Методическая статья

Улучшена генерация индуцированной кардиомиоцитов Использование полицистронных Construct выражая оптимальное соотношение GATA4, MEF2C и Tbx5

DOI:

10.3791/53426

⸱

13 ноября 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, McAllister Heart Institute, University of North Carolina, Chapel Hill

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем здесь протокол для генерации iCM с использованием ретровирус-опосредованной доставки Gata4, Tbx5 и Mef2c в полицистронной конструкции. Этот протокол позволяет получить относительно однородную популяцию перепрограммированных клеток с повышенной эффективностью и качеством и представляет ценность для будущих исследований перепрограммирования iCM.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Прямое преобразование сердечных фибробластов (CFS) в индуцированных кардиомиоцитов (холодильников) имеет большой потенциал для регенеративной медицины, предлагая альтернативные стратегии для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Это преобразование было достигнуто за счет принудительной экспрессии определенных факторов, таких как Gata4 (G), MEF2C (М) и Tbx5 (T). Традиционно, холодильников генерируются коктейль вирусов, выражающих эти индивидуальные факторы. Тем не менее, эффективность перепрограммирования является относительно низким, и большинство из в пробирке G, M, T-трансдуцированных фибробластов не станет полностью перепрограммировать, что затрудняет изучение механизмов перепрограммирования. Недавно мы показали, что стехиометрия G, M, T имеет решающее значение для эффективного ICM перепрограммирования. Оптимальный стехиометрии G, M, T с относительной высокой M и низким уровнем G и T, достигнутых с помощью нашего полицистронных MGT вектор (далее именуемое MGT) значительно повышенную эффективность перепрограммирования и улучшение качества ICM в пробирке, Здесь мы предлагаем подробное описание методологии, используемой для создания холодильников с MGT конструкции из сердечных фибробластов. Выделение сердечных фибробластов, поколения вируса для перепрограммирования и оценки процесса перепрограммирования также включены, чтобы обеспечить платформу для эффективного и воспроизводимого поколения холодильников.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сердечно-сосудистые заболевания остаются основной причиной смерти во всем мире, на их долю приходится 17,3 миллиона смертей вгод1. Потеря кардиомиоцитов в результате инфаркта миокарда (ИМ) или прогрессирующей сердечной недостаточности является основной причиной заболеваемости и смертности2. Из-за ограниченной регенеративной способности сердца взрослых млекопитающих обычно страдают от нарушения насосной функции и сердечной недостаточности после травмы3-6. Таким образом, эффективная (ре)регенерация кардиомиоцитов in vivo и in vitro для лечения сердечных заболеваний и для моделирования заболеваний является критически важной проблемой, требующей решения.

Недавняя разработка прямого перепрограммирования, которое напрямую перепрограммирует клетки из одного дифференцированного фенотипа в другой без перехода через плюрипотентное состояние, предлагает многообещающий альтернативный подход к регенеративной медицине. Сердце млекопитающих содержит большое количество сердечных фибробластов (КФ), которые составляют примерно половину клеток сердца и массово размножаются при повреждении7-9. Таким образом, огромный пул МВ мог бы служить эндогенным источником новых КМ для регенеративной терапии, если бы их можно было напрямую перепрограммировать в функциональные КМ. Было показано, что комбинация факторов транскрипции, таких как Gata4 (G), Mef2c (M) и Tbx5 (T), с микроРНК или малыми молекулами или без них может перепрограммировать фибробласты в iCMs10-26. Важно отметить, что это преобразование также может быть индуцировано in vivo, что приводит к улучшению сердечной функции и уменьшению размера рубца при инфаркте сердца16,27-29. Эти исследования показывают, что прямое перепрограммирование сердца может быть потенциальным путем к исцелению поврежденного сердца. Тем не менее, низкая эффективность перепрограммирования iCM стала основным препятствием для дальнейших механистических исследований. Кроме того, воспроизводимость перепрограммирования сердца является еще одним спорным вопросом данной технологии11,30,31.

