Методическая статья

Выделение конкретных областей генома и идентификации Associated молекул enChIP

DOI:

10.3791/53478

⸱

20 января 2016 г.

 , 
1Chromatin Biochemistry Research Group, Combined Program on Microbiology and Immunology, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Идентификация молекул, связанных с определенными областями генома, представляющими интерес, требуется для понимания механизмов регуляции функций этих областей. В этом протоколе описываются процедуры проведения модифицированной ДНК-связывающей молекулы хроматина имунопреципитации (enChIP) для идентификации белков и РНК, ассоциированных с определенной областью генома.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Идентификация молекул, связанных с определенными областями генома, представляющими интерес, требуется для понимания механизмов регуляции функций этих областей. Чтобы обеспечить непредвзятую идентификацию молекул, взаимодействующих с определенной областью генома, представляющей интерес, мы недавно разработали метод иммунопреципитации хроматина, опосредованного связывающими ДНК молекулами (enChIP). В этой статье мы опишем, как использовать enChIP для выделения конкретных областей генома и идентификации связанных с ними белков и РНК. Во-первых, представляющая интерес область генома помечается белком, подобным активатору транскрипции (TAL), или кластеризованным регулярно чередующимся комплексом коротких палиндромных повторов (CRISPR), состоящим из каталитически неактивной формы Cas9 и направляющей РНК. Впоследствии хроматин сшивается и фрагментируется с помощью ультразвука. Затем меченый локус иммунопреципитируется, и сшивание происходит в обратном направлении. Наконец, белки или РНК, которые связаны с выделенным хроматином, подвергаются масс-спектрометрическому анализу или анализу секвенирования РНК соответственно. Такой подход позволяет успешно идентифицировать белки и РНК, связанные с интересующей областью генома.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Идентификация молекул, связанных с конкретными геномных областей, представляющих интерес необходимо для понимания механизмов регулирования геномных функций, таких как транскрипции и эпигенетической регуляции. Хотя несколько методов были разработаны для биохимического анализа конкретных областей генома 1-7, они широко не используется на этой стадии, потому что присущих им проблем, таких как ограниченное применение (например, только для высокого числа копий локусов или локусов с повторами) и слишком много времени и усилий требуется.

Для того, чтобы выполнить биохимический анализ конкретных областей генома легко, мы разработали два локуса конкретных иммунопреципитации хроматина (чип) технологий, а именно инсерционный чип (iChIP) 8-13 и инженерии ДНК-связывающего молекулы ChIP-опосредованной (enChIP) 14-17 , В iChIP, локус интереса помечены вставки последовательностей распознавания экзогенного ДНК-связывающего белка, такие как LexА. Локус затем выделяют с помощью аффинной очистки с использованием меченый ДНК-связывающий белок. В enChIP, инженерные ДНК-связывающие молекулы, такие как цинк-пальцевых белков, транскрипции активаторов, как (TAL) белков, и кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы (CRISPR) комплексы, которые используются, чтобы пометить локус интерес (Рисунок 1). Впоследствии геномной области выделяют аффинной очистки меченых молекул в ДНК-связывающих.

Одним из преимуществ над enChIP iChIP, что введение последовательности узнавания экзогенного ДНК-связывающего белка не является необходимым. Ориентация локусов, используя CRISPR комплексы, состоящие из каталитически неактивной формы Cas9 (dCas9) и руководство РНК (gRNA) гораздо проще, чем таргетинг этих регионах по iChIP или enChIP использованием TAL и цинк-пальцев белки. Здесь мы опишем шаг за шагом протокол enChIP в сочетании с масс-спектрометрии и секвенирования РНК (РНК-Seq), чтобы определить локус-AssociaTed белки и РНК, соответственно.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Проектирование инженерии ДНК-связывающих молекул признавая локуса-мишени

  1. Для enChIP использованием CRISPR комплексы, использовать CRISPRdirect веб-инструмент (http://crispr.dbcls.jp) для определения кандидата gRNA последовательности-мишени в геномной области интереса, как описано ранее 18. Этот веб-инструмент возвращает 23 б.п. геномных участков виде 5'-N 20 NGG-3 »в рамках целевой области.
  2. Синтезировать gBlock включая U6 промоторной последовательности и последовательность 5'-N 20 в 5'-N 20 NGG-3 ', используя коммерческие услуги (рис 2) 19,20. Для целей субклонированием, включать в себя соответствующие сайты рестрикции пределами gBlock.
  3. Вставьте gBlock в соответствующий вектор, как описано выше 16. Несколько ретровирусные векторы для gBlocks доступны (см Материалы).
  4. Для enChIP использованием TAL белки, дизайн TAL белки, распознающие Тарги др локусов. Создание плазмиды, кодирующие белки TAL, используя коммерческие услуги. Генерирование векторов экспрессии, содержащих белки, слитые TAL с одним или несколькими метками, такими как 3 × FLAG, как описано выше 15.

