Method Article

Экспериментальные подходы к изучению Митохондриальная локализации и функции цикла ядерных клеток киназа, CDK1

DOI:

10.3791/53417

⸱

February 25th, 2016

 ,  ,  , 
1Radiation Oncology, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем, как изучать митохондриальную локализацию киназы (клеточного цикла) и как определить ее субмитохондриальное расположение, а также потенциальные митохондриальные субстраты/мишени. Принудительная экспрессия белков в митохондриях является полезным инструментом для изучения функциональных последствий митохондриальной локализации интересующего белка.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя митохондрии обладают собственным транскрипционным механизмом, только 1% митохондриальных белков синтезируется внутри органеллы. Ядерно-кодируемые белки транспортируются в митохондрии в соответствии с их митохондриальными целевыми последовательностями (MTS); однако у большинства митохондриальных локализованных белков отсутствует идентифицируемая MTS. Тем не менее, тот факт, что MTS может инструктировать белки проникать в митохондрии, является ценным инструментом для изучения митохондриальных функций нормально ядерных и/или цитоплазматических белков. Недавно мы идентифицировали комплекс киназы клеточного цикла CyclinB1/Cdk1 в митохондриях. Для изучения митохондриальных функций этого комплекса было важно обеспечить сверхэкспрессию митохондрий и нокдаун этого комплекса без вмешательства в его ядерные или цитоплазматические функции. Пометив CyclinB1/Cdk1 с помощью MTS, мы смогли достичь митохондриальной сверхэкспрессии этого комплекса для изучения его митохондриальных мишеней, а также функций. Путем маркировки доминантно-негативного Cdk1 с помощью MTS было достигнуто ингибирование активности Cdk1, особенно в митохондриях. Потенциальные митохондриальные мишени комплекса CyclinB1/Cdk1 были идентифицированы с помощью протеомного подхода на основе геля. В отличие от традиционного 2D-анализа геля, мы использовали технологию двумерного разностного гель-электрофореза (2D-DIGE) с последующим окрашиванием фосфопротеинов для флуоресцентного мечения дифференциально фосфорилированных белков в митохондриальных клетках, экспрессирующих Cdk1. Идентификация фосфопротеиновых пятен, которые были изменены в диком типе по сравнению с доминирующими отрицательными митохондриями, несущими Cdk1, выявила идентичность митохондриальных мишеней Cdk1. Наконец, чтобы определить влияние митохондриальной локализации CyclinB1/Cdk1 на прогрессию клеточного цикла, был использован анализ пролиферации клеток с использованием синтетического аналога тимидина EdU (5-этинил-2'-дезоксиуридин) для мониторинга клеток по мере их прохождения через клеточный цикл и репликации их ДНК. В целом, мы продемонстрировали разнообразие доступных подходов к изучению митохондриальной локализации и активности киназы клеточного цикла. Это передовые, но простые в использовании методы, которые будут полезны для многих исследователей в области клеточной биологии.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У млекопитающих, прогрессию клеточного цикла зависит от высокоупорядоченных событий , контролируемых циклинов и циклин-зависимых киназ (CDKS) 1. Благодаря его цитоплазматическом, ядерной и центросомной локализации, CyclinB1 / Cdk1 способен синхронизировать различные события в митозе , таких как пробой ядерной оболочки и центросом разделения 2. CyclinB1 / Cdk1 защищает митотических клеток от апоптоза 3 и способствует митохондриальной деления, критический шаг для равномерного распределения митохондрий вновь образованных клеток дочь 4.

В пролиферирующих клетках млекопитающих митохондриальной АТФ генерируется с помощью окислительного фосфорилирования (OXPHOS) машины (цепи переноса электронов), который состоит из 5 из множества субъединиц комплексов; Комплекс I - комплекс V (CI-CV). Никотинамидадениндинуклеотид (NADH): убихинон оксидоредуктазы или комплекс I (CI) является самым крупным и наименее изученной из пяти комплексов 5. Комплекс сonsists из 45 субъединиц, 14 из которых образуют каталитическую сердцевину. После сборки, комплекс предполагает L-образную конструкцию с одной рукой , выступающая в матрице , а другой рукой внедренного во внутреннюю 6,7 мембраны. Мутации в CI субъединиц являются причиной множества митохондриальных нарушений 8. Функционально эффективность CI в OXPHOS требуется не только для общего митохондриального дыхания 9, но и для прогрессии цикла успешно клеток 10. Unravelling механизмы, лежащие в основе функционирования этой мембраносвязанного ферментного комплекса в отношении здоровья и болезни может способствовать разработке новых диагностических процедур и передовых терапевтических стратегий. В недавнем исследовании мы обнаружили, что CyclinB1 / комплекс Cdk1 транслоцируется в митохондрии в G2 (митоза) M фазы (Gap 2) / и фосфорилирует CI субъединиц для расширения производства митохондриальной энергии, потенциально, чтобы компенсировать повышенные энергетические потребности клеток во время клеточного цикл 11. Здесь мы шоwcase экспериментальных процедур и стратегий, которые могут быть использованы для изучения митохондриальной транслокацию в противном случае ядерных / цитоплазматические киназ, их митохондриальных субстратов, а также функциональные последствия их митохондриальной локализации с использованием CyclinB1 / Cdk1 в качестве примера.

К выводу, что CyclinB1 / комплекс Cdk1 транслоцируется в митохондрии при необходимости побудила исследования митохондриальной специфических оверэкспрессии и нокдаун этого комплекса. Для достижения митохондрии специфических экспрессию белков, можно добавить последовательность митохондрии ориентации (MTS) в N-конце белка, представляющего интерес. Митохондрии таргетингом последовательности позволяют сортировку митохондриальных белков в митохондрии , где они обычно проживают 12. Мы использовали таргетирования последовательность 87 оснований митохондрии, полученный из предшественника человеческого цитохром с оксидазы субъединиц 8А (COX8) и клонируют его в зеленый флуоресцентный белок (GFP) -tagged CyclinB1 или красный флуоресцентныйПротеин (ЗП) -tagged Cdk1, содержащих плазмид в кадре. Этот метод позволил нам целевой CyclinB1 и Cdk1 в митохондрии, в частности, изменение митохондриальной экспрессии этих белков, не затрагивая их ядерный пул. По флуоресцентно мечения эти белки, мы были в состоянии контролировать их локализацию в режиме реального времени. Кроме того, мы ввели MTS в плазмиду, содержащую RFP-меченый доминирующим отрицательным Cdk1, что позволило нам конкретно сбить митохондриальную экспрессию и функции Cdk1. Важно различать митохондриальных и ядерных функций киназ, которые имеют двойное локализаций как Cdk1. Инжиниринг МТС в N-терминала этих двойных функциональных киназ предлагает большую стратегию, которая легко использоваться и эффективно.

