Количественная рыба плавание поведение в ответ на Острое отравление водного раствора меди с помощью с помощью компьютера видео и цифрового анализа изображений

Краткое содержание

Измерение воздействия загрязнителей окружающей среды на поведение рыбы часто субъективны и сложным особенно при работе с сублетальных. Описаны методы , включая видео технологию для количественной оценки плавание поведение ранней жизни стадии белого осетра (Acipenser transmontanus) во время и после 96 ч острого воздействия различных концентраций меди.

Аннотация

Поведенческие реакции водных организмов на загрязнители окружающей среды могут быть предшественниками других эффектов, таких как выживание, рост или размножение. Тем не менее, эти реакции могут быть незначительными, а измерение может быть сложным. Используя молодь белого осетра (Acipenser transmontanus) с экспозицией меди, в данной статье иллюстрируются методы, используемые для количественной оценки поведенческих реакций с использованием компьютерного видео и цифрового анализа изображений. В предыдущих исследованиях наблюдались серьезные нарушения в плавательном поведении у белого осетра на ранних стадиях жизни во время острого и хронического воздействия меди. Поведение осетровых быстро ухудшалось до такой степени, что выживание в полевых условиях оказывалось под угрозой, так как рыба была бы унесена вниз по течению или легко захвачена хищниками. Цели этого исследования состояли в том, чтобы проиллюстрировать протоколы количественной оценки плавательной активности во время серии острых воздействий меди, чтобы определить время воздействия на ранних стадиях развития, а также понять значение этих реакций относительно выживания этих уязвимых рыб на ранних этапах жизни. Поскольку смертность находится в континууме времени, определение того, когда медь впервые влияет на способность плавать, помогает нам понять последствия для влияния на популяционный уровень. Используемые методы легко адаптируются к экспериментальным схемам с другими организмами и стрессорами.

Введение

Понимание того, как загрязняющее воздействие может повлиять на поведение порой очень сложным и субъективным. Поведение, как правило, определяется как ряд откровенных, наблюдаемыми, деятельность всего тела, которые действуют через центральную нервную систему и позволяют организму выживать, расти и размножаться. Изменения в поведении в результате воздействия токсиканта являются одними из наиболее чувствительных показателей экологического стресса часто между 10-100 раз более чувствителен по сравнению с выживанием ^1. Большинство этих исследований рассматривались плавательной активности, вентиляции и нагула поведение рыбы ^2,3,4. Плавательной активности является наиболее часто используемым сублетальная конечной точки при определении изменений в поведении в ответ на загрязнителя в тестах на токсичность ^5. Плавательные переменные включают частоту и продолжительность движения, скорость и расстояние, частоту и угол поворотов, положение в толще воды и образец плавания. Плавание деятельностьэффективной мерой плавательного поведения при оценке чувствительности к токсиканта на основе критериев , предложенных в главе 9 Рэнда ⁶ в книге Основы водной токсикологии.

Эта статья представляет собой токсикологическое исследование в качестве примера того , как токсичность меди к ранней жизни стадии белого осетра (Acipenser transmontanus) на различных этапах раннего развития в воде только обнажений по отношению к осетровые плаванию поведение оценивали и иллюстрирует методы количественной оценки плавание поведение.

В предыдущих исследованиях, неблагоприятные поведенческие реакции были очевидны с ранним началом в течение первых нескольких дней острых и хронических воздействий на меди и стали все более серьезными в течение длительности воздействия и концентрации ^7,8,9. Масштабы и сроки наступления этих поведенческих реакций, вероятно, достаточно, чтобы ограничить долгосрочное выживание и, таким образом, представляют интерес, учитывая последствия для recruiотказ tment ^10. Для того, чтобы точно интерпретировать значение этой чувствительности к методам и процедурам воздействия металла были разработаны для количественной оценки временной ход и степень поведенческих нарушений по отношению к концентрации меди.

протоколы испытаний для поведенческой функции и развития были созданы на основе анализа накладных видео образцов осетровых рыб в камерах облучения. Видео образцы при условии качественной оценки развития и функционирования среди медных обработок на протяжении всего периода экспозиции. Поведение и кров ищущий активность оценивали во время воздействия на водных концентраций меди, чтобы определить время, чтобы осуществить и охарактеризовать временную последовательность нарушений, что влияет на кров потребовался, вялость, плавание координацию, равновесие и дыхание. Кроме того, видеозаписи были сделаны из осетровых рыб субдискретизированных из каждой репликации с целью количественного документирующего спонтанного плавательном ACTiVity. Эти конечные точки включали меры по продолжительности или время , проведенное перемещение, плавание скорость и расстояние , пройденное ^5,11 с использованием коммерчески доступного цифрового изображения пакет программного обеспечения для анализа. Это программное обеспечение определяет контуры каждого изображения в пределах поля зрения и из этого, определяет центр тяжести для каждого изображения. Затем программное обеспечение может отслеживать положение каждого центроида в кадре с помощью последовательности кадров, чтобы определить пути движения.