2. Установление клеток для анализа enChIP

  1. Экспресс 3 × FLAG-dCas9 и gRNA (процедура CRISPR основе) или 3 × FLAG-ТАЛ (процедура на основе белков TAL) в клетках, которые будут проанализированы, как описано выше 14-17.
    1. Использование временной трансфекции, если эффективность трансфекции является высокой. Вектор экспрессии, содержащий 3 × FLAG-dCas9 и промотор CMV доступно (см Материалы).
    2. Рассмотреть вопрос о создании стабильных трансформантов с использованием обычных методов, если переходный эффективность трансфекции является низким. В дополнение к вышеупомянутым ретровирусных векторов для gBlock, ретровирусные векторы 3 × FLAG-dCas9 доступны (см Материалы).
  2. Подтверждение экспрессии 3xFLAG-dCas9 или 3xFLAG-TAL белка в трансфицированных клетках по иммуноблот-анализа с использованием анти-FLAG антитела (Ab), как описано ранее 14-17.
    Примечание: Экспрессия этих белков также помечены может быть подтверждено окрашиванием внутриклеточных анти-FLAG-FITC и последующего анализа FACS. Протокол внутриклеточного окрашивания может быть загружен с нашего сайта (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html).
  3. Подтвердите выражение gRNA по стандартной методике RT-PCR.
  4. Для количественного определения белков, взаимодействующих с геномной области интереса, рассмотреть возможность использования стабильного изотопа в аминокислотами в культуре клеток (SILAC) анализа в сочетании с enChIP (enChIP-SILAC).
    Примечание: Медиа для анализа SILAC можно приобрести у коммерческих поставщиков. SILAC является мощным в выявлении конкретных взаимодействий.
    1. Культура клеток в среде SILAC тяжелой. Подготовка клетки cultuкрасный SILAC света среде в качестве отрицательного контроля. Используйте по крайней мере 5 × 10 7 клеток для каждого SILAC среды (тяжелой или легкой). Для эффективного маркировки, добавить как L-лизин-2HCl, 13 C 6 и L-аргинин-HCl, 13 C 6, 15, N 4 в СМИ SILAC тяжелым. Примечание: По крайней мере, пять клеточных делений необходимы для белков этикеток.
      1. Например, культура человека фибросаркомы клетки НТ1080, стабильно экспрессирующие 3xFLAG-dCas9 и gRNA при 37 ° С и 5% СО 2 в DMEM средств массовой информации для SILAC и диализовали эмбриональной бычьей сыворотки с лизин-2HCl плюс L-аргинин-HCl (Свет среде) или 13 С 6 L-лизин-2HCl плюс 13 С 6 15 N 4 L-аргинин-HCl (Тяжелая среда) (см Материалы) 16. Добавить 50 мг легкой или тяжелой L-лизин-2HCl и L-аргинина-НСl в 500 мл среды.
      2. Trypsinize и replate клетки, прежде чем они сливаются, так что клетки сохраняют экспоненциальный growtчас

3. Сшивание клеток с формальдегидом

  1. Для клеток в суспензионной культуре, передачи 2 × 10 7 клеток, экспрессирующих 3xFLAG-TAL белки или 3xFLAG-dCas9 плюс gRNA и приостановить в 30 мл обычной культуральной среде в 50 мл центрифужную пробирку. Когда больше используют клетки, увеличение объемов и количество реагентов пропорционально. Для SILAC экспериментов, смешать клеток, культивируемых в среде тяжелой или легкой среды (5 х 10 7 клеток в каждом) и разделить в общей сложности 1 х 10 8 клеток в пробирки, содержащие 5 2 х 10 7 клеток.
  2. Добавить 810 мкл 37% формальдегида в 30 мл клеточной суспензии (конечная концентрация 1%), и инкубировали при 37 ° С в течение 5 мин. Для адгезивных клеток, непосредственно исправить клеток в культуральные чашки, добавив 810 мкл 37% формальдегида в 30 мл культуральной среды.
  3. Остановка сшивание добавлением 3,1 мл 1,25 М раствора глицина (конечная концентрация 127 мМ), аинкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
  4. Собирают клетки центрифугированием (300 × г в течение 5 мин при 4 ° С). Осторожно удалите супернатант в том числе формальдегид и хранить его в соответствующем бутылки отходов.
    1. Для адгезивных клеток, отделить клетки с клеточным скребком и урожая в 50 мл пробирку, и клетки собирают, как описано в данном шаге.
    2. Для SILAC экспериментов, смешать отдельные клетки культивировали в тяжелой среде или легкой среды (5 х 10 7 клеток в каждом), разделить общей сложности 1 × 10 8 клеток в 5 пробирок, содержащих 2 х 10 7 клеток, и собрать клетки, как описано в этом шаг.
  5. Промыть осадок клеток с 30 мл PBS на пробирку дважды. Осторожно удалите супернатант в том числе формальдегид и хранить его в соответствующем отходов bottle.Handle формальдегида отходы в соответствии с руководящими принципами химических безопасности. Фиксированные клетки могут быть заморожены и хранили при -80 ° С.

