Оптический контроль живых клеток электрической активности по сопряженных полимеров

Краткое содержание

Описан метод стимуляции электрической активности культур клеток in vitro видимым светом, основанный на использовании органических полупроводниковых полимеров.

Аннотация

Гибридные интерфейсы между органическими полупроводниками и живыми тканями представляют собой новый инструмент для приложений in vitro и in-vivo. В частности, сопряженные полимеры обладают несколькими оптимальными свойствами в качестве субстратов для биологических систем, такими как хорошая биосовместимость, отличные механические свойства, дешевая и простая технология обработки, а также возможность осаждения на легкие, тонкие и гибкие субстраты. Эти материалы используются для клеточных интерфейсов, таких как нейронные зонды, транзисторы для возбуждения и записи нейронной активности, биосенсоры и исполнительные механизмы для высвобождения лекарств. Недавние эксперименты также продемонстрировали возможность использования сопряженных полимеров для полностью оптической модуляции электрической активности клеток. Сообщалось о нескольких случаях исследования in vitro, включая первичные нейронные сети, астроциты и клетки вторичной линии. Кроме того, было показано, что сигнальная фототрансдукция, опосредованная органическими полимерами, восстанавливает светочувствительность в дегенерированных сетчатках, что позволяет предположить, что эти устройства могут быть использованы для искусственных протезов сетчатки в будущем. В целом, светочувствительные сопряженные полимеры представляют собой новый подход к оптической модуляции клеточной активности.

В этой работе описаны все шаги, необходимые для изготовления биополимерного интерфейса для оптического возбуждения живых клеток. Функция активного интерфейса заключается в преобразовании светового стимула в модуляцию потенциала клеточной мембраны. В качестве исследовательского случая, полезного для исследований in vitro, тонкая пленка политиофена используется в качестве функционального, поглощающего свет слоя, а клетки эмбриональной почки человека (HEK-293) используются в качестве биологического компонента интерфейса. Приведены практические примеры успешного управления потенциалом клеточной мембраны при стимуляции световыми импульсами различной длительности. В частности, показано, что в зависимости от длительности светового стимула могут достигаться как деполяризующие, так и гиперполяризующие эффекты на клеточную мембрану. Представленный протокол имеет общую валидность и может быть напрямую распространен на другие биологические препараты.

Введение

Возможность манипулировать клеточную активность с точным пространственным и временным разрешением представляет собой ключевой стратегии в Нейрологическая исследований и в лечении неврологических и психиатрических расстройств. ¹ Традиционные методы основаны на электрической стимуляцией клетки с использованием электродов, расположенных в непосредственной близости или в контакте с целевая система, ^2, которые могут быть различной сложности (одной ячейке сотовой сети, срезах мозга, в естественных условиях тканях мозга). В прошлом веке, использование патч-зажим, металла и подложки интегрированных электродов обеспечили детальную картину физиологии и патофизиологии отдельных нейронов и функционирования механизмов нейронных сетей. Тем не менее, электрическая стимуляция страдает от важных ограничений. Первый из них связан с целом плохой пространственной разрешающей из-за физических размеров электродов и их фиксированной геометрии, которые не могут быть легко адаптированыдо сложных организованных систем, таких как биологические ткани. Кроме того, проблемы, связанные с сопротивлением электродов и перекрестных помех между стимуляции и записи систем может ухудшить отношения сигнал-шум измерений. ³ С другой стороны, использование света для стимуляции может помочь преодолеть многие ограничения электрической подхода. Прежде всего, это обеспечивает беспрецедентную пространственные (<1 мкм) и временным разрешением (<1 мс), что делает возможным для решения конкретных типов клеток или даже суб-клеточных отсеков. Кроме того, он обладает высокой неинвазивным, поскольку он позволяет избежать физического контакта с интересующей ткани и расчесываются стимуляции от записи. Кроме того, как интенсивность света и длина волны может быть точно регулируется и, таким образом различные протоколы стимуляции может быть применен. ^3,4