Совсем недавно мы сгенерировали полный набор полицистронных конструкций, кодирующих G,M,T во всех возможных порядках сплайсинга с идентичными 2А-последовательностями в одной мРНК. Эти полицистронные конструкции давали различные уровни экспрессии G, M и T-белков, что приводило к значительно различающейсяэффективности перепрограммирования. Наиболее эффективная конструкция, названная MGT, которая показала относительно высокую экспрессию Mef2c и низкую экспрессию Gata4 и Tbx5, значительно повысила эффективность перепрограммирования и произвела большое количество iCM с экспрессией маркеров CM, устойчивыми колебаниями кальция и спонтанным биением. Кроме того, используя полицистронную конструкцию MGT, в нашем исследовании удалось избежать использования множественных векторов и сгенерированных клеток с однородным коэффициентом экспрессии G,M,T, что обеспечило улучшенную платформу для исследований по перепрограммированию сердца. Чтобы повысить воспроизводимость эксперимента, здесь мы подробно опишем, как изолировать фибробласты, получить кассету MGT, несущую ретровирус, сгенерировать iCM и оценить эффективность перепрограммирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол изложил здесь использует новорожденных мышей. Уход за животными и эксперименты выполняются в соответствии с руководящими принципами, установленными Отделом лабораторных животных медицины (DLAM) в Университете Северной Каролины, Чапел-Хилл.

1. Подготовка буферов и СМИ

  1. Подготовьте фибробластов (FB) среды: Дополнение 500 мл IMDM среду 100 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 6 мл пенициллина / стрептомицина.
  2. Подготовка ICM среда: Дополнение 400 мл DMEM СМИ со 100 мл М199 СМИ и 50 мл FBS.
  3. Подготовка B27 среду: Дополнение 490 мл RPMI1640 медиа с 10 мл B27 СМИ.
  4. Подготовьте Plat-E культуральную среду: Дополнение 500 мл DMEM среды с 50 мл FBS, 5 мл пенициллина / стрептомицина и 5 мл Номера незаменимых аминокислот.
  5. Подготовка Плат-E трансфекции среду: Дополнение 500 мл DMEM СМИ с 50 мл FBS и 5 мл Номера для незаменимых аминокислот.
  6. Прepare покрытые желатином 24-луночный планшет: Добавить 0,5 мл 0,1% раствора желатина в скважине 24-луночного планшета, инкубируют при 37 ° С в течение по меньшей мере 10 мин и аспирации непосредственно перед использованием.
  7. Подготовка FACS буфера маркировки: Дополнение 500 мл DPBS 10 мл FBS и 2 мл ЭДТА (0,5 М) до конечной концентрации 2 мМ. Пройти через фильтр и хранят 0,22 мкм при 4 ° С.
  8. Подготовка MACS буфера сортировки: Дополнение 500 мл DPBS с 2,5 г BSA и 2 мл ЭДТА (0,5 М), чтобы достичь конечной концентрации 2 мМ. Пройти через фильтр и хранят 0,22 мкм при 4 ° С.
  9. Подготовьте 2x буфера HBS для трансфекции: дополнить 500 мл HEPES буфера (50 мм) с 280 мм NaCl (8,1816 г), 10 мМ KCl (0,37275 г), 1,5 мМ Na 2 HPO 4 (0,10647 г), 12 мМ глюкозы (1.08096 г ). Добавить около 650 мкл 10 N NaOH, чтобы довести рН до 7,05-7,12. Фильтруют через фильтр 0,22 мкм пор и хранят при температуре 4 ° С.
  10. Подготовьте 2,5 М CaCl 2 решение для трансфекции: Добавить 18.376 г CaCl 2 до 50 мл DDH 2 O. Фильтруют через фильтр 0,22 мкм пор и хранят при температуре 4 ° С.
  11. Подготовка ICC (Иммуноцитохимическая) фиксации буфер: Добавить 5 мл параформальдегида (PFA, 32%) в 35 мл DPBS до конечной концентрации 4%.
  12. Подготовка ICC проницаемости буфер: Добавить 0,1 мл Тритона до 100 мл DPBS до конечной концентрации 0,1%.
  13. Подготовка блокирующего буфера ICC: Добавить 5 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 100 мл DPBS до конечной концентрации 5%.
  14. Подготовка ICC окрашивающего буфера: Добавить 1 г БСА на 100 мл DPBS до конечной концентрации 1%.