Это исследование выполнило все применимые секции Заключительных Правил на основании положений Закона защиты животных (9 CFR), а также со всеми институциональными руководящих принципов гуманного обращения исследуемых организмов в процессе культивирования и экспериментов. По окончании исследования все рыбы были умерщвлены в соответствии с руководящими принципами, соответствующих утвержденных по уходу и использованию комитета Institutional животных для Геологической службы США, научно-исследовательский центр экологической Колумбии по.

Протокол

1. Установка для разбавителя Личиночная Sturgeon Воздействие ВОДНЫХ меди Концентрации

1. Настройка экспозиции с использованием системы проточный , такие как модифицированной системы ¹² и Mount разбавителя Brungs следующие руководящих принципов по ASTM International ^13,14,15.
2. Выберите 25 мкг / л в качестве высокой концентрации меди на основе предыдущих результатов испытаний, где наблюдались эффекты около 4-6 мкг / л. Используйте хч меди II пентагидрата сульфата (> 98% чистоты) и смешать тестовый раствор.
   Примечание: Пример Концентрация серии для экспозиции составляют 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,0625 и 0 мкг / л. С помощью 50% серийных разведени х, начина с 25 мкг / л, так как высокая концентрация будет направлена ​​на диапазон концентраций, наблюдаемых вызывает ухудшение поведенческий.
3. Подготовка испытания исходного раствора в мерную колбу вместимостью 48 часов до начала экспозиции и установить, чтобы доставить прокалывать камеру смешивания разбавителя используяавтоматизированный шприц дозатор.
4. Используйте шаблон электронной таблицы, чтобы определить вес химического вещества, которое нужно добавить к 1 л деионизированной воды, что приведет к 25 мкг / л концентрации меди, когда смесительная камера разбавителя с шипами с 1 мл испытуемого раствора.
   Примечание: На рисунке 1 показан пример шаблона электронной таблицы для химической подготовки запаса для испытаний на токсичность разбавителя.
5. Взвешивают 195 мг пентагидрата сульфата меди сорт реагента II с использованием аналитических весов и вылить в 1 л мерную колбу и перемешивают с 1 л деионизированной воды для запаса концентрации 48,65 мг / л.
6. Поместите воздухозаборную трубку из автоматического шприца дозатора в испытательную маточного раствора и установить объем шип до 1 мл и поверните разбавителя на листать переключатель питания и дайте цикл в течение 48 часов позволит ему уравновешиваться в соответствующей концентрации меди до начала чулка осетр.
7. Прикрепите в линии 4-полосная сплиттер потока 16 каждой линии подачи для разбиения потока воды для каждой из четырех дублированных камер выдержки в водяной бане разбавителя. Гравитационной подачи воды. Цикл воды через разбавителя, когда питание включается разбавителя и открывается электромагнитный клапан, позволяя воде течь к размыванию танков. Установка чиллера до 15 ° С и включите водяной насос для циркуляции воды в водяной бане разбавителя.
   Примечание: Этот процесс регулируется с использованием автоматизированного таймера.
8. Установите на цикл разбавителя каждые 30 мин с помощью автоматического таймера и доставить 250 мл воды для испытаний с каждым циклом, в результате чего в 12 добавлений объема в день, чтобы повторить каждый испытательную камеру.
9. Выбор экспозиции испытательных камер на основе размеров осетра для поддержания приемлемой скорости загрузки, которая <10 г сырого веса рыбы / л в любой камере в любой момент времени. Например, для проведения экспозиций с 30 днем ​​после люком (DPH) белого осетра (средний вес в граммах 0,17 г) используют 12 х21,5 см ² стеклянные банки с 4 см отверстие сбоку. Накройте эту сторону с экраном из нержавеющей стали с размером ячеек 30 микрон для обеспечения потока через испытательной воды. Объем воды для испытаний в банках экспозиции 1 Л.
10. С помощью 50 мл пластиковый шприц взять две дублирующие 50 мл пробы воды при каждой концентрации в общей сложности 12 проб и дозирования воды для испытаний в 100 мл стеклянных стаканах и измерения растворенного кислорода (DO), температура, проводимость, рН, щелочность, жесткость, общая аммиак, основные катионы, основные анионы и растворенного органического углерода с использованием стандартного торгового оборудования и следовать инструкциям производителя.
    Примечание: образцы должны быть приняты в начале и конце экспозиции.
11. Для сбора подвыборки для химического анализа, используют 25 мл пластиковый шприц, составлять примерно 24 мл воды для испытаний из камер облучения с использованием Sipper соломы, прикрепленную к шприц вместо иглы.
12. Удалите Sipper солому из синтеРинге и поместите полипропиленовым фильтром корпуса картриджа с размером пор 0,45 мкм, полиэфирсульфона мембрану на пластиковый шприц.
13. Нажмите 4 мл воды для испытаний через фильтр и утилизировать.
14. Разлить оставшиеся 20 мл воды для испытаний через фильтр в кислотной очисткой полиэтиленовой бутылки и подкисления до 1% объем / объем с высокой чистоты, 16 М азотной кислоты для хранения до 3-х месяцев.
    Примечание: Образцы для химического анализа должны быть приняты в инициировании, середине и конце экспозиции , чтобы подтвердить концентрации меди.
15. Провести химический анализ с помощью индуктивно связанной плазмы масс - спектрометрии следующий по охране окружающей среды США Агентство Метод 6020a ¹⁷
16. После принятия всех проб воды и разбавителя является езда на велосипеде, акции 10 (случайный, беспорядочным) осетровых рыб в каждой реплицировать испытательную камеру. Сбор осетра из культуральной резервуар, где они размещались с помощью мелкоячеистой неабразивное сеть. Поместите осетра в небольшом Buckeт культуральной воды. В общей сложности 240 рыб необходимы для начала экспозиции.
17. Не кормить рыб во время экспозиции.
    Примечание: Пожалуйста , обратитесь к рисунку 1 для визуальной настройки макета разбавителя.
18. Прочитайте тест каждый день в течение продолжительности экспозиции и записи смертности рыбы и контролировать поведение плавание.
    Примечание: Другие конечные точки для поиска включают вялость, потеря равновесия, изменения в дыхании, изменения в пигментации, положение рыбы в толще воды, скрывая активность и любые другие отклонения , которые могут быть визуально идентифицированы.
    Примечание: Прочитайте тест в то же время каждый день для последовательности.
19. Мера и количественную оценку интенсивности плавания (время рыбы провели перемещение, скорость и расстояние перемещения) с использованием коммерчески доступного цифрового программы отслеживания программного обеспечения.