Тем не менее, подавляющее большинство клеток животных не представляют какой-либо конкретной чувствительность к свету. Несколько стратегий для оптического stimulatioп Таким образом, было предложено, либо используя светочувствительные молекулярные медиаторы поблизости или в клетках, или с помощью светочувствительного устройство, размещенное снаружи, близко к клетке. Первая категория относится к эндогенным механизмам, как стимулирование через видимого или инфракрасного (ИК) света, а также использование либо photoisomerizable / действием света соединений или генетической экспрессии фоточувствительных молекул приводов (оптогенетика). Последнее класс включает методы экзогенной стимуляции достигается при использовании неорганических нано / микрочастиц или фоторезисторов кремниевых подложках. ⁵ Тем не менее, все эти системы имеют светлые стороны и недостатки. В частности, эндогенной поглощение клетками в видимом диапазоне слаба и не надежны, и сопутствующее образование активных форм кислорода может быть вредным для ячейки. В общем, ИК используется для индукции местного теплового нагрева из-за поглощения воды, но коэффициент экстинкции воды мало, что требует улРонг инфракрасный свет (от десятков до сотен Вт / мм ^2), что трудно поставить через стандартные оптики микроскопа и могут представлять проблемы безопасности для в естественных приложений. С другой стороны, фото-переключаемые останов соединения имеют времени ограниченные меры и часто требуют УФ-света, который трудно доставить из-за ограниченного проникновения в ткани. Кроме того, они страдают от диффузии проблем активированных соединений на фотолиза за пределами освещенной области. Наконец, optogenetic инструменты позволили ученым цель специфический клеточный субпопуляции и суб-купе и быстро становится одним из ключевых технологий в Нейрологическая исследований. Тем не менее, вставив экзогенный фрагмент ДНК с помощью вирусного вектора поднимает важные вопросы безопасности, особенно в связи с принятием на больных людей. ^5,6 По этим причинам, исследования новых материалов и устройств, способных клеток оптической манипуляции является чрезвычайно актуальной.

Недавно романподход, основанный на использовании светочувствительных сопряженных полимеров, способных эффективно преобразовывать оптический стимул в модуляции электрической активности клеток, было предложено. Сотовый Стимуляция Polymer фотовозбуждения (CSPP) метод использует множество ключевых включение черты, характерные для органических полупроводников: они неразрывно чувствительны к свету в видимом диапазоне; ⁷ они являются биологически совместимыми, мягкой и послушной, и их механическая гибкость позволяет интимную интерфейс с тканью как в пробирке и в естественных условиях ^8-10. Кроме того, они могут быть легко функционализированные лучше адаптироваться к интерфейсу с живыми клетками, и для того, чтобы конкретный возбуждение, зондирующего и чувствительный возможности. ^11,12 Более того, они поддерживают электронного, а также ионного транспорта, что делает их идеальными для комбинации из электроники объявления биологии. ^13,14 Интересно, они могут работать в режиме фотоэлектрической, избегая необходимость применения внешнего смещения Fили эффективность ячейки оптического возбуждения. ¹⁵

Надежность CSPP техники ранее было показано, в нескольких системах, в том числе первичных нейронов, астроцитов ^15,16, 17 средних клеточных линий ^{18 и} эксплантированных сетчатки тканей. ¹⁶ В этой работе, все шаги, необходимые для изготовления светочувствительного полимера био- Интерфейс ¹⁹ для оптического стимуляции в пробирке систем описаны в деталях. В случае исследования, прототипом органического фотоэлектрических смеси региона-регулярной поли (3-hexylthiophene) (RR-P3HT), функционирующего в качестве донора электронов, и фенил-C61-бутановой кислоты метиловый эфир (PCBM), выступая в качестве используется акцептор электронов. В биологической системы, используют человека эмбриональной почки (НЕК-293) клеток. Пример протокола фотостимуляции с относительной записи активности клеток через электрофизиологических измерений обеспечивается.

