Method Article

Функциональная Клонирование Использование Xenopus Ооцитов выражение системы

DOI:

10.3791/53518

⸱

January 30th, 2016

 ,  , 
1Department of Biology, Shepherd University, 2Department of Biology, University of Virginia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем систему ооцитов Xenopus и колпачков животных для экспрессии клонирования генов, способных вызывать ответ в компетентной эктодерме, и обсуждаем методы последующего анализа таких генов. Эта система полезна для функциональной идентификации широкого спектра генных продуктов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Идентификация генов, ответственных за индукцию эмбриона, сопряжена с рядом проблем; например, секретируемые молекулы, представляющие интерес, могут быть малочисленными, могут не секретироваться, но привязаны к сигнальной клетке (клеткам), или могут требовать присутствия партнеров по связыванию или предшествующих регуляторных молекул. Таким образом, в поисках генных продуктов, способных вызывать раннюю индуктивную реакцию хрусталика у компетентной эктодермы, мы использовали систему клонирования экспрессии, которая позволила бы идентифицировать паракринные или юкстакринные факторы, а также транскрипционные или другие регуляторные белки. Пулы мРНК были введены в ооциты Xenopus, а реагирующая ткань была помещена непосредственно на ооциты и подвергнута совместному культивированию. После функционального клонирования ldb1 из библиотеки кДНК на стадии нервной пластинки на основе его способности вызывать экспрессию раннего маркера плакода хрусталика foxe3 в эктодерме животного, компетентного в хрусталике, мы охарактеризовали паттерн экспрессии мРНК и проанализировали прогрессирование развития после сверхэкспрессии или нокдауна ldb1. Эта система подходит для очень широкого спектра контекстов, где идентификация индуктора или его регуляторных молекул осуществляется с использованием функционального ответа в компетентной ткани.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Передовые генетические подходы для идентификации генов, представляющих интерес, через их функцию или потерю функции1,2 являются неотъемлемой частью понимания сложных событий в процессе развития. В сочетании с мощными методами обратной генетики, доступными постоянно расширяющемуся кругу систем и исследователей3-5, теперь стало возможным идентифицировать гены с ключевой функциональной ролью в том или ином пути, а затем выяснить эту функцию на клеточном уровне и во взаимодействии с другими продуктами генов. Одним из подходов к функциональной идентификации интересующих генов, который привел к многим ключевым открытиям в прошлом, является клонирование экспрессии6,7.

Наша недавняя цель8 состояла в том, чтобы определить ранние факторы, индуктивные линзы, поскольку было продемонстрировано, что начальные этапы процесса индукции хрусталика позвоночных происходят уже на стадиях гаструлы. С этой целью мы использовали эктодерму с временным хрусталиком9 животных (стадия 11-11,510) эмбрионов Xenopus в качестве реагирующей ткани для индукции, а ооцит Xenopus VI стадии в качестве источника продукции индуцирующих факторов.

Следующий протокол основан на протоколах клонирования выражений и выбора sib Смита и Харланда6,7, также успешно используемых другими11-13. В нашей системе экспрессии ооцитов (впервые использованной для производства индуцирующих факторов Lustig и Kirschner14) отбираются и идентифицируются пулы вводимых транскриптов, способных прямо или косвенно заставлять ооциты продуцировать факторы, вызывающие индуктивную реакцию линз в эктодерме колпачка животного. Поскольку система полезна для прямой экспрессии секретируемых индуцирующих молекул (введенная ооцитами мРНК INHBB вызывает индукцию мезодермы в мезодерм-компетентной эктодерме животныхcap 8), мы первоначально ожидали, что процедура скрининга будет полезна в первую очередь для идентификации паракринных факторов. Однако, поскольку мы идентифицировали ядерный фактор в нашем скрининге (ldb18), ясно, что система может быть использована для идентификации широкого спектра молекул, таких как транскрипционные или трансляционные регуляторные факторы, микроРНК, кофакторы или юкстакриновые факторы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры были одобрены Университета Вирджинии Уходу за животными и использованию комитета.

Примечание: на фиг.1 показан схематический обзор экспериментальных процедур.