4. Подготовка хроматина (за 2 х 107 клеток)

  1. Приостановка фиксированные клетки в 10 мл буфера для лизиса клеток (10 мМ Трис (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 0,5% IGEPAL СА-630 и 1 × ингибиторов протеазы) и инкубировать на льду в течение 10 мин.
  2. Центрифуга образец (830 × г при 4 ° С в течение 8 мин) и тщательно отбросить супернатант.
  3. Приостановка осадок в 10 мл лизирующего буфера ядерного (10 мМ Трис (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 0,5 М NaCl, 1% Тритон Х-100, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,5% лауроилсаркозин и ингибиторы протеазы 1x). Инкубируют на льду в течение 10 мин и вихревых каждые 2-3 мин.
  4. Центрифуга образца (830 × г при 4 ° С в течение 8 мин) и тщательно отбросить супернатант.
  5. Промыть гранулу в 10 мл PBS. Осадок (хроматина фракции) может быть хранили при -80 ° С, после немедленного замораживания в жидком азоте.

5. ультразвуком хроматина (за 2 х 10 7 клеток)

  1. Приостановить хроматина фракции в 800 мклмодифицировано буфера для лизиса 3 (10 мМ Трис (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 0,1% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS, и ингибиторы протеазы 1x) и передать в 1,5 мл пробирку.
  2. Разрушать ультразвуком хроматина с помощью ультразвукового (см Материалы) и следующие условия: Выход: 3; обязанность: 100% (непрерывный); и время: бесплатно. Выполнение 10-18 циклов обработки ультразвуком в течение 10 сек и охлаждении на льду в течение 20 сек. Чтобы избежать чрезмерного нагрева, инкубировать образцы на льду в течение 2 мин через каждые 5-6 циклов. Чтобы избежать вспенивания, сохранить положение кончика зонда обработки ультразвуком 0,5 см выше нижней части трубы.
  3. Центрифуга образца при (16000 × г при 4 ° С в течение 10 мин) и супернатант передачи в 1,5 мл пробирку. Озвученную хроматина можно хранить при -80 ° С, после немедленного замораживания в жидком азоте.

6. Оценка хроматина фрагментации

  1. Смешайте 10 мкл фрагментированной хроматина с 85 мкл дистиллированной воды.
  2. Добавьте 4 мкл5 М NaCl и инкубировать при 65 ° CO / N.
  3. Добавить 1 мкл 10 мг / мл РНКазы А и инкубируют при 37 ° С в течение 45 мин.
  4. Добавьте 2 мкл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0), 4 мкл 1 М Трис (рН 6,8), и 1 мкл 20 мг / мл протеиназы К, а затем инкубируют при 45 ° С в течение 1,5 ч.
  5. Отдельные 10 мкл образца с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, который не содержит окрашенные красители, такие как SYBR Green.
  6. Пятно гель оценить распределение длин фрагментированной хроматина. Условия, которые генерируют среднюю длину 0,5-2 кб (диапазон 0,2-4 кб) рекомендуется.
  7. Очищают ДНК из остальных образцов по экстракции фенолом и хлороформом или с помощью набора для экстракции ДНК (см Материалы). Очищенную ДНК можно использовать в качестве входного ДНК оценить выход enChIP анализов (см 8.11).