2. Наблюдения и смертности Графы во время экспозиции

1. Визуально проверьте каждый тестовый чамбры и примечание смертности и наблюдения аномального поведения с использованием поведенческого контрольного списка (таблица 1) на технических описаниях примерно в то же время ежедневно во время экспозиции 96 ч, предпочтительно утром.
   Примечание: Поведения, которые поразительно, нехарактерно, субъективно, качественно отличаются от контроля считаются ненормальными. Оптимально наблюдатель не знает о лечении.
   Примечание: Потеря равновесия определяется как неспособность рыбы , чтобы сохранить вертикальное положение в толще воды и неподвижность определяется как неспособность рыбы , чтобы переместить или плавать , если не подталкивают. Другие нарушения, такие как вялость, гиперактивность, увеличение или уменьшение дыхания, изменения цвета, тремор, судороги, раздутые животы, положение в толще воды и любых других необычных моделей плавания также должны быть записаны на листе данных.
   Примечание: Обратитесь к видео 1 для примеров ненормальногоповедение.
2. Запись и удалить мертвые осетра ежедневно.
3. Использование ручного растворенного кислорода (DO) измерительный прибор с зондом измерения растворенного кислорода на месте и записывать температуру воды в в двух повторах для каждой концентрации экспозиции и записи на листе данных.

3. Видеозапись Плавание Активность

1. Захват образцов видеоданных с использованием ручных видеокамеру установлен на штатив, расположенной непосредственно над испытательной камеры документировать поведенческие отклонения.
2. Для количественной оценки активности плавание, вырезать кусок ПВХ трубы 13 см в диаметре и 13 см в высоту , чтобы использовать в качестве испытательной арены (рисунок 1). Поместите трубу ПВХ в пределах каждого разбавителя соответствующих резервуаров воздействия концентрации меди. Используйте область внутри трубы ПВХ в качестве испытательной арене, поскольку это достаточно большой для осетровых рыб, чтобы плавать свободно.
3. В конце экспозиции 96 ч, случайным образом субсемплировать 5 выживших осетровых рыб из каждой медной concentratioп для измерения для купания деятельности и поместить их в на тестовой арене с использованием небольшой сети сетки.
   Примечание: В более высоких концентрациях тестируемых где осетр смертность была распространена, оставшаяся выживших осетровых рыб должны быть использованы для измерения интенсивности плавания , а в некоторых случаях может быть менее 5.
4. После размещения рыбы в к зоне испытания позволяют рыбе акклиматизироваться в течение 30 мин.
   Примечание: Успешная, без ошибок анализ видео требует высокой контрастности изображения рыбы на фоне с минимумом структуры , которые могли бы затемнить или скрыть изображение рыбы. Образ рыбы должны быть в хорошем фокусе и должна быть свободной от поверхности блики или свободны от искажений из-за движущейся воды, так что система должна быть разбавителя выключена.
5. Через 30 минут, включите на видеокамеру и установите REC для записи плавание активности в течение 2 мин.
6. Эвтаназии рыбу после приема видеозаписи, чтобы определить, будетповеде.
7. Поместите осетра в концентрированном растворе Tricaine метансульфонат (MS222) водой в течение не менее 10 мин, чтобы обеспечить прекращение оперкулярной движения.
   Примечание: концентрации , по меньшей мере , 250 мг / л рекомендуется , и может быть значительно выше , для некоторых видов.
8. Поместите эвтаназии осетра в полиэтиленовый пакет на молнии и место в морозильной камере для утилизации в более позднее время. Включите видео камеру и передавать все видео файлы на компьютер для последующей обработки с использованием цифрового отслеживания программного обеспечения.

