Экс Vivo культуры Чик мозжечка ломтиками и пространственно Целевые Электропорация ЗК прекурсоров

Краткое содержание

Мозжечка внешний слой гранул сайт крупнейшего транзитного усиления в развивающемся мозге. Здесь мы приводим протокол целевой генетической модификации к этому слою на пике распространения с использованием естественных условиях электропорации экс и культуры мозжечка ломтиками из эмбриональных день 14 куриных эмбрионов.

Аннотация

Мозжечка внешний слой гранул (EGL) является местом крупнейшей транзитной усиления в развивающемся мозге, и отличная модель для изучения нейронов пролиферации и дифференцировки. Кроме того, эволюционные изменения ее пролиферативной способностью были ответственны за резкого расширения мозжечковой размера в амниот, что делает мозжечок отличная модель для Evo-Devo исследований позвоночных мозг. Учредительные клетки EGL, мозжечка гранул предшественники, также представляют собой значительную ячейку происхождения медуллобластомой, одной из самых распространенных педиатрической нейронов опухоли. После транзитного усиления, гранул прекурсоров мигрировать в радиальном направлении внутренней зернистого слоя мозжечка, где они представляют большой нейронов населения в зрелом мозге млекопитающих. У кур, пик распространения EGL происходит в конце второй недели беременности. В целях выявления генетической модификации к этому слою напик распространения, мы разработали метод для генетических манипуляций через экс естественных условиях электропорации мозжечка ломтиками от эмбриональных день 14 куриных эмбрионов. Этот метод повторяет несколько важных аспектов в естественных развития гранул нейронов и будет полезен в создании полного понимания пролиферации мозжечка гранул и дифференцировки клеток, и, следовательно, развитие мозжечка, эволюции и болезни.

Введение

Мозжечок расположен у переднего конца заднего мозга и отвечает за интеграцию сенсорной и моторной переработки в зрелом мозге, а также регулирования более высокие когнитивные процессы ^1. У млекопитающих и птиц, это имеет продуманную морфологии и степени расслаивается, продукт обширного транзитной усиления предшественников в процессе разработки, который производит более половины нейронов в мозге взрослого. Мозжечок является предметом изучения для нейробиологов в течение многих столетий и в молекулярной эры также уделено значительное внимание. Это относится не только к его сути интересной биологии, но также в том, что она в значительной степени причастны к болезни человека, включая развития генетических расстройств, таких как расстройства аутистического спектра ^{2 и} наиболее важное мозжечка рака, медуллобластомой ^3, который является наиболее распространенным педиатрических мозга опухоли. Важно отметить, что это отличная модель системы в WHIch изучать распределение судьба и нейрогенез во время развития мозга ^4. В последние годы, он также был создан в качестве модельной системы для сравнительного исследования развития мозга, в связи с огромным разнообразием форм мозжечка видели по позвоночных филогении ^5-10.

Мозжечок развивается из дорсальной половине ромбомера 1 в заднем мозге и развитием ¹¹ состоит из двух основных популяций клеток-предшественников, ромбической губой и вентрикулярной зоне. Ромбической губы простирается вокруг спинного области нейроэпителия заднего мозга на границе с потолочной панели. Это родина глутаматергических возбуждающих нейронов мозжечка ^12-14. Желудочковая зона приводит к тормозных ГАМК нейронов мозжечка, наиболее заметно большие Пуркинье нейронов ^14,15. Позднее в развитии (от примерно 13,5 эмбриональный день у мышей; е6 в куриных ^16), глутаматергической Progenitors мигрировать касательной с ромбической губы и образуют слой мягкой мозговой оболочки клеток-предшественников: зона вторичного предшественников называется внешним гранул слой (EGL). Именно это слой, который подвергается обширной транзитной усиление, что приводит к огромным количеством гранул нейронов, найденных в зрелом мозге.

Распространение в EGL уже давно связан с суб-пиальных месте, что результаты от касательной миграции из ромбической губы ^17, с переходом на выходе клеточного цикла и дифференцировки нейронов предшественников, ассоциированных с их выходом из внешнего слоя EGL в середине EGL ^18. Обширная касательной миграция постмитотических зернистых клеток в медиальной-боковой оси происходит в середине и внутренней EGL ^19, до окончательного радиальной миграции во внутреннюю гранул слоем зрелой коре мозжечка. Миграция клеток из ромбической губы над мозжечка поверхности зависит от CXCL12 сигнализации от Пиа ^20-22 И ЗК выразить CXCL12 рецептор CXCR4. Их касательной миграция, таким образом, напоминает, что из неокортекса касательной миграции населения ингибирующие интернейронов ^23-25. Интересно, электронные микроскопические исследования ¹⁷ показали, что EGL клетки с пролиферативной морфологии поддерживать контакт мягкой мозговой оболочки, связывая поведение клеток с пролиферативной способности в манере, напоминающей базальных клеток-предшественников в коре млекопитающих ^26. Это нашло свое отражение в вышеупомянутом стратификации EGL в трех подслоев, которые определены различными внеклеточного сред и где гранулы прекурсоров отчетливое выражение гена подписи ^18.