7. Подготовка Dynabeads сопряженных с антителами (за 2 х 10 7 клеток)

  1. Заранеечистить два 1,5 мл трубки, один для предварительной очистки с помощью обычного IgG мыши, а другой для инкубации с анти-FLAG Ab. Добавить 150 мкл белка G-сопряженных магнитных шариков (см Материалы) в каждую пробирку.
  2. Поместите трубки на магнит стоять и ждать в течение 3 мин. Жидкость над осадком сливают с помощью пипетки.
  3. Приостановка бусины в 1 мл PBS, содержащий 0,01% Твин-20 (PBS-T). Поместите трубки на магнитной подставке и ждать в течение 2 мин. Удалите супернатант с помощью пипетки, а затем повторите этот шаг.
  4. Приостановка бусины в 1 мл PBS-T, содержащем 0,1% БСА.
  5. Добавить 15 мкг нормальной IgG мыши или анти-FLAG Ab и вращаются на 4 ° CO / N.
  6. Спин вниз кратко, то поместите пробирки на магнитном стоять и ждать в течение 3 мин. Жидкость над осадком сливают с помощью пипетки.
  7. Приостановить бисером в 1 мл PBS-T. Обратить образец несколько раз, и спин вниз кратко. Место труб на магнитном стоять и ждать в течение 3 мин, а затем отбросить супернатант с помощью пипетки. Повторите мытьеще два раза с PBS-T (общее из трех стадий промывки).

8. хроматина Иммунопреципитация (за 2 х 10 7 клеток)

  1. Смешайте фрагментированный хроматин, полученного в 5.3) (приблизительно 800 мкл) с одной пятой объема (примерно 200 мкл) модифицированного буфера для лизиса 3, содержащей 5% Triton X-100 (конечная концентрация 1% Тритон Х-100).
  2. Добавьте хроматина решение трубки, в которой протеин G-конъюгированные магнитные шарики, конъюгированные с нормальной мыши IgG были получены. Поворот при 4 ° С в течение 1 часа.
  3. Поместите пробирку на магнитной подставке и ждать в течение 3 мин.
  4. Перенести супернатант в трубку, в которой белок G-сопряженные магнитные шарики, сопряженные с анти-FLAG Ab были подготовлены. Поворот при 4 ° CO / N.
  5. Поместите пробирку на магнитной подставке и ждать в течение 3 мин. Жидкость над осадком сливают с помощью пипетки.
  6. Приостановка бусины в 1 мл буферного раствора с низким (20 мМ Трис (рН 8,0), 2 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 1% тройногот Х-100, 0,1% SDS, и ингибиторы протеазы 1x) и вращать при 4 ° С в течение 5 мин. Поместите пробирку на магнитной подставке и ждать в течение 3 мин. Жидкость над осадком сливают с помощью пипетки и повторить стадии промывки.
  7. Промыть шарики с высоким содержанием соли буфера (20 мМ Трис (рН 8,0), 2 мМ ЭДТА, 500 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 0,1% SDS, и 1x ингибиторов протеазы) дважды.
  8. Промыть шарики с LiCl-буфере (10 мМ Трис (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 250 мМ LiCl, 0,5% IGEPAL СА-630, 0,5% дезоксихолат натрия, и ингибиторы протеазы 1x) дважды.
  9. Промыть шарики с TBS-IGEPAL СА-630 (50 мМ Трис (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 0,1% IGEPAL СА-630, и ингибиторы протеазы 1x) один раз.
  10. Приостановка бусины в 200 мкл буфера для элюции (50 мМ Трис (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 0,1% IGEPAL СА-630, 1x ингибиторы протеазы и 500 мкг / мл 3 × FLAG пептид) и инкубируют при 37 ° С в течение 20 мин. Поместите пробирку на магнитной подставке и ждать в течение 3 мин. Передача супернатант в новую пробирку 1,5 мл и повторить Elutионная шаг.
  11. Очищают ДНК из небольшой части (например, 5%) элюата путем экстракции фенол-хлороформ или с помощью набора для экстракции ДНК (см Материалы). Очищенную ДНК можно использовать для ПЦР с наборами праймеров конкретных оценить выходы enChIP анализ по сравнению с входным ДНК, полученной на стадии 6.7, как описано ранее 14,16.