Описанный платформаОднако общее значение, и оно может быть легко расширена для использования других полимеров сопр (путем правильной настройки процесса Получение раствора и параметров осаждения), различные типы клеток (путем соответствующего изменения протокола для культивирования клеток, покрытие процедуру и время требуемый для посева клеток и пролиферации) и различных протоколов стимуляции (длина волны света, стимулы частота и продолжительность, плотности фотовозбуждение).

Протокол

1. Подготовка подложек фотоактивные

1. Подготовьте P3HT: решение PCBM (1: 1 / в) в хлорбензоле при концентрации P3HT 20 г / л. Смешайте раствор с помощью магнитной мешалки в течение по крайней мере 4 ч при 60 ° С. Рассмотрим объемом 150 мкл раствора субстрата для каждого быть готовым.
2. Чистые ITO покрытием стеклянные пластинки (R = 10 _сек Ω / кв, 18х18 мм ^2, толщина 170 мкм) с последовательными ванны деионизированной водой, ацетоном и изопропанола в соникатор (10 мин на каждом этапе). Высушите покровные с ружьем азота. Положите образцы уборщицей плазмы на 100 Вт в течение 10 мин.
3. Депозит тонкую пленку активного слоя на очищенные подложки через спин-покрытием.
   1. С наконечником алмазов, вырезать микроскоп предметное стекло, толщина (≈ 1 мм) для тех же поперечных размеров подложек Ито покрытием. Снимите P3HT: PCBM решение от плиты и дайте ему остыть до комнатной температуры.
   2. Установите два-йEPS программа спин-для нанесения покрытий: я) 30 сек при 800 оборотов в минуту; II) 30 сек при 1600 оборотах в минуту. Поместите слайд на патроне спин-устройства для нанесения покрытий и начать вакуум, чтобы исправить это. Нанесите каплю ацетона на слайде, а затем очищенный субстрат, с боковой МТО покрытием вверх. Начните вращение спин-напылительной машины, чтобы избавиться от лишнего ацетона.
   3. Положите 150 мкл P3HT: решение PCBM на подложках и начать снова спин-машины для нанесения покрытия (используйте один и тот же протокол, описанный в 1.3.2).
   4. После того, как спин-для нанесения покрытий закончена, удалить образец тщательно отделить и подложки с покрытием из стекло. Очистите заднюю часть подложки с чистого помещения тампоном, смоченным в ацетоне.
      Примечание: фотоактивные субстраты могут быть сохранены в течение нескольких дней в темном поле до использования. Для более длительных периодов, держать их в бардачке с инертным газом.

2. Подготовка клеточной культуральной среды и электрофизиологии Solutions

1. Подготовьте полный питательную среду (CGM) дляКлеток НЕК-293: Модифицированная Дульбекко Игла Medium (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), не инактивированной теплом, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Стерилизацию среду с системой фильтрации 0,2 мкм и хранят при температуре 4 ° С.
2. Подготовка внеклеточный раствор в особо чистой воды (концентрации в мм): 135 NaCl, 5,4 KCl, 5 HEPES, 10 глюкозы, 1,8 CaCl _{2, MgCl} 2 1. Доведения рН до 7,4 с помощью NaOH. Стерилизовать раствор с системой фильтрации 0,2 мкм и хранят при температуре 4 ° С.
3. Подготовка внутриклеточного раствора в особо чистой воды (концентрации в мм): 12 KCl, 125 К-глюконат, 1 MgCl _2, 0,1 CaCl _{2, 10} ЭГТА, 10 HEPES, 10 АТФ-Na _2. Обратите внимание, что АТФ-Na ₂ является термочувствительным и добавить его в прошлом. Доведения рН до 7,4 с помощью NaOH. Стерилизацию раствора с системой 0,2 мкм фильтрации, аликвоту в 1 мл пробирок и хранят при -20 ° С.