Пролиферация клеток-предшественников в oEGL происходит с нормальным распределением размеров клонов, так что, когда предшественники отдельности генетически помечены в конце эмбрионального развития у мышей, они приводят к срединной среднем 250-500 г постмитотичностиranule нейроны ^27,28. Распространение зависит от митогенной сигнализации SHH от основных Пуркинье нейронов ^29-32. Способность реагировать на SHH было показано, что полностью зависит от клеточного автономной экспрессии фактора транскрипции Atoh1, как в пробирке ³³ и в естественных условиях ^34,35. Кроме того, выход клеточного цикла и дифференциации, как было показано, зависит от экспрессии ниже по потоку фактора транскрипции NeuroD1 ^36, которая, вероятно прямым репрессором Atoh1 ^37.

Несмотря на этот прогресс, и значительный продвижения в расшифровке биологическую основу клеток клеточного цикла выхода ^38-42, фундаментальная молекулярный механизм (ы), которые лежат в основе решения для выхода из клеточного цикла и перехода от предшественника к дифференциации нейрона, и Associated постмитотическими касательной миграции во внутреннем EGL, а также позднее переключательрадиальной миграции, по-прежнему полностью понял. Это в значительной степени из-за экспериментальной труднорешаемости в EGL: это поздно развивается, и трудно целевой генной так как многие из тех же молекул нейрогенных также важны в начале жизни гранул предшественников в ромбической губы. Чтобы преодолеть эту проблему, многие авторы разработали в естественных условиях и экс естественных условиях электропорации как метода целевым послеродовой мозжечка у грызунов ^43-48. Здесь мы пионерами использование экс виво электропорации в куриных изучать EGL, который представляет значительные преимущества с точки зрения стоимости и удобства. Наш метод электропорации и экс естественных среза культуры куриного мозжечка ткани использует ткани рассекают из эмбриональных день 14 цыплят на пике распространения EGL. Этот метод позволяет генетический адресности EGL независимо от ромбической губы и подготовить почву для генетического расчленения перехода от гранулпредшественников в постмитотичности гранул нейрона в мозжечке.

Протокол

Примечание: Все эксперименты проводились с соответствии с Королевского колледжа в Лондоне, Великобритании и руководящих принципов по уходу за животными UK Главная Office.

1. Вскрытие E14 мозжечка

1. Выдержите коричневые оплодотворенной кур яйца на 38 ° С до эмбрионального дня 14.
2. Использование яиц ножницы обезглавить куриного эмбриона в яйце и удалить голову в чашку Петри, содержащую ледяной PBS (рис 1А).
3. Используя стандартные щипцы, сделать надрезы за каждым глазом весь путь через ткань, удаление глаза и верхнюю челюсть. Сделать второй разрез все путем глотки удаления нижней челюсти (рис 1B).
4. Используя стандартные щипцы, удалить всю кожу с поверхности черепа пилинг его от (рис 1С) и снимите лобной и теменной костей, выявление мозг.
5. С вентральной, удалить хрящи глотки и вспомогательного мезенхиму.
6. С дорсальной, осторожныLY удалить мезенхимы дорсальнее заднего мозга стараясь не повредить Пиа, и отдельный весь мозг (рис 1D).
7. Сделайте надрез на всем пути через ткань мозга и между мозге и отдельным мозге в том числе мозжечка (рис 1E).
8. Делая надрезы весь путь через ткани на обеих боковых стыках мозжечка и крыла пластины заднего мозга, мозжечок удалить всю, заботясь, чтобы сохранить целостность всей Пиа вскрытия (рис 1F). Снимите формирования сосудистого сплетения (рис 1G).
9. Перемещение расчлененный мозжечок в ледяную HBSS.

2. Кусочек Культура E14 мозжечка

1. Перевести весь мозжечок на стерильной платформе ткани Chopper с помощью шпателя или 3 мл пипетки Пастера с наконечником отрезать, чтобы расширить отверстие. Удаления избытка жидкости с помощью пипетки.
2. Вырезать весь целый мозжечок в тон потребовал ориентации при толщине 300 мкм с использованием тканей вертолет комплект с скорости резания на 50% от максимума. Целостности тканей наиболее легко сохраняется в сагиттальной разделе; Однако, ориентация также является важным фактором для анализа клеток (клеток Пуркинье являются дендриты сагиттально выравнивается, а ЗК аксоны работать поперек, перпендикулярно к плоскости клеток Пуркинье дендритов).
3. Использование 3 мл пипетки Пастера, покрыть ломтиками мозжечок в ледяной HBSS.
4. Перенесите ломтики в HBSS в 60 мм чашки Петри, содержащей ледяной свежий HBSS с использованием 3 мл пипетки Пастера с вырезом наконечником.
5. Под микроскопом рассекает освещаемого оптоволоконного источника света, убедитесь, разделение отдельных кусочков, используя щипцы часовщика. Определить ломтиками быть электропорации, на основе их целостности тканей и Medio-боковом положении.
   Примечание: Каждый из эмбриона рассечение через нарезать инкубации в культуральной среде занимает около 10-20 минут, в зависимости Upoн опыт. Выполните вскрытий по одному, чтобы убедиться, что мозжечка провести минимальное количество времени между обезглавливания и экс естественных условиях культуры.