4. Меры по плаванию деятельности от воспроизведения видео

1. Найдите файлы данных листа данных и видео для эксперимента необходимо проанализировать. Конвертировать видео файлы в совместимый формат цифрового программного обеспечения для анализа может справиться.
2. Загрузите все файлы, которые будут обработаны в программное обеспечение. Открытое программное обеспечение отслеживания, нажав на иконку. Нажмите на кнопку "Новый эксперимент по умолчанию" под "Создать новый эксперимент« оавтомеханик на главном экране.
3. Введите имя для эксперимента в "Новый эксперимент" диалоговое окно, которое появляется на экране. Выберите файл расположения эксперимента должен быть сохранен. Нажмите кнопку "OK". Выберите "Настройки эксперимента" вариант в разделе "Настройка" .choose "Из видео-файла" в разделе "Video Source".
4. Выберите "1" для "Количество арен". Выберите "3" "Количество предметов на арене". Выберите "Центр обнаружения точки" под заголовком "Гусеничный Features". Выберите требуемые единицы измерения.
5. Выберите опцию "Список Trial" в разделе "Настройка". Нажмите кнопку "Добавить видео" в верхней части экрана. Выберите "Алфавитный порядок" под опцией "Порядок сортировки" на "Добавить видео" диалоговое окно, которое появляется на экране. Нажмите кнопку "Обзор". Перейдите в папку, где видео файлы расположены.
6. Выделить все видео файлы. Нажмите кнопку "Открыть". Нажмите кнопку "Добавить переменную" в верхней части экрана. Введите "Концентрация" в "Этикетка "коробка. Enter" Концентрация меди в микрограмм / л "в поле« Описание ».
7. Выберите "Численный" из выпадающего списка "Тип". Нажмите на поле "предопределенные значения". Выберите "Определить индивидуальные значения" вариант в "предопределить числовых значений" появившемся диалоговом окне.
8. Введите "0", "3", "6", "13", "25", и "50" в пространстве "заранее определенное значение". Нажмите кнопку "Добавить >>" между каждым номером дополнительно. Снимите флажок "Разрешить другим ценностям" вариант. Нажмите кнопку "OK".
9. Выберите "Trial" из выпадающего меню в окне "Область". Введите соответствующую концентрацию для каждого испытания в коробках, предусмотренных. Нажмите кнопку "Добавить переменную" в верхней части экрана. Введите "Репликация" в поле "Label". Введите "Репликация номер" в поле «Описание». Выберите "Численный" из выпадающего списка "Тип".
10. Нажмите на кнопку "PПереопределенные значения "окно. Выберите" Определить индивидуальные значения "вариант в" предопределить числовых значений "диалоговое окно. Введите" 1 "," 2 "," 3 "и" 4 "в" заранее определенное значение "пространства. Нажмите кнопку" Добавить >> "между каждым номером дополнительно. Снимите флажок" Разрешить другие значения "option.Click" OK ".
11. Выберите "Trial" из выпадающего меню в окне "Область". Введите соответствующий номер для каждого реплицировать суда в коробках, предусмотренных. Выберите "Настройки Арена" на вкладке "Настройка" в верхней части экрана. Имя первого параметра "Trial 1". Нажмите кнопку "Grab Фоновое изображение" вариант из "(1 Trial) Настройки Арена" диалоговое окно.
12. Нажмите кнопку "Обзор" в диалоговом окне "Grab Фоновое изображение". Найдите видео файл для Trial 1 и нажмите кнопку "Открыть". Нажмите опцию "захватить" в диалоговом окне "Grab Фоновое изображение" после появления видео. Нажмите на значок белый круг рядом с верхней части экрана ундэр "Настройки Арена".
13. Манипулирование круг, который появляется, так что вся область плавания заключена в круг. Hatch появляются знаки, где определяется площадь арены. Нажмите значок "Калибровка шкалы" вблизи верхней части экрана в разделе "Настройки Арена". Щелкните левой кнопкой мыши на одном краю арены. Удерживайте и перетащите мышь к противоположному концу арены. Отпустите левой кнопкой мыши.
14. Введите "10,5" в "реальном мире расстояния" в окне "Калибровка" Расстояние диалоговом окне. Нажмите кнопку "OK". При необходимости, отрегулируйте калибровочный линию так, чтобы она охватывает весь диаметр круговой арене.
15. Нажмите опцию "Validate Settings Арена" на "Настройки Арена (Trial 1)" диалоговое окно. Адрес любые вопросы, если параметры не проверяются. Щелкните правой кнопкой мыши "Параметры Арены" под опцией "Настройка" на панели инструментов "Эксперимент Explorer" на левой стороне экрана и выберите "New" из меню.
16. Повторите шаги 4.11-4.15 до арены не настройки часпр был создан для каждого испытания. Не забудьте выбрать подходящий видеофайл для каждого испытания. Выберите "Настройки Обнаружение" под опцией "Настройка" на панели инструментов "Эксперимент Explorer" на левой стороне экрана.