9. SDS-PAGE, окрашивания и анализа Масс-спектрометрический

  1. Смешайте элюата (400 мкл) с 1 мл 2-пропанола, 50 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2), и 5 мкл 20 мг / мл гликогена. Осадок хроматина при -20 ° CO / N.
  2. Центрифуга образец (16000 × г при 4 ° С в течение 30 мин) и отбросить супернатант. Промыть гранулу с 1 мл 70% -ного этанола и центрифугируют снова (16000 х г при 4 ° С в течение 10 мин). Удалите супернатант полностью с помощью пипетки.
  3. Приостановка осадок в 40 мкл 2x буфера для образца (125 мМ Трис (рН 6,8), 10% 2-Mercaptoethanol, 4% ДСН, 10% сахароза и 0,004% бромфенолового синего). Вихревые в течение 5 мин для полного растворения осадка, а затем инкубируют при температуре 100 ° С в течение 30 мин для денатурации белков и обратной сшивки.
  4. Для SDS-PAGE, запустить 40 мкл образца на гель, пока краситель не достигнет 1 см ниже скважины. Примечание: Обычно мы используем 4-20% градиентные гели, но и другие гели% могут быть использованы.
  5. Пятно гель кумасси бриллиантовым голубым или серебром.
  6. Вырезать гель на пять частей (2 мм высоты).
  7. Выполните в гелевой пищеварения и масс-спектрометрического анализа, как описано ранее 13-16.
  8. Для SILAC экспериментов с 5 х 10 7 клеток друг (всего 1 х 10 8 клеток), приостановить осадок от первых пяти трубок в 40 мкл 2x буфера для образца (не нужно наращивать).

10. Очистка РНК и РНК-Seq анализа

  1. Для очистки РНК после enChIP, добавляют 5 ЕД / мл РНКазы ингибитора (SEе) материалы на все буферных растворов, кроме модифицированного буфера для лизиса 3 и буфер для элюции, к которому добавить 40 ед / мл РНКазы ингибитора.
  2. Смешайте элюата (400 мкл) с 16 мкл 5 М NaCl и инкубируют при 65 ° С в течение 2 ч.
  3. Добавить 1 мл кислоты гуанидиния-фенола на основе реагента (см Материалы) к образцу. Вихревые в течение 15 сек, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 5-15 мин. Центрифуга образца в течение 15 мин при 12000 г и КТ.
  4. Передача супернатант в новую пробирку 1,5 мл и добавляют 5 мкл р-броманизола. Вихревые в течение 15 сек, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 3-5 мин. Центрифуга образца в течение 10 мин при 12000 г и КТ.
  5. Передача супернатант (приблизительно 1 мл) в новую пробирку 2 мл и добавляют 1 мл 2-пропанола. Переверните пробирку и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Загрузите смеси на колонке в комплекте очистки с РНК (см Материалы). Центрифуга колонку в течение 1 мин при 12000 г и РТ.
  6. мытьстолбец с 400 мкл промывочного буфера РНК в комплект очистки с РНК (см Материалы).
  7. Добавить 80 мкл ДНКазы I коктейль (смесь 5 мкл ДНКазы I (1 ед / мкл), 8 мкл 10 × ДНКазы I реакционного буфера, 3 мкл ДНКазы / РНКазы воды и 64 мкл РНК промывочного буфера в системой очистки РНК комплект (см Материалы)) на колонке. Инкубируйте образца при 37 ° С в течение 15 мин, а затем центрифуги в течение 30 сек при 12000 х г и КТ.
  8. Промыть колонку с 400 мкл РНК Предварительная стирка буфера в комплект очистки с РНК (см Материалы) дважды.
  9. Элюции РНК с 50 мкл ДНКазы / РНКазы воды. Элюированный РНК могут быть использованы для РНК последовательности.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В целом, 1-30% целевых областей генома может быть очищен с помощью enChIP. Рисунок 3 включает в себя представительные данные, показывающие выход enChIP анализ ориентации теломеры и промотор интерферона (ИФН) регуляторного фактора-1 (IRF-1) гена. В качестве примеров типичных результатов, таблица 1 перечисляет белки, связанные с IRF-1 промоутера в IFN, специфичных образом идентифицированной enChIP-SILAC, таблица 2 перечислены теломер-связывающие белки, определенные enChIP в сочетании с масс-спектрометрии (enChIP-МС) и таблице 3 приведены РНК, связанные с теломер, определенных enChIP-РНК-Seq.

figure-results-1
Рисунок 1. Обзор enChIP. enChIP помощью CRISPR (A, B) и Таль (С, D, Е сильный>) показано. Локус интерес помечен инженерных молекул ДНК-связывающий такой как белок TAL или CRISPR системы, состоящей из каталитически неактивной формы Cas9 (DCAS) и направлять РНК (gRNA). Молекулярные взаимодействия фиксируются с формальдегидом или другими сшивающими агентами, если это необходимо. Впоследствии, фиксированная хроматин фрагментирован с помощью ультразвука или ферментативного пищеварения. Маркированные геномные области очищают аффинной очистки. Наконец, сшивка вспять, и взаимодействующие молекулы (геномные регионы, РНК и белки) идентифицируются при помощи следующего поколения секвенирования и масс-спектрометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Последовательность gBlock. Метро U6 промотор (в черном), Г нуклеотид бEfore последовательность руководство (в синем), руководство последовательность (gRNA спейсер) (в красном), последовательность леса (зеленый цвет), и последовательность терминатора (оранжевым цветом) показаны.

figure-results-3
Рисунок 3. Урожайность представителя enChIP анализов. (A) в процентах входы для цели IRF-1 локуса и нецелевого Sox2 локуса. (Б) процент входы для целевых теломер и нецелевых гамма-спутников. Цифры были адаптированы и изменены от предыдущих изданий 15,16.