3. Электропорация Ломтики

1. Построить электропорации камеру, фиксируя анод с электропоратора к основанию 60 мм чашки Петри с помощью изоляционной ленты. Добавить приблизительно 1 мл HBSS, чтобы покрыть электрод.
2. Поместите 0,4 мкм культуры вставку на верхней части электрода, покрытой HBSS с. Разрешить культура вставка для отдыха на электрод убедившись, что всегда с нами между вставкой и электродом.
   Примечание: В этой установке, культура вставка с кусочками будет опираться на поверхности раствора, поддерживая цепь, но позволяет пространственное нацеливание катода.
3. Передача выявленные ломтики (до пяти процентов культуры вставки) на культуры вставки, используя 3 мл пипетки Пастера с вырезом наконечником. Отдельная и позволяют оседать культуры вставки в sagittаль ориентации.
4. С помощью пипетки, удаления избытка HBSS, так что ломтики больше не залито раствором.
5. Использование пипетки P10, пипетки ДНК (при концентрации 1 мкг / мкл), разбавленный 20% быстрого зеленый над поверхностью целевой области среза. 20% быстро зеленый обеспечивает вязкий раствор ДНК и предотвращает чрезмерно широкий разгон ДНК. Добавить примерно 5 мкл ДНК / быстрый зеленый раствор для каждого среза (рис 2B).
6. Поместите катод над нужной ткани-мишени и электропорации с 3 х 10 В, 10 мс импульсов длительностью. Избегайте прямого контакта катода с тканью. Вместо этого, воспользоваться поверхностного натяжения жидкости для поддержания проводимости (разместить катод как можно ближе к ткани, как это возможно, фактически не касаясь ткани).
7. Повторите доставки ДНК и электропорацию нескольким регионах EGL на каждом отдельном мозжечка срез по желанию.
8. После завершения электропорации, передача культуры InSeRT 30 мм чашки Петри.
9. Для каждой культуры, добавляют 1 мл предварительно нагретого культуральной среды (базальной среды Eagle, 0,5% (вес / объем) D - (+) - глюкозы, 1% В27 дополнения, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина) под культуры, такие вставки, что культура вставка находится в контакте со средой, но кусочки не залитом в нем.
10. Выдержите культур на 37 ° C / 6% CO ₂ в течение 3 дней. Заменить все культуральной среды через каждые 24 ч со свежим подогретого среды.
11. После культуры, исправить ломтики на культуру вставляет в течение 1 часа в 4% параформальдегида (или O / N при 4 ° С) в свежем 30 мм блюдо с не культуральной среде.

4. Визуализация мозжечка ломтиками

1. После фиксации, мыть ломтиками 3 раза в течение 5 мин в PBS.
2. Использование лезвие бритвы, рассекать каждый электропорации и культурный срез мозжечка из культуральной вставки путем разрезания вокруг среза и удаление фрагмента и область вставки он придерживался. ДелатьНе пытайтесь удалить кусочек от поверхности культуры вставки.
3. Mount ломтики в примерно 1 мл монтажа среде, содержащей DAPI (по желанию) под покровное, стараясь не ввести пузыри, и изображения с помощью лазерного сканирования конфокальной микроскопии.
   Примечание: Визуализация параметры могут быть изменены в соответствии с конструкциями электропорации, и по усмотрению индивидуального пользователя.

Результаты

В этом разделе приведены примеры результатов, которые могут быть получены с помощью электропорации ломтик и культуры мозжечка из эмбриональных день 14 кур. Рассечение мозжечка показано на рисунке 1, и электропорации камера установка показана на рисунке 2. Покажем, что это возможно, чтобы электропорации и успешно культуры ломтики мозжечка, которые сохраняют свою структуру и клеточные морфологии в пробирке (рис 3а). Целевые электр...

Обсуждение

Протокол сообщил здесь описан способ рассечения, электропорации и культивирование срезов эмбрионального день 14 мозжечка с птенцом. Этот протокол позволяет адресности электропорации малых фокусных регионов EGL, в том числе изолированных адресности отдельных мозжечка лепестков. Это дает возможность генетического анализа и визуализации с высоким разрешением и удобства, и при низкой стоимости по сравнению с известным методом грызунов ^43-47. Такой анализ в настоящее время невозможно в естественных условиях

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Измельчитель тканей McIlwain	Mickle Laboratory Engineering Ltd		Cut at 300 μ m для достижения наилучших результатов.
Базальный средний орел (Gibco)	Life Technologies	41010-026
L-глутамин	Sigma	G7513
пенициллин/стрептомицин	Sigma	P4333
0,4 μ m культуральный вкладыш	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator	Intracel	01-916-02	Используйте импульсы 3 x 10 В, 10 мс для электропорации.