2. Генерация неонатальных мышей сердечных фибробластов

  1. Создание сердечные фибробласты из метода эксплантов культуры
    1. Чистый новорожденных αMHC-GFP трансгенной мыши (P1 до P2) 75% -ным этанолом. Отрежьте голову стерильными ножницами. Затем сделать горизонтальную разрез из-под одной подмышки до другой. Используйте стерильныйтупые и изогнутые щипцы рассекать из сердца и поместить его в одну лунку 24-луночного планшета, содержащего ледяной PBS буфера.
      1. Кроме того, выжать сердце после горизонтальной разреза.
    2. Проверьте GFP выражение в сердце флуоресцентным микроскопом. Так как выражение GFP управляется αMHC промотора, который является сердечная промотор, сердце из трансгенной мыши должны быть в зеленой 15, в то время как отрицательное сердце тусклый в любом флуоресценции.
    3. Принимают 3-4 GFP позитивные сердца в 60 мм центр культуральной чашки а фарш их на мелкие кусочки менее 1 мм 3 в размерах стерильными ножницами и щипцами.
    4. Поместите 3-4 фарш сердца в одно блюдо 10 см с 2 мл FB СМИ. Пусть ткани осесть в течение 3 часов.
    5. Медленно добавить 8 мл подогретого FB СМИ к блюдам, содержащих сердечные ткани. Не беспокоить тканей в течение трех дней.
    6. Замените носитель каждые три дня.
    7. На 7 день, Aspirели культуральной среды и промыть клетки с DPBS. Добавить 3 мл 0,05% трипсина в каждую чашку и переварить при 37 ° С в течение 5 мин.
    8. Добавьте 5 мл FB СМИ, чтобы утолить трипсина. Осторожно открепления клеток с клеточным скребком. Внесите СМИ вверх и вниз для дальнейшего механически отделить ткани.
    9. Сбор клеток и фильтруют через 40 мкм ячейки сита, чтобы избежать загрязнения фрагментов тканей сердца, а затем осадить клетки центрифугированием при 200 мкг в течение 5 мин.
    10. Вымойте клетки один раз MACS-буфера и клетки готовы для сортировки.
  2. Создание сердечные фибробласты из ферментов методом пищеварения
    1. Урожай GFP положительные сердца как 2.1.1. Перенесите все сердца в 10 см блюдо с 10 мл ледяной DPBS.
    2. Сожмите желудочки с стерильным пинцетом, чтобы удалить кровь и промыть один раз ледяной DPBS.
    3. Обрезать сердца, чтобы быть свободным от других тканей и жира.
    4. Разрежьте каждый сердце в примерно 4 частей, которые по-прежнему слабо связанных.
    5. Если менее 20 сердца, сердца передачи в 15 мл коническую пробирку 8 мл теплой 0,05% трипсина-ЭДТА, и инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин.
      1. Если есть 20-30 сердца, сердца передачи в 50 мл коническую пробирку с 10 мл теплого 0,05% трипсина-ЭДТА, и инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин.
    6. Откажитесь от трипсина и добавить 5 мл (менее 20 сердец) или 10 мл (для 20-30 сердца) теплой тип II коллагеназы (0,5 мг / мл) в HBSS.
    7. Вихревые трубки на вихревом смесителе в течение 1 мин при уровне скорости около 4 до 6 (если жидкость не вставать с крышкой, то скорость в порядке).
    8. Выдержите трубки в 37 ° С на водяной бане в течение 3-5 мин.
    9. Vortex трубку в течение 1 мин.
    10. Осадок в течение 1 мин под действием силы тяжести до тех пор, пока кусочки ткани осесть, сбора жидкости в новую пробирку, содержащую 5 мл холодной FB среды.
    11. Повторите шаги 3-5 2.2.6-2.2.10 раз.
    12. Смешайте все коллекции с помощью фильтрации через фильтр 40 мкм клетокчтобы суспензии отдельных клеток.
    13. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
    14. Ресуспендируют клеток в 10 мл буфера MACS и центрифуге при 200g в течение 5 мин при 4 ° С.
    15. Необязательно: Если существует много клеток крови, ресуспендирования клеток с 1 мл РБК буфера для лизиса (150 мм NH 4 Cl, 10 мМ КНСО 3 и 0,1 мМ ЭДТА), держать на льду в течение 1 мин, затем разбавляют 10 мл MACS буфер и центрифугируют при 200 х г в течение 5 мин. Вымойте еще раз с MACS буфера.
  3. Выделение Thy1.2 + фибробластов по MACS (магнитно-активированных клеток сортировка)
    1. Определить количество жизнеспособных клеток через окрашивания трипановым синим.
      1. Возьмите 10 мкл клеток из суспензии на 10 мл клеточной этапе 2.2.14. Смешайте его с 10 мкл 0,4% трипанового синий раствор.
      2. Добавить смесь к гемоцитометра. Позвольте ему стоять в течение 3-5 мин, а затем изучить непосредственно под микроскопом. Мертвые клетки окрашиваются в синий и жизнеспособных клеток неокрашенных.
        3. Count все жизнеспособные клетки в четырех угловых 1 мм квадратов гемоцитометре. Определить жизнеспособного количества клеток: среднее количество за квадратный х 2 (фактор разведения) х 10 х 10 4 (общий объем клеточной суспензии).
    2. Для менее чем 1 х 10 7 клеток, ресуспендирования клеток с 10 мкл Thy1.2 микросфер в 90 мкл охлажденной MACS буфера. Добавить еще бусы пропорционально, если есть более чем 1 х 10 7 клеток. Хорошо перемешать и инкубировать в холодильнике (2-8 ° С) в течение 30 мин.
    3. Добавить 10 мл MACS-буфера и образцы вращаются на 200 мкг в течение 5 мин; Промывают один раз 10 мл буфера MACS и центрифуги снова.
    4. Принесите объем до 2 мл в MACS буфера.
    5. Настройка МАКС Сепаратор в капот. Вставка столбца LS в сепаратор. Применение 3 мл буфера для MACS колонке, чтобы уравновесить его.
    6. Pass клеточной суспензии через уравновешенную колонку LS.
    7. Промыть 3 раза с 2 мл MACS буфера каждый раз.
    8. Возьмите колонку LS выкл тон сепаратор и элюируют 3 раза с 2 мл MACS буфера в новую пробирку на 50 мл.
    9. Спин при 200g в течение 5 мин.
    10. Ресуспендируют клеток в 10 мл FB СМИ, подсчет клеток и семян в планшеты надлежащего плотности. Для фибробластов, полученных от метода эксплантов культуры, посев плотность клеток может быть около 2-3 х 10 4 клеток / лунку 24 луночного планшета. Для фибробластов, полученных от фермента методом пищеварения, плотность клеток может быть около 4-5 х 10 4 клеток / лунку 24 луночного планшета.