Поскольку Cdk1 является клеточного цикла киназы, она имеет фундаментальное значение для определения прогрессии клеточного цикла, когда Cdk1 локализована в митохондриях. Для достижения этой цели мы использовали новую метоd контролировать содержание ДНК в клетках. Традиционные методы включают использование BrdU (бромдеоксиуридина), синтетический аналог тимидина, который встраивается в вновь синтезированной ДНК в фазе S клеточного цикла, чтобы заменить тимидина. Затем клетки, которые активно дублирующие их ДНК могут быть обнаружены с помощью анти-BrdU антителами. Одним из недостатков этого способа состоит в том , что она требует денатурации ДНК , чтобы обеспечить доступ к антителу BrdU с помощью жестких методов , таких как кислоты или термической обработки, что может привести к несоответствию между результатами 13,14. В качестве альтернативы, мы использовали аналогичный подход для наблюдения за активно делящиеся клетки с различным аналоговым тимидина, Эду. Обнаружение Эду не требует резкой денатурации ДНК, как мягкая обработка моющее средство позволяет реагент обнаружения для доступа к Эду во вновь синтезированной ДНК. Метод Эду оказался более надежным, последовательным и с потенциалом для анализа с высокой пропускной способностью 15.

И, наконец, тO определяют митохондриальных субстратов Cdk1, мы использовали инструмент под названием протеомики 2D-ПГЛП, который является продвинутой версией классического двухмерным электрофорезом в геле. Двумерный электрофорез разделяет белки по их изоэлектрической точке в первом измерении и молекулярной массой во второй. Так как пост-трансляционной модификации, такие как фосфорилирование влияет на изоэлектрической точки и молекулярную массу белков, 2D гели могут обнаружить разницу между фосфорилирования статусов белков в составе различных образцов. Размер (площадь и интенсивность) белка видит изменения с уровнем экспрессии белков, что позволяет количественное сравнение между несколькими образцами. Используя этот метод, мы смогли дифференцировать фосфорилированные белки дикого типа в сравнении с мутантным митохондрии, ориентированных CDK1 экспрессирующих клеток. Специфические белковые пятна, которые показали в дикого типа, но отсутствовавшие в митохондриях таргетингом мутантного препарата CDK1 были выделены иидентифицировали с помощью масс-спектрометрии.

В традиционных 2D-гелей, Трифенилметановые красители используются для визуализации белков на геле. 2D-ПГЛП использует флуоресцентный белок этикетки с минимальным влиянием на электрофоретической подвижности белка. Различные образцы белка могут быть помечены различными флуоресцентными красителями, смешивались и разделенных одинаковыми гелями, что позволяет совместное электрофорез нескольких образцов на одном геле 16. Это минимизирует гель-на-гель вариаций, что является серьезной проблемой в гель на основе протеомики исследований.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Выделение Митохондрии из культивируемых клеток

  1. Получение изоляции буфера для клеток (IBC) буфера
    1. Готовят 0,1 М Трис / МОПС (трис (гидроксиметил) / 3- (N -morpholino) пропансульфокислоты): Растворить 12,1 г Трис в 800 мл дистиллированной воды, довести рН до 7,4 с помощью MOPS порошок, добавляют дистиллированную воду до общего объем 1 л и хранить при температуре 4 ° С
    2. Готовят 0,1 М EGTA (этиленгликоль-бис (2-аминоэтил эфир) этилендиаминтетрауксусной кислоты) / Трис: Растворить 38,1 г EGTA в 800 мл дистиллированной воды, довести рН до 7,4 с помощью Tris порошок, добавляют дистиллированную воду до общего объема 1 л и хранить при температуре 4 ° С.
    3. Готовят 1 М сахарозе: Растворить 34,23 г сахарозы в 100 мл дистиллированной воды, делают по 20 мл аликвоты и хранят при -20 ° С
    4. Подготовьте IB гр буфера: Приготовить 100 мл IB C буфер добавлением 10 мл 0,1 М Трис / MOPS и 1 мл 0,1 М EGTA / Трис до 20 мл; 1 М сахарозы. Добавить дистиллированную воду до общего объема 100 мл. Регулировка рН до 7,4.
  2. Подготовка буфера для лизиса клеток
    1. Подготовка буфера для лизиса, содержащего 20 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА (этилен диамино этилендиаминтетрауксусной кислоты), 1 мМ EGTA, 1% Тритон-Х-100, 2,5 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ β- глицерофосфат, 1 мМ ортованадат натрия. Добавить ингибиторы протеиназы 1 мкг / мл лейпептина и 1 мМ PMSF (фенилметилсульфонилфторид) непосредственно перед использованием.
  3. Выделение Митохондрии
    1. Урожай 3 х 10 7 клеток охлажденным льдом 1x PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), рН 7,4 и центрифугируют клетки при 600 мкг в течение 10 мин при 4 о С. Жидкость над осадком сливают и вновь приостановить осадок в 5 мл охлажденного льдом буфера И.Б. гр.
    2. Перемешать клеток с использованием измельчителя ткани стекло / стекло в течение примерно 10 мин. Передача гомогената в 15 мл пробирку и центрифугируют при 600 х г в течение 10 мильп при 4 о С. Для функционального митохондриях, используйте стекло / тефлоновую муфту, как это менее вредно для митохондрий, чем мясорубки ткани стекла / стекла.
    3. Соберите супернатант в 1,5 мл пробирки и центрифуге при 7000 мкг в течение 10 мин при 4 о С. Передача супернатант в 1,5 мл пробирку и сохранить как цитозоле белка.
    4. Промывают осадок (митохондрии) дважды 200 мкл охлажденного льдом буфера IB гр и центрифуге при 7000 х г в течение 10 мин при 4 о С.
    5. Удалите супернатант и повторно приостанавливать осадок в буфере для лизиса клеток и использовать его сразу или хранить при температуре -80 ° С для дальнейшего использования. Если необходимы функциональные митохондрии, повторно приостанавливать осадок в оставшейся буфера после удаления надосадочной жидкости. Разбавление митохондриальной фракции далее может привести к потере функции митохондрий. Хранить на льду и использовать препарат в течение 1 - 3 ч для достижения наилучших результатов.
    6. Разрушать ультразвуком ресуспендировали осадок в течение тридцати-3 сек всплесков вледяная баня, центрифуге при 10000 мкг в течение 5 мин, и сохраните супернатант в качестве митохондриальной фракции.