Категории Белки
Транскрипция DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo гомолог, PURβ,
активируется РНК-полимераза II транскрипции активатор р15,
BTF3, Myb связываниябелок 1A
Гистонов деацетилирование,
компоненты корепрессора 		RBBP4, PA2G4, TBL3
Ацетилтрансфераза Белок аргинин N-метилтрансферазы 1
Топоизомеразы ДНК ДНК топоизомеразы 2α
Гистоны Гистонов H2A.Z гистонов H3.2

Таблица 1:. Примеры белков, связанных с человеческим IRF-1 промоторной области в IFN, специфичных образом идентифицированной enChIP-SILAC Таблица была адаптирована из предыдущей публикации 16.

Категории Белки
Млекопитающих теломер-связывающие белки ПМЛ, РПА, CDK1, PARP1, PCBP1
Теломер-бидача белки у дрожжей
или другие организмы 		IMP4
Белки, взаимодействующие с теломер-связывающего
белки [связанные теломер-связывающий белок] 		ДНК-полимераза α (POLA1) [Cdc13p],
ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FOXP2-РОТ1],
Exportin-5 [трет], GNL3L [TRF1],
Exportin-1 [трет], 14-3-3 [трет]
Белки локализующие для гетерохроматина BEND3
Белки регулирования эпигенетические KDM5C
Белки, чьи мутации затрагивают функцию теломер ДНК-полимеразы α (POLA1), HAT1, Nup133,
CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY,
глутамат-цистеин лигазы, глутаредоксин, SMRC1

Таблица 2:. Примеры белков, связанных с теломер мыши, определенных enChIP-МС стол был ADAPTEd из предыдущей публикации 15.

Категории РНК
Компоненты теломеразы TERC, Rmrp
Теломерной РНК Террас
scaRNAs Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2
Н / АСА snoRNAs Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a
C / D snoRNAs Snord17, Snord15a, Snord118
lncRNA Neat1

Таблица 3: Примеры РНК, связанных с теломер мыши, определенных enChIP-РНК-Seq Таблица была адаптирована из предыдущей публикации 17..

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы описываем очистку конкретных областей генома с помощью сконструированных ДНК-связывающих молекул, таких как система CRISPR и белки TAL, а также идентификацию белков и РНК, связанных с этими областями генома. Связывание сконструированных ДНК-связывающих молекул с геномом может влиять на структуру хроматина, включая позиционирование нуклеосом, и может нарушать геномные функции, как описано в экспериментах по интерференции CRISPR21. Чтобы избежать этих потенциальных аберрантных эффектов, мы предлагаем конкретные рекомендации по выбору целевых областей генома. Во-первых, чтобы избежать потенциального ингибирования рекрутирования РНК-полимераз и факторов транскрипции, а также нарушения позиционирования нуклеосом вокруг сайта начала транскрипции, целевыми областями для анализа промоторных областей должны быть несколько сотен пар оснований выше (5' до) сайта начала транскрипции. Напротив, при анализе геномных областей с четкими границами, таких как энхансеры и глушители, геномные области, которые непосредственно сопоставляются с этими областями, могут быть мишенью, поскольку менее вероятно, что связывание сконструированных ДНК-связывающих молекул повлияет на их функции. Кроме того, лучше избегать использования целевых областей, которые консервативны у разных видов, потому что важные ДНК-связывающие молекулы часто связываются с эволюционно консервативными областями, и ингибирование их связывания может нарушить функции целевых областей генома. В связи с этим всегда необходимо проверять, сохраняется ли функция целевого участка генома в установленных клетках, используемых для анализа enChIP. Поскольку несколько гРНК могут быть легко протестированы, а создание нескольких версий TAL или белков цинкового пальца, распознающих различные целевые области генома, является утомительным и дорогим, enChIP с использованием CRISPR более выгоден, чем enChIP с использованием других белков.

