикла ядерных клеток киназа, CDK1
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.