17. Выберите "Dynamic Вычитание" из выпадающего меню под заголовком "Метод" в разделе "Настройки обнаружения: Настройки обнаружения 1" диалоговое окно, что appears.Choose различные цвета заливки для каждого субъекта в "Subject Идентификация" в диалоге: "Настройки обнаружения обнаружения Настройки 1" коробка.
18. Выберите "Выбрать видео" и найти видео для Trial 1.click "Открыть" .Select "5.9941" от "Частота выборки" в разделе "Видео" в разделе "Настройки обнаружения: Настройки обнаружения 1" диалоговое окно. Нажмите кнопку "Настройки" для параметра "эталонное изображение" в разделе "Обнаружение" в диалоговом окне: "Обнаружение Обнаружение настроек Настройки 1".
19. Нажмите кнопку "Пуск Learning (C)4; опция в "эталонное изображение" диалога box.Wait для программы, чтобы узнать эталонного изображения. После того как изображение в "эталонное изображение" диалоговое окно появляется без животных, нажмите кнопку "Использовать динамическое опорное изображение" в разделе "Настройки" Приобретение в диалоговом окне.
20. Нажмите кнопку "Закрыть". Выберите "ТЕМНЫЙ" из выпадающего меню "Тема находится" под "Detection" в диалоговом окне: "Обнаружение Обнаружение настроек Настройки 1". Установите меньшее число на "33" и большее число на "153" для "Dark контраст" в разделе "Обнаружение" "Обнаружение Настройки: Настройки обнаружения 1" диалоговое окно.
21. Нажмите кнопку "Сохранить изменения" в правом нижнем углу диалогового окна: "Обнаружение Обнаружение настроек Настройки 1". Нажмите кнопку воспроизведения на диалоговом окне "Управление воспроизведением" и убедитесь, что программное обеспечение успешно отслеживания животных, в отличие от теней или мусора. Настройка номеров для "Dark контраст "по мере необходимости.
22. После того, как отслеживание необходимо, нажмите кнопку "Сохранить изменения" в правом нижнем углу диалогового окна: "Обнаружение Обнаружение настроек Настройки 1". Выберите "приобретение" в рамках опции "Setup" на панели инструментов "Эксперимент Explorer" на левой стороне экрана.
23. Нажмите "Track следующий плановое испытание" в разделе "Настройки" Приобретение диалоговом окне. Проверьте правильность установки проб, видео и арены отображается в разделе "Настройки" в разделе "Настройки" Приобретение диалоговом окне.
24. Отметьте опцию "Detection определяет скорость" в диалоговом окне "Управление" Приобретение. Нажмите на кнопку с зеленым кругом, заключенной в белый квадрат, чтобы начать процесс приобретения. Повторите шаги 4.22-4.23, пока все испытания были отслежены.
25. Нажмите "Профили данных" под опцией "Анализ" на панели инструментов "Эксперимент Explorer" на левой стороне от screen.Choose "Время" в разделе "Вложение" оавтомеханик в панели инструментов "Элементы". Отрегулируйте "To", чтобы "0:02:00" под "Выбор дорожки временного интервала" заголовок в "Time" диалогового окна. Нажмите кнопку "OK".
26. Перетащите "гнездо" окно между блоком "Start" и поле "Результат 1" в области "Профили данных" на правой стороне экрана. Нажмите кнопку "Анализ профиля" в опции "Анализ" на панели инструментов "Эксперимент Explorer" на левой стороне экрана. Нажмите кнопку "Velocity" под "расстоянием и временем" заголовок в "зависимые переменные" панели инструментов которая появляется.
27. Нажмите кнопку "Добавить" на "Velocity" диалогового окна. Нажмите кнопку "Расстояние переехал" под "расстояние и время" заголовок на панели инструментов "зависимые переменные". Нажмите кнопку "Добавить" на "расстояние перемещения" диалогового окна. Нажмите "Движение" в "индивидуального поведения" заголовок в "зависимых переменных" тoolbar.
28. Регулируют "интервал осреднения" на "1" под "Outlier фильтр" заголовок в "движение" диалогового окна. Настройка "Старт скорости" на "2,00" и "Стоп скорость" до "1,75" под "Порог" движется в "движение" диалогового окна.
29. Проверьте оба поля для "Moving" и "не движется" под "Вычислить статистики для" заголовок в "движение" диалогового окна. Нажмите кнопку "Добавить" в нижней части "движение" диалогового окна. Нажмите кнопку "Выход" Анализ в рамках опции "Результаты" в панели инструментов "Эксперимент Explorer" на левой стороне экрана. Нажмите кнопку "Рассчитать" в верхней части экрана.
30. После того, как зависимые переменные вычисляются, нажмите кнопку "Экспорт" в верхней части экрана. Выберите папку назначения в "Экспорт Analysis Output" диалоговое окно. Выберите "Excel" из выпадающего меню "Тип файла" в "Экспорт анализа Outpuт "диалоговое окно. Нажмите кнопку" OK ".
31. Нажмите кнопку "Сохранить эксперимент" на вкладке "Файл" в верхней части экрана. Закройте цифровой отслеживания программного обеспечения. Импорт данных в файл электронной таблицы и анализа с использованием коммерческого статистического пакета программного обеспечения для анализа.