Было показано, что dCas9 связывается с нецелевыми сайтами, хотя сродство к этим сайтам может быть слабее, чем к целевым сайтам22-25. Существует несколько способов управления загрязнением молекул, связанных с этими нецелевыми участками. Во-первых, рекомендуется использовать несколько, по крайней мере, двух различных гРНК. Молекулы, обычно наблюдаемые в enChIP с использованием различных гРНК, будут истинно положительными. Во-вторых, сравнение различных условий для enChIP было бы эффективным для устранения загрязнения неспецифических молекул и молекул, связанных с нецелевыми сайтами. Примерами таких наборов для сравнения могут быть (i) стимуляция (-) и (+) или (ii) различные типы клеток, такие как Т-клетки и В-клетки. Наконец, следует провести количественный анализ связывания молекул-кандидатов для подтверждения их специфического связывания с целевыми сайтами. В качестве отрицательного контроля предпочтительно получать клетки, экспрессирующие только dCas9, но не гРНК.

С помощью анализа enChIP нам удалось успешно идентифицировать ряд известных и новых молекул, взаимодействующих с определенными областями генома (табл. 1-3)14-17. Тем не менее, этот метод не смог обнаружить некоторые другие известные белки, взаимодействующие с этими областями. Например, STAT1, как сообщается, связывается с промотором IRF-1 при стимуляции IFNγ8, но наш анализ enChIP-SILAC не обнаружил STAT1 как белок, индуцированный к взаимодействию с этой областьюгенома 16. Кроме того, при анализе теломер enChIP-MS мы не обнаружили белков шелтерина, состоящих из TRF-1 и TRF-215, которые, как было показано, взаимодействуют с теломерами26. Существует несколько возможных причин этих расхождений. Во-первых, стехиометрия связывания Stat1 с промотором IRF-1 может быть очень низкой. Разумно, что enChIP-MS, включая enChIP-SILAC, обнаруживает белки, которые в большей степени связаны с целевыми областями генома; Следовательно, для обнаружения этих белков может потребоваться анализ большего количества клеток. Увеличение чувствительности инструментов для лечения РС также будет способствовать эффективному обнаружению белков с низким стехиометрическим связыванием. Во-вторых, некоторые белки, возможно, включая Stat1 и шелтерины, могут быть сложными мишенями для анализа РС. В-третьих, в нашем анализе теломерсвязывающих белков15 белки 3×FLAG-TAL, распознающие теломеры (3×FN-Tel-TAL), могли блокировать связывание шелтеринов с теломерами конкурентным образом.

В отличие от относительной сложности обнаружения связывания транскрипционных факторов с конкретными областями генома с помощью enChIP, мы успешно идентифицировали эпигенетические регуляторы, такие как ферменты модификации гистонов, с помощью анализа enChIP. Успех этой методики может быть обусловлен тем, что эпигенетические регуляторы связываются с широким спектром областей генома; следовательно, для РС доступно больше белков на область генома. Поскольку эпигенетические регуляторы все чаще признаются в качестве важных мишеней для лекарств против трудноизлечимых заболеваний, таких как рак, enChIP может быть полезным инструментом для идентификации эпигенетических мишеней для лекарств.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторами подан патент на enChIP (Название патента: «Способ выделения специфических участков генома с использованием ДНК-связывающих молекул, распознающих эндогенные последовательности ДНК»; Номер патента: PCT/JP2013/74107). Х.Ф. является членом Консультативного совета Addgene.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Takeda научного фонда (TF); Асахи Стекло Фонд; Мемориал Фонд Уэхара (ВЧ); Kurata Мемориал Hitachi Наука и техника фонд (ТФ и ВЧ); Грант-в-помощь для молодых ученых (B) (# 25830131), Грант-в-помощь по научным исследованиям (C) (# 15K06895) (TF); и Грант-в-помощь для научных исследований в "Транскрипция цикла 'инновационных направлений (# 25118512 & # 15H01354), Грант-в-помощь для научных исследований (B) (# 15H04329), Грант-в-помощь для поисковых исследований ( # 26650059) и «Геном поддержки" (# 221S0002) (ВЧ) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
gBlock синтез сервисLife TechnologiesСинтез генов от GeneArt
gBlock синтезIDT (Integrated DNA Technologies)gBlocks Фрагменты генов
pSIR-neoAddgene51128
pSIR-GFPAddgene51134
pSIR-DsRed-Express2Addgene51135
pSIR-hCD2Addgene51143
TAL синтез сервисLife TechnologiesGeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1Addgene47948
3× FLAG-dCas9/pMXs-puroAddgene51240
3× FLAG-dCas9/pMXs-IGAddgene51258
3× FLAG-dCas9/pMXs-I2Addgene51259
3× FLAG-dCas9/pMXs-neoAddgene51260
anti-FLAG M2 AbSigma-AldrichF1804
FITC-конъюгированный анти-FLAG M2Sigma-AldrichF4049
DMEM среда для SILACLife Technologies89985Другая среда может быть приобретена у Life Technologies
Dialyzed FBS для SILACLife Technologies89986
L-Лизин-2HCl для SILACLife Technologies89987Для легкой среды
L-аргинин-HCl для SILACLife Technologies89989Для легкой среды
L-лизин-2HCl, 13C6 для SILACLife Technologies89988Для тяжелой среды
L-аргинин-HCl, 13C6, 15N4 для SILACLife Technologies89990Для тяжелой среды
Полный, мини, УльтразвуковойRoche4693159
UD-201Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & КонцентраторZymo ResearchD5205
Dynabeads-Protein GLife TechnologiesDB10004
РНКазин плюс ингибитор РНКазыPromegaN2611
Isogen IINippon Gene311-07361
Direct-zol RNA Miniprep kitZymo ResearchR2050
LTQ Orbitrap VelosThermo Fisher ScientificКомпонент системы nanoLC-MS/MS для анализа МС
nanoLCAdvance, Michrom BioresourcesКомпонент системы nanoLC-MS/MS для анализа МС
Автосамплер HTC-PALCTC AnalyticsКомпонент системы nanoLC-МС/МС для анализа МС
сервис разрушитель

