Method Article

Экспериментальные подходы к изучению Митохондриальная локализации и функции цикла ядерных клеток киназа, CDK1

DOI:

10.3791/53417

⸱

February 25th, 2016

 ,  ,  , 
1Radiation Oncology, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем, как изучать митохондриальную локализацию киназы (клеточного цикла) и как определить ее субмитохондриальное расположение, а также потенциальные митохондриальные субстраты/мишени. Принудительная экспрессия белков в митохондриях является полезным инструментом для изучения функциональных последствий митохондриальной локализации интересующего белка.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя митохондрии обладают собственным транскрипционным механизмом, только 1% митохондриальных белков синтезируется внутри органеллы. Ядерно-кодируемые белки транспортируются в митохондрии в соответствии с их митохондриальными целевыми последовательностями (MTS); однако у большинства митохондриальных локализованных белков отсутствует идентифицируемая MTS. Тем не менее, тот факт, что MTS может инструктировать белки проникать в митохондрии, является ценным инструментом для изучения митохондриальных функций нормально ядерных и/или цитоплазматических белков. Недавно мы идентифицировали комплекс киназы клеточного цикла CyclinB1/Cdk1 в митохондриях. Для изучения митохондриальных функций этого комплекса было важно обеспечить сверхэкспрессию митохондрий и нокдаун этого комплекса без вмешательства в его ядерные или цитоплазматические функции. Пометив CyclinB1/Cdk1 с помощью MTS, мы смогли достичь митохондриальной сверхэкспрессии этого комплекса для изучения его митохондриальных мишеней, а также функций. Путем маркировки доминантно-негативного Cdk1 с помощью MTS было достигнуто ингибирование активности Cdk1, особенно в митохондриях. Потенциальные митохондриальные мишени комплекса CyclinB1/Cdk1 были идентифицированы с помощью протеомного подхода на основе геля. В отличие от традиционного 2D-анализа геля, мы использовали технологию двумерного разностного гель-электрофореза (2D-DIGE) с последующим окрашиванием фосфопротеинов для флуоресцентного мечения дифференциально фосфорилированных белков в митохондриальных клетках, экспрессирующих Cdk1. Идентификация фосфопротеиновых пятен, которые были изменены в диком типе по сравнению с доминирующими отрицательными митохондриями, несущими Cdk1, выявила идентичность митохондриальных мишеней Cdk1. Наконец, чтобы определить влияние митохондриальной локализации CyclinB1/Cdk1 на прогрессию клеточного цикла, был использован анализ пролиферации клеток с использованием синтетического аналога тимидина EdU (5-этинил-2'-дезоксиуридин) для мониторинга клеток по мере их прохождения через клеточный цикл и репликации их ДНК. В целом, мы продемонстрировали разнообразие доступных подходов к изучению митохондриальной локализации и активности киназы клеточного цикла. Это передовые, но простые в использовании методы, которые будут полезны для многих исследователей в области клеточной биологии.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У млекопитающих, прогрессию клеточного цикла зависит от высокоупорядоченных событий , контролируемых циклинов и циклин-зависимых киназ (CDKS) 1. Благодаря его цитоплазматическом, ядерной и центросомной локализации, CyclinB1 / Cdk1 способен синхронизировать различные события в митозе , таких как пробой ядерной оболочки и центросом разделения 2. CyclinB1 / Cdk1 защищает митотических клеток от апоптоза 3 и способствует митохондриальной деления, критический шаг для равномерного распределения митохондрий вновь образованных клеток дочь 4.

В пролиферирующих клетках млекопитающих митохондриальной АТФ ге....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Выделение Митохондрии из культивируемых клеток

  1. Получение изоляции буфера для клеток (IBC) буфера
    1. Готовят 0,1 М Трис / МОПС (трис (гидроксиметил) / 3- (N -morpholino) пропансульфокислоты): Растворить 12,1 г Трис в 800 мл дистиллированной воды, довести рН до 7,4 с помощью MOPS порошок, добавляют дистиллированную воду до общего объем 1 л и хранить при температуре 4 ° С
    2. Готовят 0,1 М EGTA (этиленгликоль-бис (2-аминоэтил эфир) этилендиаминтетрауксусной кислоты) / Трис: Растворить 38,1 г EGTA в 800 мл дистиллированной воды, довести рН до 7,4 с помощью Tris порошок, добавляют дистиллированную воду до обще....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Суб-митохондриальной локализации CyclinB1 и Cdk1