2. Со-иммунное CDK1, CyclinB1 и COXIV, белок митохондриальной Resident

  1. Grow 5 х 10 4 клеток на покровные в 24-луночные планшеты O / N или до 70% слияния. Аспирируйте среды и промыть клетки дважды 500 мкл охлажденного льдом 1 х PBS, рН 7,4.
  2. Закрепить клетки с 500 мкл охлажденного на льду 4% параформальдегида при комнатной температуре в течение 10 мин. Аспирируйте фиксирующий раствор и промыть клетки с 500 мкл 1 х PBS 3 раза, 5 мин каждая при осторожном встряхивании при комнатной температуре.
  3. Клетки проницаемыми с 0,2% Тритона Х-100 в 500 мкл PBS в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте раствор и промыть клетки 3 раза, 5 мин каждый с 500 мкл PBS. Добавить блокирующий раствор (500 мкл, 1% БСА (бычий сывороточный альбумин) в PBS, содержащем 1% Tween 20) в течение 30 мин при комнатной температуре.
  4. Развести первичных антител 1: 250 (по объему) в 5001; л блокирующего раствора и инкубировать клетки с желаемыми первичными антителами, индуцированными у разных видов, чтобы избежать перекрестной передачи сигналов (CyclinB1 (мышь) и COXIV (кролик) или Cdk1 (мышь) и COXIV (кролик) при комнатной температуре в течение 30 - 60 мин или O / N при 4 о С.
  5. Промыть покровные с помощью 500 мкл 1 х PBS, 3 раза, 5 мин каждый раз, а затем инкубируют с вторичным антителом, разбавленное 1: 1000 в 500 мкл блокирующего раствора при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего промывали 500 мкл PBS 3 раза, 5 мин каждый.
  6. Установите покровные с 20 мкл анти-выцветанию решение для монтажа и герметизации слайдам с помощью лака для ногтей. Изображение слайды с помощью флуоресцентного микроскопа сразу же или держать в темноте при 4 ° С в течение 1 - 2 недель.

3. Карбонат натрия Извлечение неповрежденном Митохондрии

  1. Растут примерно 20 х 10 7 клеток, сбора урожая, мыть один раз PBS и изолировать митохондрии , как описано в разделе 1. Разделите митохондриальной изолирует на два номиналаTS до последнего центрифугирования для осаждения митохондрии (до стадии 1.3.4); сохранить половину для использования в качестве общего митохондрий (этап 3.2), использовать другую половину для извлечения карбоната натрия (следующие шаги 3.3-3.6), чтобы отделить растворимых и мембраносвязанных белков.
  2. Лизировать Всего митохондрии гранул с 30 мкл буфера для лизиса клеток и хранить лизат при -80 о С до использования в иммуноблоттинга.
  3. Добавить 250 мкл 0,1 М Na 2 CO 3 (карбонат натрия), рН 11,0, к другой половине митохондриальной гранулы и инкубировать на льду в течение 30 мин.
  4. Центрифуга при 100000 х г в течение 20 мин. Соберите супернатант и перейдите к шагу 3.5. Lyse осадок с помощью 30 мкл буфера для лизиса клеток и разрушать ультразвуком как на этапе 1.3.6. Хранить при температуре -80 ° С до использования в иммуноблоттинга.
  5. Добавить равный объем 20% свежеприготовленного трихлоруксусной кислоты (ТСА) к надосадочной жидкости для осаждения белков и держать на льду в течение 30 мин.
  6. ЦентробежнаяУГЭ при 15000 мкг в течение 10 мин. Жидкость над осадком сливают, растворить осадок в 80 мкл буфера для лизиса клеток и хранят при -80 ° С до использования в иммуноблоттинга.

4. Разделение внутренней и внешней мембранах митохондрий (Выделение Mitoplasts)

  1. Растут примерно 20 х 10 7 клеток, урожай, мыть один раз PBS и изолировать митохондрии , как описано в разделе 1. Отделите митохондриальных фракций на 10 равных частей до последнего центрифугирования для осаждения митохондрии (до стадии 1.3.4).
  2. Растворить каждую гранулу в 30 мкл указанной концентрации гипотонического буфера сахарозы (1 мМ ЭДТА, 10 мМ MOPS / КОН (гидроокись калия), рН 7,2; концентрация сахарозы в пределах от 25 - 200 мм), с добавлением или без 50 мкг / мл трипсина ( Таблица 1) и инкубировать в течение 30 мин на льду.
  3. Добавить 3 мкл 10 мМ PMSF (до конечной концентрации 1 мМ PMSF) с помощью трипсина, содержащим ампул, чтобы остановить тон усвоением трипсина и инкубировать на льду в течение 10 мин.
  4. Центрифуга при 14000 мкг при 4 ° С в течение 10 мин. Перенести супернатант в новую пробирку, лизировать осадок в 30 мкл буфера для лизиса клеток, разрушать ультразвуком , как на этапе 1.3.6, и хранят при -80 о С.