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, X. Y., Horz, W. Analysis of highly purified satellite DNA containing chromatin from the mouse. Nucleic Acids Res. 10, 1481-1494 (1982).
  2. Workman, J. L., Langmore, J. P. Nucleoprotein hybridization: a method for isolating specific genes as high molecular weight chromatin. Biochemstry. 24, 7486-7497 (1985).
  3. Boffa, L. C., Carpaneto, E. M., Allfrey, V. G. Isolation of active genes containing CAG repeats by DNA strand invasion by a peptide nucleic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 1901-1905 (1995).
  4. Jaskinskas, A., Hamkalo, B. A. Purification and initial characterization of primate satellite chromatin. Chromosome Res. 7, 341-354 (1999).
  5. Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J. S., Kornberg, R. D. Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast. Mol. Cell Biol. 23, 9275-9282 (2003).
  6. Ghirlando, R., Felsenfeld, G. Hydrodynamic studies on defined heterochromatin fragments support a 30-µm fiber having six nucleosomes per turn. J. Mol. Biol. 376, 1417-1425 (2008).
  7. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  8. Hoshino, A., Fujii, H. Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions. J. Biosci. Bioeng. 108, 446-449 (2009).
  9. Fujita, T., Fujii, H. Direct idenification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation. PLoS One. 6, e26109(2011).
  10. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged LexA DNA-binding domain. Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012).
  11. Fujita, T., Fujii, H. Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immunoprecipitation. ISRN Biochem. 2013, 913273(2013).
  12. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions retaining molecular interactions by the iChIP system using recombinant exogenous DNA-binding proteins. BMC Mol. Biol. 15, 26(2014).
  13. Fujita, T., Kitaura, F., Fujii, H. A critical role of the Thy28-MYH9 axis in B cell-specific expression of the Pax5 gene in chicken B cells. PLoS One. 10, (2015).
  14. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 439, 132-136 (2013).
  15. Fujita, T., et al. Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP). Sci. Rep. 3, 3171(2013).
  16. Fujita, T., Fujii, H. Identification of proteins associated with an IFNγ-responsive promoter by a retroviral expression system for enChIP using CRISPR. PLoS One. 9, e103084(2014).
  17. Fujita, T., Yuno, M., Okuzaki, D., Ohki, R., Fujii, H. Identification of non-coding RNAs associated with telomeres using a combination of enChIP and RNA sequencing. PLoS One. 10, e0123387(2015).
  18. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. , (2014).
  19. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  20. Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat. Methods. 10, 1116-1121 (2013).
  21. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
  22. Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 32, 670-676 (2014).
  23. Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J., Adli, M. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. Nat Biotechnol. 32, 677-683 (2014).
  24. Cencic, R., et al. Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage. PLoS One. 9, 109213(2014).
  25. O'Green, H., Henry, I. M., Bhakta, M. S., Meckler, J. F., Segal, D. J. A genome-wide analysis of Cas9 binding specificity using ChIP-seq and targeted sequence capture. Nucleic Acids Res. 43, 3389-3404 (2015).
  26. de Lange, T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev. 19, 2100-2110 (2005).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

enChIPCRISPR dCas9TALFLAG

Похожие статьи