Результаты

Обработка вручную визуальные данные наблюдений показали процента отклонений возрастала с увеличением концентрации меди после всего лишь 72 часов воздействия инициированный с 2 день после люком (DPH) осетровых рыб (рис 2). Видео образцы документально экстремальную влияние воздействия меди на осетра плавательного поведения (Видео 2) и оказана помощь в определении поведения обесценения в результате. В другом примере осетровых рыб при 30 DPH оказались чувствительны к меди экспозиции с 96 ч медианы летальной концентрации эффект (LC50) в 40,3 мкг / л на основе только смертности. Однако, когда сублетальных поведенческие конечные точки потери равновесия и иммобилизации включены наряду со смертностью от чувствительности возрастает с ориентировочной 96 ч концентрации средний эффект (ЕС50) в диапазоне от 2,4 до 5,0 мкг / л. Видеодокументация захватили эти сублетальных эффекты и далее валидированные человека наблюдения поведенческих отклонений, записанныево время экспозиции. Использование цифрового отслеживания программного обеспечения сократить время обработки сообщение значительно при анализе плавательным активности. Рыба скорость плавание, время , потраченное перемещение и расстояние , пройденное все значительно уменьшилось (рисунок 3) с увеличением концентрации меди. Плавательные дорожки были также уменьшается с увеличением концентрации меди (рис 4).

Рисунок 1:.. Скриншот Компьютер шаблона электронной таблицы , используемой для определения концентрации теста запас раствора препарата Химический запаса для испытаний на токсичность разбавителя была определена с использованием шаблона таблицы на основе целевого концентрации Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 2: Установка и разбавителя эксперимента различные периоды жизни белого осетра подвергались воздействию меди. Размер разбавителя, используемого для облучения был выбран на основании размера рыбы. (А) Молодость стадии осетра были выставлены с помощью небольшой установки разбавителя и (б) старше жизнь стадии осетра были выставлены с помощью большой установки разбавителя.

Рисунок 3: Плавание Результаты поведения с раннего жизненного этапа белого осетра (Acipenser transmontanus) 72 ч меди экспозиции (начиная с 30 день после люка [DPH] рыба). Конечные точки плавательной активности (а) продолжительность движения среди 30 DPH белого осетра; (Б) скорость плавания; и (с сильный>) расстояние перемещения снизилась с увеличением концентрации меди среди белого осетра подвергается в течение 96 ч. Звездочка указывает на существенное отличие от контроля, Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение.

Рисунок 4: Результаты раннего жизненного этапа белого осетра (Acipenser transmontanus) 96 ч экспозиции меди (начиная с 2 день после люка [DPH] рыба) Выжившие белуга на 2 DPH выставляется потеря равновесия и иммобилизации после 72 ч а. 96 ч экспозиции с увеличением концентрации меди. Звездочка указывает на существенное отличие от контроля, Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение.