5. Построение Митохондрии ориентированных на GFP / RFP-меченый CyclinB1 / Cdk1 векторы и подтверждение их митохондриальной локализации

  1. Клонирование митохондрии таргетингом последовательность (МТС; полученный из предшественника человеческого цитохром с оксидаза субъединица 8А (COX8) между нуклеотидами 76 - 161) в кадре в N-конце GFP или RFP на NheI и BamHI сайты pEGFP-N1 или pERFP -n1 векторы с использованием стандартных методик молекулярного клонирования.
  2. При разработке ПЦР-праймеров для генов CyclinB1 и Cdk1, добавлять сайты ферментов рестрикции BamHI распознавания (полужирным шрифтом) к 5'-праймеров ПЦР.
    Форвард Cdk1 BamH15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
    Обратный CDK1 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG CAT СТТ СТТ ААТ CTG ATT
    Форвард CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG АТС CAA TGG CGC TCC GAG ТСА
    Обратный CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CTG CAC СТТ ТГК CAC AGC C
  3. Амплификации генов Cdk1 и CyclinB1 с использованием этих праймеров в соответствии со стандартными методами. Переваривать продукты ПЦР с 1 мкл рестриктазы BamHI при 37 ° С в течение 2 часов. Запуск переваривания продуктов на 1% агарозном геле. С помощью лезвия бритвы, вырезать правильные фрагменты -sized ДНК, и очищают ДНК из геля с использованием набора для экстракции геля.
  4. Дайджест 1 мкг МТС-pEGFP-N1 и MTS-pERFP-N1 плазмид с 1 мкл BamHI фермента при 37 ° С в течение 2 ч. Добавить 1 мкл теленок-INTESкишечные щелочной фосфатазы (МЦК) в течение 30 мин при 37 ° С. Запуск продуктов расщепления на агарозном геле 1% и очищают линейные плазмиды из геля, как описано в шаге 5.3.
  5. Настройка реакции лигирования путем добавления 1 мкл плазмиды со стадии 5.4 и 5 мкл Cdk1 или CyclinB1 со стадии 5.3 до 3 мкл лигазы буфера, 0,5 мкл T4 лигазы и 20,5 мкл дН 2 O. Выдержите O / N при температуре 4 ° С.
  6. Transform кишечной палочки компетентных клеток DH5 & alpha ; с 10 мкл смеси лигировани с помощью стандартной методики и выращивать бактерии на 10 мг / мл канамицина , содержащих LB агаром O / N при температуре 37 ° С для получения колоний.
  7. Выбирают колонию из O / N выращенных пластин с помощью стерильной пипетки, вставьте наконечник в 5 мл канамицина-LB, содержащей трубки и инкубировать O / N. Изолировать плазмиды использованием минипрепаративную комплекты в соответствии с протоколом производителя, и последовательность плазмиды с использованием стандартных методик.
  8. Трансфекцию экспоненциально растущей MCF10A клетки (1,5 × 10 4 клеток высевали на 96-луночные планшеты) с МТС-Cdk1-ОПП или МТС-CyclinB1-GFP плазмид с шагом 5,7 путем приготовления / соотношение реагента плазмидной трансфекции 1: 2 (w: V, 100 нг : 0,2 мкл) в 100 мкл serum- и среды антибиотик бесплатно.
  9. Инкубируйте клетки в плазмиде смеси / реагента в течение 48 ч при 37 ° С в СО 2 инкубатор с контролем влажности (5% СО 2, 95% относительной влажности).
  10. Готовят 1 мМ маточного раствора митохондриальных красного и зеленого флуоресцентных красителей путем растворения 50 мкг порошка в 100 мкл ДМСО. Разбавьте растворы 1: 400 в 1x PBS для получения 2,5 мкм рабочих растворов. Маточные растворы можно хранить при -20 ° С в течение года.
  11. Смешайте 2 мкл 2,5 мкМ красного красителя с 98 мкл культуральной среды для получения конечной концентрации 50 нМ.
  12. Заменить клеточной культуральной среды CyclinB1-GFP клеток, несущих MCF10A (генерируемых на этапе 5.8) с красным красителем, содержащую среду в течение 2 мин. ПовторитьТакая же процедура с зеленым красителем для Cdk1-RFP подшипник MCF10A клеток.
  13. Промыть два раза с 100 мкл 1 х PBS, чтобы избавиться от избытка раствора для окрашивания, добавляют 100 мкл 1x PBS в 96-луночного планшета.
  14. Визуализируйте митохондрии и CyclinB1-GFP (возбуждение 488 нм и эмиссии при 494 - 536 нм) и Cdk1-RFP (возбуждение 560 нм и эмиссии при 565 - 620 нм) на 96-луночные планшеты под флуоресцентным микроскопом при 40-кратном увеличении.