3. Генерация ретровируса для ICM перепрограммирования

Примечание: Выполните следующие шаги в BSL2 биологическом Кабинета безопасности в стерильных условиях. Надлежащая утилизация трансфицированных клеток, наконечники пипеток и труб рекомендуется, чтобы избежать риска опасностей окружающей среды и здоровья.

  1. Поддержание Plat-E клеток в Plat-E, дополненной 1 мкг / мл пуромицин и 10 мкг / мл бlasticidin при 37 ° С с 5% СО 2.
  2. На 2-й день, замените носитель по Plat-E культуральной среде не хватает пуромицин и бластицидин.
  3. В день 0, разделить Plat-E клеток в 10 см чашки за день до трансфекции приблизительно 4-5 × 10 6 клеток на чашку. Клетки должны быть ~ 80-90% сплошности в день трансфекции.
  4. В день 1, изменение питательных сред для трансфекции клеток на средах в течение 1 часа до трансфекции. Процедура трансфекции выглядит следующим образом:
    1. Трансфекция с использованием коммерческих наборов
      1. Смешайте 20 мкл реагента для трансфекции (например, LipofectAMINE) и 500 мкл сыворотки снижается СМИ (например, Opti-MEM),. Добавить 10 мкг плазмиды ретровирусов еще 500 мкл сыворотки сниженным СМИ. Инкубируют каждый смеси при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
      2. Медленно добавить смесь плазмиды трансфекции смеси. Этот шаг может занять 15-30 сек. Выдержите смесь в течение 20 мин при комнатной температуре (раствор может появиться облачно).
      3. Добавить смесь по каплям к клеткам.
      4. Инкубируют в течение ночи в 37 ° С инкубатор.
    2. Трансфекция с использованием фосфата кальция.
      1. Смешайте 40 мкл 2,5 М CaCl 2 и 440 мкл DDH 2 O, а затем добавить 20 мкг плазмиды ретровирусной (регулировать количество DDH 2 O, так что общий объем составл ет 500 мкл).
      2. Добавить 500 мкл 2x HBS в 15 мл коническую трубку.
      3. Vortex ОБД и тем добавить смесь кальция-ДНК в HBS по каплям. Этот шаг занимает около 30 сек для каждого образца. Так максимально сделать 3-4 образцов одновременно.
      4. Выдержите при комнатной температуре в течение 3 мин инкубации в течение больше времени приводит к большей осадка и менее клеток займет осадка.
      5. Добавить смесь по каплям к клеткам и наблюдать под микроскопом 20Х. Изобразительное осадки (много маленьких хороши, но несколько больших не хорошо) должно быть видно.
      6. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С инкубатор.
  5. На 2-й день, изменить СМИ на клетки с 8 мл предварительно нагретой культура СМИ. Инкубируют в течение 24 часов.
  6. На 3-й день и 4-й день, собирают супернатант культуры из блюд с помощью 10 мл стерильного одноразового шприца, фильтрация его через 0,45 мкм размер пор фильтра из ацетата целлюлозы, и передачи в 50 мл пробирку. Добавить 2 мл раствора ретровируса осадков каждому 8 мл вируссодержащей супернатанта. Аккуратно перемешать и инкубировать в течение ночи при 4 ° С.
  7. На 5 день вращаться вирусную смесь при 1500 х г при 4 ° С в течение 30 мин. Вирусные частицы должны появляться в белом осадке на дне пробирки.
  8. Удалите супернатант. Спин вниз остаточный раствора центрифугированием при 1500 х г в течение 5 мин. Удалить все следы жидкости стремлением, принимая большую заботу, чтобы не нарушить осажденных частиц в ретровирусных таблетки.
  9. Ресуспендируют гранул ретровирусных с 100 мкл буфера для DPBS каждые 8 ​​мл вирусной супернатант. Алиготевирус на льду. Использование сразу или хранить при -80 ° С.