Рисунок 5: Пример плавание путь приводит к получению с раннего жизненного этапа белого осетра (Acipenser transmontanus) 96 ч меди экспозиции (глядя с 30 день после люка [DPH] рыба). Плавательные дорожки осетра оцифрованы с помощью программного обеспечения цифрового отслеживания из (а) управления повторности (п = 5 рыб) и (б) от высокотемпературной обработки (50 мкг / л) повторности (п = 3 рыбы) после облучения в 96 ч. Обратите внимание на количество плавательных дорожек не представляет количество рыбы , присутствующей в камере из - за некоторых рыб были неактивны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Количественное Параметр	Наблюдательные Параметры
Скорость	Вялость / гиперактивности
Расстояние перемещена	Потеря равновесия
Продолжительность времени, проведенного в зоне	Судороги / тремор / вверхвниз
Зона переходных число раз ходов организма между выбранными зонами	Позиция в толще воды
Заголовок к точке вычисляет отклонение пути животного к точке интереса	Дыхательный (быстрый / медленный)
Heading рассчитывает заголовок выбранной точки тела	расцветка
Поверните угол разницы в товарной позиции между двумя образцами	Прячется
Угловая скорость, рассчитывается путем деления угла поворота интервалом дискретизации
Меандр-рассчитывается путем деления угла поворота на расстоянии двигался. Используется для сравнения поворота у животных движущихся на разных скоростях
Время, затраченное на перемещение
Подвижность состоянии вычисляет длительность, в течение которой вся область обнаруженную, как меняется животное, даже если центточка эр остается неизменной
Rotation-одно вращение завершается, когда выбранная точка тела имеет кумулятивный угол поворота 360 °. Вращается в противоположном направлении, меньше порогового значения игнорируются.
Мобильность непрерывного вычисляет процент подвижности для полной области обнаруженного животного, даже если центральная точка остается неизменной.
Расстояние между субъектами вычисляет расстояние между всеми участниками и выбранных приемников
Proximity-вычисляет продолжительность, для которого актер является или не в непосредственной близости от приемника
относительное движение
Чистое движение взвешенное-Движение актера (положительный) и от (отрицательный) приемник, взвешенный по расстоянию между ними
Взвешенная движение из-moveme нт актера от приемника, взвешенных по расстоянию между ними.
Взвешенная движение to- движения актера к приемнику, взвешенный по расстоянию между ними
контроль Trial state- период между двумя событиями элементов Trial управления, или в пределах одного элемента
Пробный контроль событиями момент, в котором событие внутри элемента, который вы определили в Trial Control происходит.

Таблица 1:. Поведенческие конечные точки количественно с помощью цифрового программного обеспечения отслеживания Эти конечные точки могут быть использованы на отдельных лиц или групп , а также служить в качестве списка для визуальных наблюдений проверок поведенческих нарушений во время экспозиции.

/www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi "> Видео ^1:. Визуальное определение аномального поведения , демонстрируемого пораженной белуги (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать) Ежедневно наблюдательное контрольный список был использован для документирования отклонений The. потеря равновесия и иммобилизации были наиболее распространенными нарушения , наблюдаемые во время облучения. модифицированными из Calfee и др. ⁷

Видео 2: Визуальная документация подсветка пример белого поведения осетр плавания. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать) плавательной активности белуга была значительно снижена с воздействием возрастающей концентрации меди. Осетр, изображенный на этом видео с контролем, средний низкий, и высокий лечение в конце 96 ч водным раствором медивоздействие. Несмотря на то, белуга были еще живы, очевидно, рыба была значительно снизилась в лечении по сравнению с контрольной группой. Измененный Calfee и др. ⁷

Обсуждение

Изменения в поведении из-за воздействия загрязнителя часто используются в качестве конечной точки для сублетального токсичности, но может быть трудно измерить. Как правило, поведенческие реакции измеряют с помощью визуального наблюдения и ручного анализа данных, который требует много времени для обработки. Тем не менее с развития технологии, методы количественной оценки активности плавания были сосредоточены на использовании видеографию ¹⁸ и анализа движения или цифрового отслеживания программного обеспечения , которое сокращает время обработки и анализа. При анализе видео захваченные данные, количественной оценки плавание вручную переменные были бы очень много времени, поэтому использование записи данных видео и программного обеспечения отслеживания рыбы обеспечивает более эффективный и эффективный способ для анализа поведения осетр плавания. Хотя процедура выделенный плавание поведение рыбы, настраивая для других организмов, таких как амфибий и водных беспозвоночных, потребует простых модификаций. В зависимости от того, какой поведенческой endpoinTS решаются, опытно-конструкторские и камеры системы могут быть разработаны для использования с любой коммерчески доступного отслеживания пакетов программного обеспечения.