6. Идентификация дифференцированно фосфорилированных белков с помощью 2D-Dige

  1. Базовые приготовления
    1. Изолировать митохондрии и лизировать митохондриальные фракции, как в шаге 1.3. Добавить равный объем 20% ТХУ (трихлоруксусной кислоты в воде) к каждому образцу и вихря на 15 сек. Инкубируйте образцы на льду в течение 30 мин, как белки выпадают в осадок из раствора.
    2. Центрифуга образцов при 9300 х г при 4 ° С в течение 5 мин, удаления надосадочной жидкости, и добавить 60 мкл холодного ацетона (100%) с последующимцентрифугирование при 9300 х г при 4 ° С в течение 5 мин.
    3. Повторите шаг ацетон стирки (этап 6.1.2) еще один раз, удалить супернатант и повторно приостанавливать образцы в 50 мкл ПГЛП мечения буфера (7 М мочевина, 2 М тиомочевины, 4% CHAPS, 30 мМ Трис, рН 8,5).
  2. Подготовьте флуоресцентными красителями
    1. Подготовка маточного раствора: Растворите красители (5 нмоль) в 5 мкл свежей диметилформамида (ДМФ) до конечной концентрации 1 нмоль / мкл. Хранить раствор красителя запас при -20 ° С до использования в течение нескольких месяцев.
    2. Подготовка рабочего раствора: Разрешить красители устанавливать при комнатной температуре в течение 5 мин. Развести 1 мкл красителя с 4 мкл ДМФ до конечной концентрации 200 пмоль / мкл. Держать на льду во время использования. Примечание: Рабочий раствор можно хранить при -20 ° С в течение 3 -х недель.
  3. Этикетка Белки
    1. Смешайте 1 мкл рабочего раствора красителя, на 12,5 мкг белка. Масштабирование по мере необходимости. Для объединенных стандартов, добавьте 61, л су2 рабочего раствора до 300 мкг белка объединенных.
    2. Вихревые в течение 30 сек и центрифугировать при 4 ° С в течение 30 с при 12000 х г. Инкубируют на льду в темноте в течение 30 мин. Остановить маркировку путем добавления 1 мкл 10 мМ лизина на 1 мкл рабочего раствора, используемого. Хорошо перемешать и инкубировать на льду в темноте в течение 10 мин.
    3. Бассейн индивидуально помечены образцы и смешать с регидратации буфером (7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4% CHAPS, 1,2% destreak, 1% pharmalytes, бромфенол синий). Общий объем будет 125 мкл.
    4. Образцы Vortex в течение 30 сек и позволяют установить образцы при комнатной температуре в течение 30 мин. Нагрузка 125 мкл образцов на 7 см рН 4 - 9, изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) полосы.
  4. Первое измерение электрофорез
    1. Поместите держатели полосы (гробы) на электродной пластины, убедившись, что держатели полосы являются абсолютно чистыми и сухими. Пипетировать 125 мкл образцов в гроб, распространяясь равномерно по всему гробу.
    2. Использование выщипыватьRS, возьмите полоску ИЭФ, осторожно удалите защитную пластиковую защитную крышку, и поместите его (гель стороной вниз) в Гроб / регидратации буфера. Избегайте образования пузырьков. Медленно заполнить гроб с телом (1 - 1,5 мл) с минеральным маслом и поместить гроб покрывает на гробах.
    3. Начинают изоэлектрического фокусирования в соответствии с протоколом в таблице 2:
      Примечание: После того , как прогон завершения, полоски могут храниться в пластиковых пробирках при температуре -80 ° С или непосредственно перешли к уравновешивания и втором измерении.
  5. Второе измерение - додецилсульфата натрия в полиакриламидном геле (SDS-PAGE)
    1. уравновешивание
      1. Оттепель SDS буфера для уравновешивания (8 мл на полоски, 6 М мочевины, 30% глицерина, 2% SDS). Взвесить дитиотреитола (DTT; 10 мг DTT на 1 мл SDS буфера для уравновешивания). Растворите DTT в 4 мл SDS буфера для уравновешивания.
      2. Взвесить IAA (иодацетамида, 25 мг ИУК на 1 мл SDS буфера для уравновешивания).Растворите IAA в 4 мл SDS буфера для уравновешивания.
      3. Melt 1 мл герметизирующие раствора агарозы в водяной бане для последующего использования.
      4. Если полоски были заморожены, позволяют им оттаять полностью. Поместите полоски сторону геля вверх в лоток reswelling. Добавляют 4 мл SDS буфера для уравновешивания с ДТТ в каждой полосе и инкубировать в течение 15 мин при осторожном встряхивании.
      5. Слейте все уравновешивающим буфером SDS с DTT. Добавляют 4 мл SDS буфера для уравновешивания с МАА в каждой полосе и инкубировать в течение еще 15 мин при осторожном встряхивании. После уравновешивания с буфером IAA, нальет уравновешивающим буфером SDS.
    2. SDS-PAGE
      1. Берем мини - гели, снимите расческу и промыть гель и лунки с DDH 2 O. Удалите белую ленту в нижней части геля перед запуском. Сориентируйте полосу на геле правильно, ориентация гель имеет решающее значение для точечной резки.
      2. Поместите квартиру гель на прилавке с небольшую тарелку вверх и гель верхней стороной электроннойxperimenter. Положите полоску на высокую тарелку с конца анодной (++ заканчивается с штрих-кодом) с видом на левую сторону геля. С помощью линейки, медленно толкать полосу вниз на поверхность геля. Избегайте образования пузырьков между полосой и гелем. Выдерживают гель вверх в стеклянной пластине стенда.
      3. Добавить 1 мл горячего раствора агарозы запечатывание к открытию кассеты. Убедитесь, что все пузырьки воздуха выдавливается с помощью плоской линейки. Собрать аппарат и запустить гель при постоянной 125 В в течение 90 мин.
      4. Когда гель завершения работы, поместите гель на биомолекулярной томографа с 2 мл DDH 2 O и сканировать гель в режиме обнаружения флуоресценции с лазерным возбуждением 635 нм и 665 нм фильтром эмиссии.
    3. фосфопротеином Окрашивание
      1. Закрепить гель с 50% метанола и 10% -ной смеси уксусной кислоты (10 мл) в течение 30 мин дважды. Промывают 10 мл воды в течение 10 мин три раза, и пятно с 10 мл фосфопротеинкиназы пятно в течение 60 - 90 мин, а затемОбесцвечивание с 10 мл раствора destain в течение 30 минут три раза.
      2. Мытье с 10 мл воды 5 мин дважды и изображение геля с помощью сканера гель-лазера при 532 нм / 560 нм возбуждения / испускания.
    4. Переваривания белков и идентификации
      1. Акцизной все дифференциально экспрессированные белки пятна из геля в лунки микропланшета с использованием роботизированного спот-подборщика в соответствии с инструкциями производителя, и добавляют 100 мМ бикарбоната аммония (2 мл) в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы destain гелевые части. Высушить с 2 мл 100% ацетонитрила моют два раза и сушат в вакуумном концентраторе в течение 30 мин.
      2. Увлажняет кусочки геля с помощью 100 мкл 13 нг / мкл модифицированного свиного трипсина в 50 мМ бикарбоната аммония в течение 16 ч при 37 ° С. Собирают супернатанты и далее извлекать белки со 100 мкл 5% -ной трифторуксусной кислоты в 50% ацетонитрила в течение 30 мин.
      3. Концентрат пептидов до 5 мкл с помощью вакуумной центрифуге ОБОГАЩЕНИЯrator и анализировать с матрицей лазерной десорбцией Ионизация - Время полета - тандем масс - спектрометрического анализа (MALDI TOF-MS / MS) 17.