экстракция Карбонат натрия используется для определения того, является ли белок, расположенный внутри митохондрий или на наружной поверхности, а именно наружной мембраны. После того, как белок показан для локализации внутри митохондрий, дальнейшее определение суб-митохондриальной локализации может быть сделано с помощью mitoplasting в сочетании с протеазы пищева.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как и белки , предназначенные для других внутриклеточных органелл, митохондриальные белки обладают мишенью таргетингом сигналы в их первичной или вторичной структуры , которые направляют их органеллы с помощью сложного белка транслокации и складных машин 21,22. Митохондрии нацеливающие последовательности (MTS) , полученные из исключительно митохондриальных белков - резидентов , таких как COX8 могут быть добавлены к N-концу любой последовательности гена целевой специфических белков в митохондрии 11,23,24........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами NIH CA133402, CA152313 и Управлением науки Министерства энергетики DE-SC0001271. Мы благодарим Лабораторию общих ресурсов проточной цитометрии Калифорнийского университета в Дэвисе, финансируемую CA0933730 NCI P30, и гранты NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 и S10 RR 026825, а также техническую помощь г-жи Бриджит Маклафлин и г-на Джонатана Ван Дайка за их помощь в проведении экспериментов по проточной цитометрии.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
32P ATP PerkinElmerBLU002001MC 
Антимышиное вторичное антителоInvitrogen A-11003Alexa-546 конъюгированное
вторичное антитело против кроликаInvitrogen A11029Alexa-488 конъюгированный
АТФResearch Organics1166AДля анализа in vitro киназы
антитела Cdk1Технология клеточной сигнализации9112
Cdk1 киназный буферNew England BiolabsP6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging KitLife TechnologiesC10337Для анализа клеточного цикла с мечением
EdUТехнологияклеточной сигнализацииIV 4844SДля иммуноокрашивания митохондрий
Антитела к циклину B1Santa Cruz Biotechsc-752
Комплекс ферментов CyclinB1/Cdk1New England BiolabsP6020SИзбегайте замораживания/размораживания
CyDye DIGE Набор для мечения фторомHealthcare Life Sciences25-8009-83
Гель DIGE и буферный набор DIGE GE Здравоохранение Медико-биологические науки28-9480-26 Диметилформамид AA
 Sigma Aldrich319937DMF
DithiothreitolBio-Rad161-0611DTT
dNTPEMD Millipore71004Для сайт-направленного мутагенеза
Dpn I ферментСтратаген200519-53Для сайт-направленного мутагенеза
Жидкость для покрытия сухой полоскиGE Healthcare Life Sciences17-1335-01Используется в качестве минерального масла
ЭДТАJ.T. Baker4040-03
EGTAAcros Organics409910250
Eppendorf Vacufuge ConcentratorFisher Scientific07-748-13Используется в качестве концентратора вакуумных центрифуг
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01Монтажный раствор против выцветания
Fortessa Flow CytometerBD Biosciences649908Для клеточного цикла анализ с мечением EdU
Histone H1Calbiochem382150Для анализа in vitro киназы
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704Для очистки фрагментов ДНК из агарозных гелей
Immobiline DryStrip GelsGE Healthcare Life Sciences18-1016-61IEF (изоэлектрическая фокусировка) полоски
Immobilized GlutathioneThermo Scientific15160Глутатион-агарозные шарики
ЙодоацетамидСигма ОлдричI1149IAA
IPGphor 3 Изоэлектрическая фокусирующая единицаGE Healthcare Life Sciences11-0033-64IPGphor держатели полосок
Изопропил-b-D-тио-галактопиранозид RPI Corp156000-5.0IPTG
ЛейпептинSigma AldrichL9783Для буфера для лизиса клеток
Lipofectamine 2000Life Technologies11668027Реагент для трансфекции
ЛизинSigma AldrichL5501Для мечения CyDye
ЛизоцимEMD Chemicals5960
Mitoctracker Red/GreenInvitrogen M7512/M7514Митохондриальные флуоресцентные красители
MOPSEMD Chemicals6310
pEGFP-N1Clonetech6085-1GFP-экспрессирующий вектор
PfuStratagene600-255-52
pGEX-5X-1 GE Healthcare Life Sciences28-9545-53GST-экспрессирующий вектор
фенилметилсульфонилфторидShelton ScientificIB01090PMSF
фосфат буферный физиологический растворLife Technologies14040PBS
Spectra/Por 4 диализная трубкаSpectrum Labs132700в виде пористой мембранной трубки для диализа
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel StainLife TechnologiesP-33300Для окрашивания фосфопротеинов на 2D гелях
Коктейль ингибиторов протеиназыCalbiochem539134Для буфера для лизиса клеток
QuikChange набор для сайт-направленного мутагенезаStratagene200519-5
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104MiniPrep Набор для изоляции плазмид
RO-3306Alexis Biochemicals270-463-M001Ингибитор Cdk1
RotenoneMP Biomedicals150154Комплекс I
Карбонат натрияFisher ScientificS93359
Хлорид натрияEMD ChemicalsSX0420-5Для буфера для лизиса
клеток Ортованадат натрияMP Biomedicals159664Для буфера для лизиса клеток
Пирофосфат натрия декагидратAlfa Aesar33385Для лизиса клеток Буфер для лизиса
натрия β-глицерофосфатAlfa AesarL03425Для буфера для лизиса клеток
SpectraMax M2e Молекулярные приборыM2EСчитыватель микропланшетов
СахарозаFisher Scientific57-50-1
Измельчитель тканей ПестикKimble Chase885301-0007Для выделения митохондрий
Трубка для измельчителя тканейKimble Chase885303-0007Для выделения митохондрий
раствор трихлоруксусной кислотыSigma AldrichT0699TCA
TrisMP Biomedicals103133
Triton-x-100TeknovaT1105
ТрипсинCalbiochem650211
Typhoon ImagerGE Healthcare Life Sciences28-9558-09Лазерный гелевый сканер для 2D-DIGE
UbiquinonSigma AldrichC7956
антител ЦОГ GE

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial LocalizationCdk1 KinaseMitochondrial Overexpression2D DIGE AnalysisEdU Labeling AssayFlow CytometrySodium Carbonate ExtractionSubmitochondrial FractionationMitochondrial Targeting SequenceCell Proliferation Assay

Related Articles