Выявление прямых целей генома таргетирования молекул остается серьезной проблемой. Чтобы понять, как молекулы ДНК-связывающего заниматься геном, мы разработали метод, который опирается на сшивания малых молекул, чтобы изолировать хроматина (космические).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Генома Отображение лекарственно-ДНК взаимодействий в клетках с космическими (сшивание малых молекул изолировать хроматина)
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Геном мишенью некоторые из наиболее эффективных химиотерапевтических средств, но большинство из этих препаратов не имеют специфичность последовательности ДНК, что приводит к дозозависимой токсичности и многие неблагоприятные побочные эффекты. Ориентация геном с последовательностью конкретных малых молекул может позволить молекулы с повышенной терапевтическим индексом и меньшими мимо эффектов. N -methylpyrrole / N метилимидазол полиамиды являются молекулы, которые могут быть рационально, предназначенные для решения конкретных последовательностей ДНК с изысканной точностью. И в отличие от большинства природных факторов транскрипции, полиамиды могут связываться с метиловым и chromatinized ДНК без потери сродства. Последовательность Специфика полиамидов была тщательно изучена в пробирке с родственным идентификации сайта (CSI) и с традиционными биохимических и биофизических подходов, но изучение полиамида связывания с геномной целей в клетках остается неуловимым. Здесь мы приводим метод сшивания малых молекул Isolaте хроматина (космические), который идентифицирует полиамидные сайты связывания в геноме. Космический аналогична иммунопреципитации хроматина (чип), но отличается в двух важных способов: (1) photocrosslinker используется для того, чтобы избирательное, временно контролируемый захват полиамидных связывания событий и (2) биотин сродством ручка используется для очистки полиамид -DNA конъюгаты под полу-денатурирующих условиях, чтобы уменьшить ДНК, которая является нековалентно связаны. Космический является общей стратегией, которые могут быть использованы для выявления генома связывания события полиамидов и других биологических поражающих химиотерапевтических агентов.
Введение
Информация, чтобы каждая ячейка в человеческом теле закодирована в ДНК. Избирательное использование этой информации определяет судьбу клетки. Транскрипционных факторов (ТФ) являются белки, которые связываются со специфическими последовательностями ДНК, чтобы выразить определенный набор генов в геноме, и неисправность ТФ связано с наступлением широкий спектр заболеваний, в том числе дефектов развития, рак и диабет . 1,2 Мы были заинтересованы в развитии молекулы, которые могут избирательно связываться с геном и модулируют генных регуляторных сетей.
Полиамиды состоит из N -methylpyrrole и N метилимидазол рациона....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Сшивание в живых клетках
- Начните с ~ 2.5x10 7 H1 клеток, или других культивируемых клеток.
Примечание: Этот номер H1 клеток соответствует пяти 10-см чашки (приблизительно 40% слияния). - Рост клеток в средах E8 на чашках, покрытых на поверхности, поддерживающей плюрипотентных стволовых клеток (см Материалы список), и инкубируют их при 37 ° С в увлажненной атмосфере 5% CO 2. Урожай клетки ферментами (см список материалов). Примечание: Не допускайте, чтобы H1 клетки превышать 90% слияния; конфлюентности вызывает спонтанную дифференцировку клеток H1. Для подсчета клеток, растут дополнительный 10-см блюдо клеток, подними....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для учета неравномерного генома фрагментации и других переменных, очищенный ДНК всегда должны быть нормализованы против ведения ввода ДНК. Праймеров, специфичных к локусу интерес может быть использован. Это полезно также проанализировать локус, где молекула не ожидается, чтобы связать, в качестве отрицательного контроля. Мы видим увеличение> 100-кратное размещение полиамида при облучении 365 нм света (рис 2).
Обогащенный ДНК также могут быть проанализированы следующего по.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Одной из основных проблем при использовании обычного ChIP является идентификация подходящих антител. ChIP в значительной степени зависит от качества антитела, и большинство коммерческих антител неприемлемы для ChIP. На самом деле, консорциум Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) обнаружил, что только 20% коммерческих антител пригодны для анализов ChIP. 50 При COSMIC антитела заменяются стрептавидином. Поскольку полиамиды функционализируются биотином, стрептавидин используется вместо антитела для захвата сшивок.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
A.Z.A. является единственным владельцем компаний Vista Motif, LLC и WINStep Forward.
Благодарности
Мы благодарим сотрудников лаборатории Ансари и профессора Парамешварана Раманатана за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана грантами NIH CA133508 и HL099773, стипендией факультета H. I. Romnes и премией W. M. Keck Medical Research Award для A.Z.A. G.S.E. была поддержана стипендией Петерсона от Департамента биохимии и молекулярных биологических наук Training Grant NIH T32 GM07215. А.Е. был поддержан стипендией Моргриджа для выпускников и стипендией Центра стволовых клеток и регенеративной медицины, а Д.Б. получил грант NSEC от NSF.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Фенилметилсульфонилфторид (PMSF) | любой источник | ||
| Бензамидин | любой источник | ||
| Пепстатин | любой источник | ||
| Протеиназа К | любой источник | ||
| Dynabeads MyOne стрептавидин C1 | Life Technologies | 65001 | |
| PBS, pH 7,4 | Life Technologies | 10010-023 | Другие источники могут быть использованы |
| : StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A1110501 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Мы с успехом пробовали других производителей колонок ДНК. |
| TruSeq ChIP Набор для подготовки образцов | Illumina | IP-202-1012 | Этот набор может быть использован для подготовки COSMIC DNA для секвенирования следующего поколения |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356231 | Используется для нанесения покрытия планшетов с целью выращивания H1 ESCs |
| pH бумаги | любого источника | ||
| янтарных микроцентрифужных пробирок | источника | ||
| микроцентрифужных пробирок | любой источник | ||
| pyrex фильтр | любой источник | Pyrex формы для выпечки подходят | |
| qPCR master mix | любой источник | ||
| РНаза | любой источник | ||
| HCl (6 N) | любой источник | ||
| 10 см чашки для культивирования тканей | любой источник | ||
| серологические пипетки | любой источник | ||
| Пастеровские пипетки | любой источник | ||
| Наконечники для пипеток | любой источник | ||
| 15 мл конические пробирки | любой источник | ||
| центрифуга | любой источник | ||
| микроцентрифуга | любой источник | ||
| нутатор | любой источник | ||
| магнитный разделительная стойка | любой источник | ||
| УФ-источник | CalSun | B001BH0A1A | Другие УФ-источники могут быть использованы, но время сшивания должно быть оптимизировано эмпирически |
| Misonix Sonicator | Qsonica | S4000 с чашкой 431C1 Могут | быть использованы другие ультразвуковые аппараты, но условия ультразвука должны быть оптимизированы эмпирически |
| Увлажненный CO2 инкубатор | любой источник | ||
| Шкаф биологической безопасности с вакуумным выходом | любого источника |
Ссылки
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2013).
- Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nat Rev Genet<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