Метод демонстрируется с использованием растворенной меди, но применимо к другим водных загрязнителей или характеристик, таких как температура или содержание кислорода. Протоколы, разработанные и представленные в этой статье используется простой цифровой видеокамеры в качестве записывающего устройства. Цифровые файлы легко переносятся на компьютер и загружены в программное обеспечение анализа движения. Методы постоянно модифицируется и уточнена, чтобы упростить процесс количественной оценки. Крайне важно, чтобы качество видео будет в формате высокой четкости для того, чтобы программное обеспечение для анализа, чтобы идентифицировать каждую индивидуальную рыбу для отслеживания. Любой фон, который не контрастирует с рыбой будет вызывать проблемы при попытке обработать файлы данных. Еще одна распространенная проблема с двухмерной отслеживания видео является выявление лицпри плавании пути пересекутся. Это может быть исправлено вручную путем идентификации каждой рыбы во время пути пересечения и связывая сегменты пути внутри программного обеспечения. В качестве альтернативы, общая активность может быть определена из каждой повторности камеры в среднем по группе. Несколько отдельных камер с каждый из которых содержит одну рыбу можно снять в том же поле зрения для расчета движения отдельных рыб.

В настоящее время мы модернизировали к использованию ряд воздушных камер наблюдения над камерами воздействия, которые связаны с цифровым видео устройства записи высокой четкости (HD-DVR). Тем не менее, использование любой системы камеры, которая может записывать видео высокой четкости в формате MPEG-4 видео будет работать. HD-DVR может быть настроен на запись в определенное время и запрограммировать на срок до 7 дней. Это руки прочь автоматизированный подход позволяет захват нескольких видео одновременно, чтобы обеспечить согласованность при одновременной минимизации внешних возмущений, которые могли бы поставить под угрозу поведение рыбы. HD-DVR систмс подключены к внутренней сети так что передача файлов является относительно простым. В то время как автоматизированная система камеры является значительно улучшена методика количественной оценки поведения плавания, он по-прежнему полезно проводить визуальные наблюдения, чтобы служить в качестве дополнительной вспомогательной информации для документирования нарушения поведения во время тестов на токсичность.

Существует долгая история литературы , документирующей измененном поведения рыб в результате воздействия металлов , начиная с начала 1960 - х годов ^19,20,21. Медь было показано , чтобы вызвать изменения в уровне активности , такие как гипофункции в синежаберного ²² (Lepomis macrochirus Rafinesque) и изменения в опорно - двигательного аппарата и подкормки активность ручьевая форель ²³ (голец Fontinalis). По крайней мере , некоторые молодь рыбы полагаются на свое обоняние , чтобы обнаруживать и избегать хищников, а также медно-индуцированной хемосенсорных лишение может повлиять на поведение , связанные с химическими веществами сигнализации обнаружения ^24,25,26 . Обонятельный эпителий повреждается из - за воздействия меди влияя тем самым на сенсорные механизмы , которые могут привести к дезориентации, поведенческие избегания, снижение питания и любые другие виды поведения, которые руководствуются обонянием ^27. Эти измененные формы поведения соответствовали тому, что наблюдалось во время экспозиции.

Поведение плавание белого осетра было большое влияние во время сублетального воздействия водных концентраций меди .. Эти результаты показывают, как поведение влияет на концентрации сублетальных меди и может быть использовано в качестве индикатора токсического стресса. На основе анализа видео оказалось эффективным при количественной оценке поведения плавания, а также служил в качестве качественной визуальной документации серьезных воздействий на осетровых рыб, подвергшихся воздействию меди. Программное обеспечение для анализа также может количественной оценки другие различные поведенческие конечные точки. Пожалуйста , обратитесь к таблице 1 для списка. Система экспозиции может быть изменена для решения каждой конечной точки врежим реального времени и могут быть использованы для количественной оценки различий в поведении, связанных с воздействием различных загрязнений, вызывающих озабоченность.

Использование поведенческих конечных точек в водной токсикологических исследований все чаще применяется и следует учитывать при оценке воздействия загрязняющих веществ , потому что адаптивная поведенческая функция имеет решающее значение при определении экологической травмы ^9. Воздействие загрязнителей окружающей среды на поведение рыб часто субъективны и сложным особенно при работе с сублетальных в отсутствие стандартных методов ..

Плавательной активности, как количественно, используя эти методы могут быть строго контролироваться, является неразрушающим с минимальным стрессом для организма и может повторяться. Плавание поведение является корректным и последовательным индексом сублетального токсичности , которые должны быть включены в протоколы испытаний , чтобы расширить чувствительность стандартных тестов на токсичность ^5.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
сульфат меди II пентагидрат	Sigma-Aldrich		загрязнение вызывающее беспокойство
шприц-дозатор	Hamilton MicroLab серии 600 аппарат		для подсыпки химиката
2 л объемная колба			контейнер для хранения исходного раствора
24-1,5 л стеклянные банки тестовая			камера для 2 dph осетровая
видеокамера	Sony Handycam Программное обеспечение для цифрового слежения HDR-CX550V
	Noldus Ethovision
3-17" мониторы
24 камеры наблюдения	модели CL101
3-16 канальные цифровые записывающие устройства
DO метр YSI
pH-метр	Orion 940
ph зонд	Orion
аммиачный метр
щуп	чиллер орион
рециркуляционный водяной насос