Представленные здесь единое описание методов, которые могут быть использованы для разработки, преобразования, администрировать и проверить гетерологичный экспрессию белка пробиотических дрожжей сахаромицеты буларди.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Трансформация пробиотических дрожжей и их восстановление из желудочно-иммунных тканей После желудочный зонд у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Разработка рекомбинантной пероральной терапии позволит более непосредственно воздействовать на иммунную систему слизистых оболочек и улучшить способность бороться с желудочно-кишечными расстройствами. Адаптация пробиотических дрожжей, в частности, к этому подходу имеет ряд преимуществ. Эти штаммы не только обладают потенциалом синтеза широкого спектра сложных гетерологичных белков, но также способны выживать и защищать эти белки во время транзита через кишечник. Однако важно отметить, что этот подход требует опыта работы со многими разнообразными лабораторными методами, которые обычно не используются в тандеме. Кроме того, несмотря на то, что отдельные протоколы трансформации дрожжей хорошо характеризуются для широко используемых лабораторных штаммов, акцент здесь делается на альтернативных подходах и важности оптимизации трансформации для менее хорошо охарактеризованных пробиотических штаммов. Подробное описание этих методов поможет облегчить обсуждение наилучших подходов к тестированию пробиотических дрожжей в качестве средств пероральной доставки лекарств и действительно послужит продвижению разработки этой новой стратегии для желудочно-кишечной терапии.
Введение
Пробиотические микроорганизмы интригующая потенциальным средством эффективно и экономично доставлять гетерологичных белков в желудочно-кишечном тракте. Эти организмы способны выживать при прохождении через желудочно-кишечный тракт еще не колонизировать это один, что позволяет контролируемой дозировки и ограничение воздействия на препарат выражены. Кроме того, способность легко проектировать эти организмы производить гетерологичный белок в больших масштабах оказывает им экономичной альтернативой синтетических частиц доставки. Однако разработка такого подхода, как недавно продемонстрировано с использованием ауксотрофным пробиотических дрожжей сахаром....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. УФ мутагенеза для генерации Ауксотрофные штаммов дрожжей
- Создать кривые выживаемости определение необходимой дозы УФ-облучения
- Подготовьте YPD (дрожжевой экстракт пептон декстроза) носитель и другие реагенты, перечисленные в таблице 1, в соответствии со стандартными процедурами 26 и инокуляции единичных колоний в 5-10 мл YPD средах. Выдержите культур на роликовом барабане при температуре 30 ° CO / N до насыщения, по крайней мере 8 часов.
- Определить концентрацию клеток O / N культур с использованием спектрофотометра путем разбавления клеткам 1:10 в воде в пластиковую кювету. Развести клетки в концентрации 10....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Генерация кривой выживаемости следующей УФ-облучения требует металлизацию разбавленных дрожжевых клеток таким образом, что различные колониеобразующих единиц (КОЕ) способны образовывать. Каждый образец 500 мкл собирали, как описано выше, содержит около 5 х 10 6 клеток; Однако, больше чем 100 колоний на пластину трудно точно отличить. Покрытие неразбавленный образец, а также серийные разведения 1:10 облученных клеток, таким образом, гарантирует, что КОЕ могут быть перечислены н.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Вместе протоколы в данном документе описываются основные шаги, необходимые для разработки и тестирования ауксотрофных пробиотических штаммов дрожжей для доставки гетерологичной терапевтического белка в кишечнике. Эта манипуляция и тестирование рекомбинантного пробиотика дрожжей требует методов и ресурсов, с которыми любой человек лаборатория не может себе быть знакомы. Таким образом, хотя многочисленные предыдущие исследования описывали выше протоколы для нескольких дрожжевых и мыши штаммов, эти методы имеют не известно.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Авторы признают финансирование через Детского Центра иммунологии и вакцинам и NIH Нью Новатор премии (1DP2AI112242-01) присуждена Трейси Дж Агнца. Авторы также благодарят Наталью П. Дегтярева за щедрое вклада Rad1 S. CEREVISIAE.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Спектрофотометр SmartSpec 3000 BioRad | 170-2501 | Пример спектрофотометра для определения концентрации клеток и OD600 культур дрожжей | |
| New Brunswick Roller Drum | Eppendorf | M1053-4004 | Пример роликового барабана для инкубации дрожжевых культур |
| UV Stratalinker 2400 | Stratagene | 400075-03 | Пример stratalinker |
| Stuart Colony Counter SC6PLUS | 11983044 | Fisher Scientific | Plate Стенд с рекордами увеличения, колония рассчитывает на ощущение давления от ручки |
| Scienceware Colony Counter | F378620002 | Bel-Art Scienceware | Ручное загон для колоний |
| Устройство для нанесения покрытий | Fisherbrand | 09-718-1 | Пример подставки и подушечек для нанесения покрытий |
| Вельветовые квадраты | Fisherbrand | 09-718-2 | |
| L-образные разбрасыватели стерильных клеток | Fisherbrand | 14665230 | |
| Дезоксирибонуклеиновая кислота, одноцепочечная из яичек лосося | Sigma-Aldrich | D7656-1ML | Пример носителя ДНК для трансформации LiOAc дрожжей |
| Gavage | иглы Braintree Scientific | N-PK 002 | Для мышей весом 15-20 г рекомендуется использовать иглу 22 калибра (шарик 1,25 мм), длиной 1 дюйм, прямую многоразовую иглу для зондажа. Для мышей весом более 20 g, 20 калибра или больше можно использовать прямые или изогнутые иглы для полос |
| мл стерильный одноразовый туберкулиновый шприц | Becton Dickinson | BD 309659 | |
| Тупые щипцы, такие как Electron Microscopy Sciences 7" (178 мм) зубчатый наконечник, щипцы с широким захватом | Electron Microscopy Sciences | 77937-28 | Пример тупых щипцов, необходимых для вскрытия |
| Прямые и изогнутые ножницы для рассечения | Электронная микроскопия Sciences | 72966-02 и 72966-03 | Примеры ножниц, необходимых для диссекции |
| IMDM | Life technologies | 12440053 |
Ссылки
- Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).
- Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