7. In Vitro киназы

  1. Получение подложках
    1. Sub-клон Комплекс I (CI) субъединицами (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6 и NDUFA12), которые определены как дифференцированно фосфорилированных мишеней CDK1, в pGEX-5X-1 вектор для генерации глутатион-S-трансферазы (GST) -tagged бактериальная экспрессия плазмид 11. Очищают CI субъединиц с использованием высокого сродства глутатиона столбцы следующие ниже протокола.
      1. Культура GST-меченый CI - субъединицу , не содержащий кишечной палочки штамма BL-21 в Лурии-Бертани (LB) бульоне с 50 мкг / мл ампициллина , в шейкере при 37 ° С до оптической плотности (ОП) было достигнуто 0,6. Добавить изопропил-Bd-тио-галактопиранозида (IPTG) к культуЮр при конечной концентрации 0,1 мМ и инкубируют еще в течение 3 часов.
      2. Центрифуга при 600 мкг в течение 10 мин, чтобы собрать бактерии и повторно приостанавливать в 5 мл 1 х PBS буфера, содержащего 5 мМ ДТТ, 1 х ингибитор протеиназы коктейлем, и 0,1% лизоцим. Лизиса клеток путем обработки ультразвуком в течение двадцати 5 с очередями, и удалить остатки клеток центрифугированием при 600 х г в течение 10 мин.
      3. Собирают супернатант и инкубировать с глутатион-агарозных 4B бусин в объемном соотношении 4: 1 (надосадочной: Шарик) в течение 1 ч при комнатной температуре.
      4. Элюируйте GST-слитые белки из гранул с 3 мл глутатион буфера для элюции (10 мМ восстановленного глутатиона в 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0) и подвергают Элюированные белки диализу в молекулярной пористой мембранной трубки (молекулярная масса отсечки 12 -14 кД) с 1 х PBS / 1 мМ ЭДТА. Храните очищенные белки при - 80 ° С.
  2. Cdk1 киназы
    1. До начала киназы задницуау, установить нагревательные блоки до 30 ° C и 100 ° C. Оттепель коммерческий CyclinB1 комплекс ферментов и субстратов на льду / Cdk1.
    2. Подготовка реакционной смеси на льду. Так как 32 P АТФ изотоп участвует, подготовить все реакционные смеси в 1,5 мл пробирок с винтовыми крышками , содержащими кольца O , чтобы предотвратить распространение радиоактивности.
      Внимание: Соблюдайте правила радиационной защиты материала. Используйте толщиной 8 мм оргстекла экранирование и работу по крайней мере, на расстоянии вытянутой руки. Протрите любую загрязненную область с водой.
    3. Приготовьте реакционного буфера 30 мкл , содержащем 1 х Cdk1 буфер (50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 2 мМ ДТТ, 1 мМ EGTA, 0,01% Brij 35, рН 7,5), 0,6 мМ холодного АТФ, 0,1 мкКи 32Р АТФ, 2 единицы CyclinB1 / Cdk1 и 6 мкг белка субстрата. Отрегулируйте громкость до 30 мкл с DDH 2 O. Для получения положительной контрольной реакции, замените субстрат с 0,01 мМ гистона H1, хорошо известного CyclinB1 / Cdk1 подложке.
      1. Для получения отрицательного Controл реакции, (1) заменить субстрат с GST белка только и (2) заменить субстрат с 0,01 мМ гистона H1 + 0,5 мкМ RO-3306, селективного ингибитора CDK1.
    4. хорошо перемешайте с пипеткой и центрифугу, чтобы принести всю жидкость в нижней части трубки, сводя к минимуму риск загрязнения. Инкубируют при 30 ° С в течение 60 мин.
    5. Добавить 6 мкл 5х буфера для образцов SDS , чтобы остановить реакцию , и денатурации при 100 ° С в течение 10 мин. Выполнить образцов на 10% -ном SDS-PAGE при 160 V в течение 2 часов, или до тех пор, пока фронт красителя достиг конца геля. Перенесите гель на хроматографическую бумагу и обернуть полиэтиленовой пленкой.
      Внимание: Все жидкости в контакте с радиоизотопы должны рассматриваться как радиоактивные отходы и утилизировать в поли бутыль 5-галлона предоставляемых услуг в области здравоохранения и безопасности окружающей среды в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
    6. Expose гель для рентгеновской пленки в течение 1 дня или до 1 недели при температуре -20 ° С в зависимости от удельной активности радиоизотопныеи фермент.

8. сайт-направленного мутагенеза, чтобы генерировать доминантный негативный Cdk1 (D146N)

  1. Дизайн мутагенеза праймеров; Два праймера, комплементарные друг другу, содержащим мутантный сайт (G будет заменен нуклеотидную для кодирования N вместо D аминокислоты) фланкированного 20 оснований на каждой стороне 11.
  2. Готовят 50 мкл полимеразной цепной реакции (ПЦР) , содержащей 1х реакционного буфера, 2,5 мМ дНТФ, 10 мкМ праймеров (вперед и назад), 40 нг матрицы, и DDH 2 O. Добавить 2,5 ед ДНК полимеразы в реакцию.
  3. Выполните следующую программу ПЦР: 95 ° C 3 мин, 95 ° C 30 сек, 55 ° C 30 мин, 68 ° C 6 мин; 16 циклов (Примечание: 68 ° C Время инкубации определяется размером ДНК 1 мин / кб требуется для ДНК ≤ 10 кбайт для увеличения ДНК, 2 мин / кбайт плюс 10 секунд за один цикл..). Следуйте на 68 ° C 7 мин и удерживать при 4 ° С до готовности к использованию.
  4. Добавить2 мкл ДПН I рестриктазы (10 ед / мкл) и 5,7 мкл DPN Я буфер, хорошо перемешать с нежным крана с пальцем и инкубировать реакции при 37 ° С в течение 1 часа.
  5. Передача 10 мкл Dpn I обработанных продуктов ПЦР в 50 мкл компетентных клеток DH5 & alpha для трансформации. Инкубируют на льду в течение 30 мин, а затем 45 сек теплового шока при 42 ° С и 5 минут на льду. Добавьте 500 мкл LB и встряхивают при температуре 37 ° С в течение 1 ч перед металлизированный на LB-агар пластин. Выдержите O / N при 37 о С.
  6. Выберите колонию из O / N выращивают агаром с использованием стерильного желтый наконечник пипетки, падение наконечник в пробирку , содержащую 5 мл LB, и расти O / N в C шейкере 37 °. Изолировать плазмиды с использованием набора минипрепаративную и последовательность плазмиды для подтверждения мутации в соответствии с протоколом производителя.