4. Перепрограммирование фибробластов сердечных

  1. Добавьте 4 мкл 10 мг / мл раствора Полибрен в 10 мл среды ICM, и аккуратно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Конечная концентрация полибрена это 4 мкг / мл.
  2. Добавить 500 мкл среды, содержащей ICM полибрена в каждую лунку 24-луночного планшета затравку фибробластов.
  3. Добавить 10 мкл ретровируса в каждую лунку содержащих либо 2-3 х 10 4 клеток эксплантата культуры или 4-5 х 10 4 клеток методом ферментативного расщепления. Количество вируса должна быть пропорционально увеличена с увеличением количества клеток в различных культуральных планшетах или кухни. Поместите пластину в 37 ° C инкубаторе в течение 24-48 часов, чтобы позволить вирусную инфекцию. Время линия для сердечной перепрограммирования показано на рисунке 1.
  4. После вирусной трансдукции, заменить вирусов, содержащий носитель с 500 мкл регулярной ICM СМИ.
  5. Изменить СМИ каждые 2-3 дней. Для позитивной селекции вирусных трансдуцированных клеток, добавить ICM среде с пуромицин по 2 мкг / мл к клеткам-мишеням. Держите его в течение трех дней. После этого сохранить пуромицин в среде ICM при концентрации 1 мкг / мл.
  6. Через три дня после вирусной инфекции, принимать пластины из инкубатора и помещают его под инвертированным флуоресцентным микроскопом (20х), чтобы наблюдать выражение GFP.
    Примечание: Через десять дней после вирусной инфекции, клетки могут быть собраны для анализа FACS анализа и ICC для определения эффективности перепрограммирования (на этапе 5, и 6).
  7. Четырнадцать дней после вирусной инфекции, заменить ICM СМИ с B27 СМИ. Изменить СМИ каждые три дня. Спонтанное локусы избиение клеток может появиться из трех (клеток фермента методом пищеварения) или четырех (клеток методом культивирования эксплантов) недель после вирусной трансдукции.