3. Покрытие клеток НЕК-293На активном субстратов

1. Поместите светочувствительного субстрата в стеклянном стакане, покрытой алюминием или закрытом чашке Петри и поставить в печь при 120 ° С в течение 2 ч для стерилизации. С этого момента и далее, выполнять все операции в стерильных условиях. Положите образцы в стерильных капот и дайте им остыть.
2. Шерсть светочувствительный подложка с адгезионного слоя для уменьшения гидрофобность поверхности и способствовать адгезии клеток.
   1. Поместите активные субстраты в P35 Петри или 6 Multiwell пластину. Учитывая гидрофобность конъюгированного полимерного слоя, чтобы полидиметилсилоксан (PDMS) и зафиксировать образец и ограничить решения.
      1. Смешайте PDMS и катализатор в 10: 1 пропорции с помощью стеклянной палочки и получали вязкий суспензии.
      2. Вылейте суспензии в 6 многоямного пластины, дозирования сумму, достаточную для покрытия половины каждую лунку.
      3. Подождите полимеризации PDMS при комнатной температуре.
      4. Вырезать вылечить PDMS в середине для obtaоцен- ками квадратную форму того же размера образца полимера.
      5. Стерилизовать PDMS скважин от погружения в 70% смеси этанол-вода, по крайней мере 30 мин.
   2. При использовании PDMS также, поцарапать светочувствительный слой вдоль всей границы скважины с заостренными пинцетом, чтобы избежать отделение всему слою при удалении PDMS и после культивирования клеток.
   3. Покрывать всю поверхность каждого образца с раствором фибронектина (2 мг / л в PBS). Объем между 500-750 мкл на образец, как правило, достаточно, если PDMS также используется (четкое поверхность хорошо: 15x15 мм ^2). Без PDMS также, около 2 мл фибронектина растворе необходимо полностью погрузить образец; обратить внимание, что подложка не плавает при добавлении раствора. Инкубируйте образцы при 37 ° С в течение по меньшей мере 1 ч.
   4. Удалить фибронектина решение с стеклянной пипетки и мыть один раз 2 мл PBS.
3. Plели НЕК-293 клеток на фибронектина обработанных образцов при плотности 15000 клеток на ^/ см 2 в полной среде роста. Использование объем 750-1000 мкл ПГС для каждого образца, если PDMS также используется, в противном случае 2-3 мл ПГС необходимо. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% _СО 2 в течение 24-48 часов.