9. Определение фазы клеточного цикла Длины с EDU инкорпорации Пробирной

  1. сортировки клеток
    1. Трansfect 2 х 10 5 клеток с указанными векторами (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-масс-ОПП или MTS-Cdk1-дп-RFP) в 6-луночного планшета с использованием 1: 2 (вес: v , 2,5 мкг: 5 мкл) соотношение ДНК: Трансфекция Реагент смесь, полученную в 2,5 мл serum- и антибактериальной свободной культуральной среды в течение 48 часов. Живые клетки сортировки, стабильно экспрессирующих GFP-меченый Cdk1 и RFP меченых белков CyclinB1 с помощью проточной цитометрии.
      1. Вымойте клеток с 1 х PBS, добавляют 100 мкл трипсина в чашку и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 5 мин. Добавляют 2 мл культуральной среды для сбора клеток и передавать их через фильтр с диаметром 70 мкм, чтобы сформировать одноклеточной суспензии. Промыть одноклеточной суспензии с 500 мкл 1% фетальной телячьей сыворотки в PBS (FCS / PBS) перед их загрузкой на проточном цитометре.
      2. Настройка параметров сортировки следующие протоколы : 18 , установленных стробирования для двойных положительных клеток , окрашенных с обоими GFP и RFP. Собирают отсортированные клетки выходят из цитометра в трубку содернин среда для культивирования клеток и использовать эти клетки для анализа прогрессии клеточного цикла с маркировки EDU импульсов погоня, как в протоколе 9.2.
  2. Измерение длины клеточного цикла с использованием анализа Edu Этикетировочное проточной цитометрии
    1. Семенной сортируется клетки в 6-луночные планшеты при плотности 2,5 × 10 5 клеток на лунку и культуры O / N при 37 ° С в СО 2 инкубаторе. Добавить ОБР в культуральной среде при конечной концентрации 25 мкМ. Инкубировать при 37 о С в СО 2 инкубаторе в течение 1 часа.
    2. Вымойте клеток с 1% BSA в 500 мкл PBS и собирают их в 1,5 мл пробирку с 2 интервалами ч в общей сложности 10 - 12 часов.
    3. Центрифуга клетки при 350 мкг в течение 5 мин, отбросить супернатант. Выбить гранул путем добавления 100 мкл раствора (фиксирующей предоставленного производителем в комплекте маркировки EDU) в течение 15 мин при комнатной температуре и хорошо перемешать.
    4. Промыть клетки с 1 мл 1% BSA в PBS, в три раза. ЗакрепитьКлетки снова с 0,5 мл 70% этанола O / N при 4 о С.
      Примечание: фиксация Этанол имеет решающее значение для гашения внутренней GFP / RFP флуоресценции из-за экспрессии рекомбинантного меченого белка.
    5. Центрифуга клетки снова при 350 мкг в течение 5 мин и промывают осадок с помощью 1 мл 1% BSA в PBS один раз. Повторное приостановить клеток в 1 мл пермеабилизации буфера (0,1% Тритон-Х-100, 1% БСА, 0,2 мг / мл РНКазы А на PBS) в течение 20 мин при комнатной температуре.
    6. Промыть клетки с 1 мл 1% БСА в PBS один раз. Добавить 0,5 мл реакционного коктейля в каждую пробирку и хорошо перемешать. Инкубируют реакционную смесь при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте.
    7. Промыть 1 мл 1% BSA в PBS один раз и ДНК пятна с 50 мкг / мл пропидиума йодида (PI) в 1 мл 1% BSA в PBS.
    8. Анализ клеток с помощью проточной цитометрии следовать Edu-позитивного населения. Присутствует разброс точек участок Edu-меченых клеток окрашиваются по содержанию ДНК (PI окрашивания, по оси Х) и Эду (Alexa 647 окрашивания, Y-оси).
      1. Используйте APC канал для Alexa647-EDU с использованием фильтра верхних частот 670/30 полосы со всеми света представлено менее 685 нм, что фильтр удара; и фикоэритрин канал (PE) для PI с фильтра нижних частот 581/15 полосы перед ним со всеми света представлено менее 600 нм удара этот фильтр.
      2. Вставьте первую пробирку, содержащую клетки в проточной цитометрии и использовать стандартную стратегию стробирования для приобретения: Участок FSC-Area X SSC-зона для морфологии с последующим PI (PE) канал X Alexa647-Edu (APC канал) для окрашивания клеток. Запись данных для всех трубок один за другим, приобретающего 10000 событий в выборке.
      3. Определить распределение фазы клеточного цикла клеток и длины фазы с использованием проточной цитометрии программного обеспечения для анализа данных в соответствии с установленными протоколами 11,30.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Суб-митохондриальной локализации CyclinB1 и Cdk1