5. Анализ Иммуноцитохимическая перепрограммирования эффективности

  1. Промойте клеткильдом PBS холодной три раза; удаления избытка раствора.
  2. Добавить 0,5 мл ICC фиксации буфера в каждую лунку 24-луночных планшетах. Зафиксировать клетки при комнатной температуре в течение 15-20 мин.
  3. Промыть клетки с PBS три раза.
  4. Добавить 0,5 мл ICC проницаемости буфер в каждую лунку в планшетах 24 также. Клетки проницаемыми при комнатной температуре в течение 15 мин.
  5. Промыть клетки с PBS три раза.
  6. Добавить 0,5 мл ICC блокирующего буфера в каждую лунку 24-луночного планшета, инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
  7. Разводненная первичные антитела с окрашиванием МТП буфера. Добавить 200 мкл антител решения в каждую лунку и инкубируют в течение ночи при 4 ° C. Факторы разбавления антитела перечислены в материалов.
  8. На следующий день, мыть клетки с PBS три раза.
  9. Добавить 200 мкл вторичного антитела решения к клеткам и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре в темный.
  10. Промыть клеток PBS три раза.
  11. Добавить 150 мкл раствора, содержащего монтажные DAPI в каждую лунку. Разрешить для окрашивания ядер в течение 1 мин. затемпокрыть каждую лунку с круглым покровным стеклом и слегка нажмите на скольжение по отношению к нижней поверхности пинцетом, чтобы удалить пузырьки воздуха.
  12. Аспирируйте избытка раствора и образцы готовы для работы с изображениями. Представительные изображения, показывающие перепрограммировать клетки, которые экспрессируют маркер сердечной cTnT и αActinin на d14, показаны на рис 2B.

6. Анализ FACS перепрограммирования эффективности

  1. Тщательно промыть клетки один раз DPBS. Добавить 0,3 мл трипсина (0,05%) в каждую лунку и инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин.
  2. Аккуратно постучите по планшету для облегчения подъема клеток. Проверить открепления клеток под микроскопом. Добавить 1 мл FACS буфера в каждую лунку, когда большинство клеток диссоциируют. Пипетка вверх и вниз для дальнейшего механического диссоциации клеток.
  3. Передача клеток в 24-луночный планшет в 96-луночные планшеты глубокой скважины скважины к скважине. Спин при 200g в течение 5 минут при 4 ° С для сбора клеток.
  4. Вымойте клетки один раз сFACS-буфера.
  5. Добавить 100 мкл решения фиксации / проницаемости для ресуспендирования клеток в течение 20 мин при 4 ° С.
  6. Вымойте клеток дважды 1x промывочного раствора, гранул и удалить супернатант.
  7. Подготовка первичной решение антител против GFP и cTnT в 1x промывочного буфера. Тщательно ресуспендирования каждый образец с раствором 50 мкл антител и инкубируют при 4 ° С в течение 30 мин.
  8. Вымойте клеток один раз в 1x промывочного раствора, гранул и удалить супернатант.
  9. Добавить 50 мкл раствора, содержащего вторичное антитело Alexa Fluor 488 конъюгированный осла против кролика IgG и Alexa Fluor 647 конъюгированный осла против мыши IgG к каждому образцу. Выдержите при 4 ° С в течение 30 мин в темноте.
  10. Вымойте клеток один раз в 1x промывочного раствора, гранул и удалить супернатант.
  11. Ресуспендируют клеток в 400 мкл буфера фиксации (DPBS с 1% PFA). Перевести ячейку в FACS трубы с сотового фильтра крышкой. Образцы готовы для обнаружения FACS. Представитель FACS анализ перепрограммирования efficiencу с помощью pMxs-пуромицину МГТ построить с или без отбора пуромицином показано на рисунке 2А.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Шаги перепрограммирования обобщаются схеме на фиг.1. После MGT трансдукции, GFP выражение в перепрограммировании клеток может быть обнаружен уже в день 3. Пуромицин выбор трансдуцированных клеток начинается с 3-й день и сохраняется в течение первых двух недель, если PMX-Puro -MGT используется конструкция. Днем 10 до 14 дня, выражение кардиомаркеров как cTnT и αActinin могут быть обнаружены как ICC (Фигура 2В, стадия 5) и FACS-(фиг.2А, шаг 6), указывая, что исходные фибр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для успешного поколения ICM при использовании этого протокола, есть несколько важных факторов, которые оказывают влияние на общую эффективность. В частности, условия, начиная фибробластов и качество кодирования ретровирус MGT может значительно повлиять на эффективность перепрограммирования.