4. Оптический Стимуляция протокол и Электрофизиологические измерения

1. Поместите внеклеточный раствор в водяной бане при 37 ° С до термализации; оттепель внутриклеточный решение, поставить его в 1 мл шприц с иглой 34 калибра и держать его в контакте со льдом, чтобы избежать деградации АТФ.
2. Возьмем клеток-подложки с покрытием из инкубатора, тщательно удаляя PDMS также если он присутствует. Удалить ростовой среды с стеклянной пипетки и промыть образца с внеклеточной решение. Действуйте медленно, чтобы избежать клеток отряд.
3. Положите устройство в образец-владельца электрофизиологии станции с внеклеточной SOLUTIOп и электрод сравнения. Подготовьте свежие стеклянные микропипетки для патч-зажим с выталкивающим (идеального сопротивления находится в диапазоне 2-4 МОм). Заполните половину пипетки с внутриклеточным раствором и смонтировать его на микроманипулятора.
4. Посмотрите на здоровую клетку, чтобы залатать на устройстве. Чтобы избежать нежелательного возбуждение светочувствительного субстрата, используют ИК-подсветки для визуализации, помещая фильтр длинноволновый (например, сокращение длины волны λ = 750 нм может быть использован для полимеров, поглощающих в видимой) в передней части микроскопа осветителя.
5. Патч выбранную ячейку и применять нужный протокол для оптического стимуляции путем предоставления свет к образцу с помощью пути возбуждения флуоресценции микроскопа (рис 1). Подробное описание протокола патч-зажим можно найти в ссылке 20.
   1. Поместите патч пипетки в непосредственной близости к клеточной мембране с микрометрической манипулятора. Во время позиционирования, применять overpressurе пипетки для того, чтобы избежать прилипания грязи на кончике. Пипетка должна быть несколько микрон выше ячейки.
   2. Начало снижения пипетки к клеточной мембране, контролируя сопротивление пипетки на программное обеспечение управления патч. Когда сопротивление пипетки увеличилась примерно 1 МОм, удалить избыточное давление из пипетки, применяя нежное всасывание, чтобы сформировать gigaseal между пипеткой и клеточной мембраны (т.е. измеренное сопротивление должно возрастать при значениях больше, чем 1 ГОм) ,
   3. Применить отрицательный потенциал на пипетки близко к ожидаемому ячейки потенциал покоя (для НЕК293 клеток с потенциалом -40 мВ могут быть использованы), чтобы помочь стабилизировать печать. Компенсировать емкостные переходные из-за пипетки емкостью с относительными команд на усилителе патч и / или программного обеспечения управления исправлениями.
   4. Перерыв мембрану, чтобы электрический доступ к цитоплазме клеток путем применения краткий и интенсивный импульс всасыванияпипетки. Установите патч усилитель для текущего режима зажим (I = 0, т.е. с не ток, подаваемый в камеру), чтобы отслеживать клеток мембранный потенциал. Подождите несколько минут, чтобы увидеть, если клетка потенциал стабильный.
   5. Применение нужный протокол освещения в камере и регистрируют воздействие на мембранный потенциал.
      Примечание: Подсветка может быть доставлен к образцу или от нижней или сверху, в зависимости от архитектуры микроскопа.
      1. Выбор длины волны возбуждения, что хорошо поглощается активного материала; для P3HT: PCBM смеси, длина волны в диапазоне 450-600 нм может быть использован. Подходящие плотности фотовозбуждения находятся в диапазоне 10-100 мВт / мм ^2.
         Примечание: Короткие импульсы света (ниже 10-20 мс) результат в переходном деполяризации клетки, в то время как при длительном освещении (сотни миллисекунд или дольше импульсов) с замедленным гиперполяризация наблюдается, пока свет не выключается.

Результаты

Клетки могут быть легко культивировали на P3HT: PCBM субстратов, при условии, что подходящая адгезионный слой осаждается (как фибронектин, используемого на стадии 3.2, описанной протокола). P3HT: PCBM пики оптического поглощения в зеленой части видимого спектра; Однако другие светочувствительные сопряженные полимеры могут быть выбраны в соответствии с предпочтительным диапазоне длин волн Фотостимуляция (Рис.2). Биологическая этих субстратов было продемонстрировано не тол...

Обсуждение

Критические шаги отчетный протокол для в пробирке оптического стимуляция клеток, главным образом, касаются выбор светочувствительного полимера, параметры тепловых стерилизации, интенсивность и продолжительность световых раздражителей. P3HT: PCBM тонкая пленка была выбрана здесь, так как это гарантирует хорошую временную и электрохимическую стабильность. Тем не менее, следует отметить, что не все светочувствительные полимеры могут предложить аналоговые спектакли, ^22, более конкретно, при освещении. Кр...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
rr-P3HT	Sigma Aldrich	698989-5G
Подложки с покрытием ITO	Nano-CS	IT10300100
Фибронектин	Sigma Aldrich	F1141
хлорбензол	Sigma Aldrich	319996
PCBM	Nano-C	Nano-CPCBM-BF
ацетон	Sigma Aldrich	270725
изопропиловый спирт	Sigma Aldrich	563935
элементы HEK	LGC standards srl	ATCC-CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
	PBS Sigma Aldrich	P5244
E-MEM	LGC standards srl	ATCC-30-2003
EDTA	Sigma Aldrich	E8008-FBS
	Стандарты LGC srl	ATCC-30-2020