экстракция Карбонат натрия используется для определения того, является ли белок, расположенный внутри митохондрий или на наружной поверхности, а именно наружной мембраны. После того, как белок показан для локализации внутри митохондрий, дальнейшее определение суб-митохондриальной локализации может быть сделано с помощью mitoplasting в сочетании с протеазы пищева...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как и белки , предназначенные для других внутриклеточных органелл, митохондриальные белки обладают мишенью таргетингом сигналы в их первичной или вторичной структуры , которые направляют их органеллы с помощью сложного белка транслокации и складных машин 21,22. Митохондрии нацеливающие последовательности (MTS) , полученные из исключительно митохондриальных белков - резидентов , таких как COX8 могут быть добавлены к N-концу любой последовательности гена целевой специфических белков в митохондрии 11,23,24....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами NIH CA133402, CA152313 и Управлением науки Министерства энергетики DE-SC0001271. Мы благодарим Лабораторию общих ресурсов проточной цитометрии Калифорнийского университета в Дэвисе, финансируемую CA0933730 NCI P30, и гранты NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 и S10 RR 026825, а также техническую помощь г-жи Бриджит Маклафлин и г-на Джонатана Ван Дайка за их помощь в проведении экспериментов по проточной цитометрии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
32P ATP PerkinElmerBLU002001MC 
Антимышиное вторичное антителоInvitrogen A-11003Alexa-546 конъюгированное
вторичное антитело против кроликаInvitrogen A11029Alexa-488 конъюгированный
АТФResearch Organics1166AДля анализа in vitro киназы
антитела Cdk1Технология клеточной сигнализации9112
Cdk1 киназный буферNew England BiolabsP6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging KitLife TechnologiesC10337Для анализа клеточного цикла с мечением
EdUТехнологияклеточной сигнализацииIV 4844SДля иммуноокрашивания митохондрий
Антитела к циклину B1Santa Cruz Biotechsc-752
Комплекс ферментов CyclinB1/Cdk1New England BiolabsP6020SИзбегайте замораживания/размораживания
CyDye DIGE Набор для мечения фторомHealthcare Life Sciences25-8009-83
Гель DIGE и буферный набор DIGE GE Здравоохранение Медико-биологические науки28-9480-26 Диметилформамид AA
 Sigma Aldrich319937DMF
DithiothreitolBio-Rad161-0611DTT
dNTPEMD Millipore71004Для сайт-направленного мутагенеза
Dpn I ферментСтратаген200519-53Для сайт-направленного мутагенеза
Жидкость для покрытия сухой полоскиGE Healthcare Life Sciences17-1335-01Используется в качестве минерального масла
ЭДТАJ.T. Baker4040-03
EGTAAcros Organics409910250
Eppendorf Vacufuge ConcentratorFisher Scientific07-748-13Используется в качестве концентратора вакуумных центрифуг
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01Монтажный раствор против выцветания
Fortessa Flow CytometerBD Biosciences649908Для клеточного цикла анализ с мечением EdU
Histone H1Calbiochem382150Для анализа in vitro киназы
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704Для очистки фрагментов ДНК из агарозных гелей
Immobiline DryStrip GelsGE Healthcare Life Sciences18-1016-61IEF (изоэлектрическая фокусировка) полоски
Immobilized GlutathioneThermo Scientific15160Глутатион-агарозные шарики
ЙодоацетамидСигма ОлдричI1149IAA
IPGphor 3 Изоэлектрическая фокусирующая единицаGE Healthcare Life Sciences11-0033-64IPGphor держатели полосок
Изопропил-b-D-тио-галактопиранозид RPI Corp156000-5.0IPTG
ЛейпептинSigma AldrichL9783Для буфера для лизиса клеток
Lipofectamine 2000Life Technologies11668027Реагент для трансфекции
ЛизинSigma AldrichL5501Для мечения CyDye
ЛизоцимEMD Chemicals5960
Mitoctracker Red/GreenInvitrogen M7512/M7514Митохондриальные флуоресцентные красители
MOPSEMD Chemicals6310
pEGFP-N1Clonetech6085-1GFP-экспрессирующий вектор
PfuStratagene600-255-52
pGEX-5X-1 GE Healthcare Life Sciences28-9545-53GST-экспрессирующий вектор
фенилметилсульфонилфторидShelton ScientificIB01090PMSF
фосфат буферный физиологический растворLife Technologies14040PBS
Spectra/Por 4 диализная трубкаSpectrum Labs132700в виде пористой мембранной трубки для диализа
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel StainLife TechnologiesP-33300Для окрашивания фосфопротеинов на 2D гелях
Коктейль ингибиторов протеиназыCalbiochem539134Для буфера для лизиса клеток
QuikChange набор для сайт-направленного мутагенезаStratagene200519-5
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104MiniPrep Набор для изоляции плазмид
RO-3306Alexis Biochemicals270-463-M001Ингибитор Cdk1
RotenoneMP Biomedicals150154Комплекс I
Карбонат натрияFisher ScientificS93359
Хлорид натрияEMD ChemicalsSX0420-5Для буфера для лизиса
клеток Ортованадат натрияMP Biomedicals159664Для буфера для лизиса клеток
Пирофосфат натрия декагидратAlfa Aesar33385Для лизиса клеток Буфер для лизиса
натрия β-глицерофосфатAlfa AesarL03425Для буфера для лизиса клеток
SpectraMax M2e Молекулярные приборыM2EСчитыватель микропланшетов
СахарозаFisher Scientific57-50-1
Измельчитель тканей ПестикKimble Chase885301-0007Для выделения митохондрий
Трубка для измельчителя тканейKimble Chase885303-0007Для выделения митохондрий
раствор трихлоруксусной кислотыSigma AldrichT0699TCA
TrisMP Biomedicals103133
Triton-x-100TeknovaT1105
ТрипсинCalbiochem650211
Typhoon ImagerGE Healthcare Life Sciences28-9558-09Лазерный гелевый сканер для 2D-DIGE
UbiquinonSigma AldrichC7956
антител ЦОГ GE

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12 (6), 658-665 (2000).
  3. Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26 (2), 301-310 (2007).
  4. Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17 (11), 563-569 (2007).
  5. Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
  6. Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221 (3), 1027-1043 (1991).
  7. Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197 (3), 563-576 (1991).
  8. Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29 (4), 499-515 (2006).
  9. Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 1930-1935 (2010).
  10. Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40 (3), 356-361 (2008).
  11. Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29 (2), 217-232 (2014).
  12. Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123 (6), 1010-1016 (1998).
  13. Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3'-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52 (4), 433-440 (2011).
  14. Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58 (1), 45-52 (2004).
  15. Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic 'click' reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49 (1), 525-527 (2010).
  16. Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3 (9), 1758-1766 (2003).
  17. Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. , Unit 10.25(2009).
  18. Davies, D. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. Macey, M. G. , Humana Press. 257-276 (2007).
  19. van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
  20. Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1 (2), 859-869 (2006).
  21. Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353 (5), 1011-1020 (2005).
  22. Karniely, S., Pines, O. Single translation--dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6 (5), 420-425 (2005).
  23. Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5 (3), 166-175 (2013).
  24. Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5 (8), e12341(2010).
  25. Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73 (7), 626-636 (2008).
  26. Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13617-13622 (1996).
  27. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  28. Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382 (3), 669-678 (2005).
  29. Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8 (23-24), 4886-4897 (2008).
  30. Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. , (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial LocalizationCdk1 KinaseMitochondrial Overexpression2D DIGE AnalysisEdU Labeling AssayFlow CytometrySodium Carbonate ExtractionSubmitochondrial FractionationMitochondrial Targeting SequenceCell Proliferation Assay

Related Articles