Важно, чтобы генерировать фибробласты, как свежей и здоровой, насколько это возможно. Для способа культивирования эксплантов, фибробласты могут быть использованы, прежде чем через семь дней после эксплант...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны за экспертную техническую помощь от UNC Flow Cytometry Core и UNC Microscopy Core. Мы благодарим сотрудников лабораторий Цянь и Лю за полезные обсуждения и критические рецензии на рукопись. Это исследование было поддержано грантом NIH/NHLBI R00 HL109079 доктору Лю и грантом Американской кардиологической ассоциации (AHA) на развитие ученых 13SDG17060010 и новым стипендиальным грантом Медицинского фонда Эллисона (EMF) AG-NS-1064-13 для доктора Цянь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
антисердечный тропонин TThermo ScientificMS-295-PO1:200 для FACS и 1:400 для ICC
anti-GFPLife TechnologiesA111221:500 для FACS и ICC
анти-aActininSigma-AldrichA78111:500 для обоих FACS и ICC
анти-Connexin43Sigma-AldrichC62191:500 for  ICC
anit-Mef2cAbcamab646441:1,000 для ICC 
anti-Gata4Santa Cruz Biotechnologysc-12371:200 для ICC
anti-Tbx5Santa Cruz Biotechnologysc-178661:200 для ICC
Alexa Fluor 488– конъюгированный ослиный антикролиацкий IgGJackson ImmunoResearch Inc711-545-1521:500 для FACS и ICC
Alexa Fluor 647– конъюгированный ослик антимышиный IgGJackson ImmunoResearch Inc715-605-1501:500 для FACS и ICC
Cytofix/Cytoperm набор для внутриклеточного окрашиванияBD Biosciences554722
Rhod-3 Набор для визуализации кальцияLife TechnologiesR10145
Thy1.2 микрогранулыMiltenyi Biotec130-049-101
Vectashield раствор с DAPIVector labsH-1500
FBSSigma-AldrichF-2442
Трипсин-ЭДТА (0.05%)Corning25-052
PRMI1640 mediumLife Technologies11875-093
B27 дополнениеLife Technologies17504-044
IMDMLife Technologies12440-053
Opti-MEM Восстановленная сыворотка MediumLife Technologies31985-070
M199 MediumLife Technologies10-060
DMEM, с высоким содержанием глюкозыLife Technologies10-013
Пенициллин-стрептомицинCorning30-002
Заменимые аминокислотыLife Technologies11130-050
Липофектамин 2000Life Technologies11668500
бластицидинLife TechnologiesA11139-03
пуромицинLife TechnologiesA11138-03
Коллагеназа IIWorthingtonLS004176
полибренMilliporeTR-1003-G
Triton X-100FisherBP151-100
CaCl< sub>2Sigma-AldrichC7902
HEPESSigma-AldrichH4034
NaClSigma-AldrichBP358-212
KClSigma-AldrichPX1405
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
ГлюкозаSigma-AldrichG6152
Бычий сывороточный альбуминFisher9048-46-8
параформальдегидEMS15714
Ретровирусный осадочный растворALSTEMVC-200
0,4% Трипановый синий растворSigma-AldrichT8154
желатинSigma-AldrichG1393
PBS Dulbecco без CaCl2 и MgCl2 (D-PBS, 1x)Sigma-AldrichD8537
HBSS (сбалансированный солевой раствор Хэнкса)Corning21022
LSколонка Miltenyi Biotec130-042-401
0.45 μ m фильтр из ацетата целлюлозы Thermo Scientific190-2545
24-луночные планшетыCorning3524
10 см Чашки для культивирования тканей Thermo Scientific172958
60 мм чашка для культивирования в центральной лунке   Corning3260
96 Well Clear V-образное дно 2 мл Полипропиленовая глубокая скважинная пластинаDenville ScientificP9639
Полистирольные трубки с круглым дном с крышкой клеточного фильтра BD Biosciences352235
ЦентрифугаEppendorf5810R
Vortexer MINIVWR58816-121
EVOS FL Auto Cell Imaging SystemLife TechnologiesAMAFD1000
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MidiMACS СепараторMiltenyi Biotec130-042-302
Круглая стеклянная крышка скользящаяЭлектронная микроскопия Sciences72195-15
,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2014).
  2. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
  3. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
  4. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
  5. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
  6. Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr Top Dev Biol. 100, 319-344 (2012).
  7. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105, 1164-1176 (2009).
  8. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
  9. Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
  10. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  11. Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
  12. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577(2013).
  13. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
  14. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
  15. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  16. Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
  17. Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
  18. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
  19. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
  20. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
  22. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
  23. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
  24. Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. , (2014).
  25. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. , (2014).
  26. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  27. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  28. Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652(2012).
  29. Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
  30. Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. , 116-216 (2015).
  31. Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Induced CardiomyocytesCardiac FibroblastsPolycistronic ConstructGata4 Mef2c Tbx5Retroviral ReprogrammingCell IsolationFlow Cytometry AnalysisImmunochemistry DetectionPurmycin SelectionGFP Expression

Похожие статьи