1. Подготовка ооцитов

  1. Предварительно премьер Х. Laevis самок с 150 U беременных Маре Сыворотка гонадотропин (PMSG) примерно за одну неделю до начала изоляции ооцитов. Вводите 1 мл 150 U / мл PMSG в спинной лимфатический мешок с 1 см стерильного шприца с иглой 29 G.
  2. Готовят растворы для инъекций ооцитов и ооцитов животного крышки анализа.
    1. Подготовка Ca ++ / Mg ++ -бесплатный OR 2 (OR2-): 82 мм NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,5 мМ Na 2 HPO 4, 50 мМ HEPES рН 7,2.
    2. Подготовка OR 2: OR2- плюс 1 мМ CaCl 2 и 1 мМ MgCl 2.
    3. Подготовьте OCM: 60% Лейбовиц L15, 0,4 мг / мл BSA, 100 мкг / мл гентамицина, рН 7,8.
    4. Заранеечистить 1x MBS: 88 мм NaCl, 1 мМ KCl, 0,7 мМ CaCl 2, 1 мМ MgSO 4, 5 мМ HEPES (рН 7,8), 2,5 мМ NaHCO 3.
    5. Подготовьте 3% Ficoll в 1x MBS.
    6. Приготовьте 1х NAM: 110 мм NaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ Са (NO 3) 2, 1 мМ MgSO 4, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ NaHCO 3, Na 2 мМ 3 PO 4, рН 7,4.
  3. Обезболить самку в 0,03% раствора этил 3-аминобензойной кислоты соли метансульфокислоты (MS222) в 0.1x MBS (первый растворить 0,3 г MS222 в 10 мл 95% -ного этанола, а затем разбавленной в 1 л 0,1 x MBS), поместив лягушки в растворе для 10 - 15 мин или до отвечать на запросы.
    1. Убедитесь, что анестезия является полным поворотом наркозом лягушку на спину, чтобы убедиться, что он не реагирует (полностью анестезию лягушки двигаться конечности или повернуть тело на).
  4. Хирургическим изолировать яичников фрагменты, сделав надрез в животе через кожу и стенки тела с лезвие скальпеля, изолируя ткани яичника с щипцамии ножницы. Поместите яичников фрагменты в OR2-. Закройте стенки тела с 3-0 шелковой нити на 24 мм изогнутой иглы и закрыть кожу отдельно с теми же швами. Разрешить восстановление женского в 1 г / л аквариумной соли в воде.
  5. Использование тонких щипцов, слезоточивый ткани яичника в малых (10 - 20 ооцитов) штук и передачи свежей OR2-.
  6. Defolliculate яичников фрагменты в 2,0 мг / мл коллагеназы А в OR2- перемешиванием осторожно шейкере в течение 1 ч, перенос на свежий коллагеназы и перемешивания в течение одного часа.
  7. Вымойте ооцитов в 10 раз OR2 [содержащие Са ++ / Mg ++], отбрасывая мелкие ооциты.
  8. Вымойте ооцитов в ОПК в два раза и перенести на свежий ОПК. Изолировать Стадия VI ооциты по размеру при визуальном осмотре и отбросить незрелых (меньше) ооцитов: Стадия VI ооциты больше незрелых ооцитов с еще пигментации в животном полушарии и примерно 1,2-1,4 мм в диаметре.
  9. Поддержание ооцитов на 18 - 20 ° C Iн ОЦМ перед инъекцией. Примечание: в агарозном покрытием чашки Петри могут быть использованы для минимизации прилипания ооцитов блюдо.

2. Инъекции библиотечных стенограммы

  1. Подготовьте направленного библиотека кДНК 15, используя РНК извлеченного на соответствующем этапе развития (например, нервная пластинка этап 14 10). Покупка библиотеки кДНК или построить одну использованием коммерческого набора в соответствии с информацией в четыре этапа ниже.
    1. Изолировать примерно 5 мкг мРНК, используя продукт для обогащения поли (А) + РНК (табл материалов) и в соответствии с инструкциями изготовителя. Примечание: транскрипты, которые будут использоваться для получения библиотеки кДНК могут быть ограничены индуцирующего ткани (например, нервной пластинки, после микродиссекции желаемой ткани), или может быть из цельного эмбрионов на определенной стадии.
    2. Продукция кДНК с коммерческого набора, следуя указаниям изготовителя.
    3. Перевязывать примерно 20 нг кДНК в VectoR входит в коммерческого набора или другого подходящего вектора. Соответствующий плазмидный вектор включает последовательности мРНК для стабильности, такие как 5 'бета-глобина и 3 поли (А) последовательностей (шт.2 +, pTnT, pCS105).
    4. Transform перевязка в компетентные бактериальных клеток с использованием рекомендованный протокол поставщика для преобразования теплового шока.
      Примечание: В качестве альтернативы, сборник открытой рамки считывания (ORFeome) клонов коммерчески доступен и может быть использован для создания транскриптов для инъекций.
  2. Подготовьте 10 бассейнов плазмид от 10 3 до 10 4 сложности (10 4 до 10 5 Общий сложности). Это представляет 10 пластин с 1000 - 10000 колоний каждого.
    1. Тарелка библиотека культуры на 10 15 см LB-ампициллин пластинах, растут 12 - 18 ч при 37 ° С, и собирать колонии друг от нежным давлением со стеклянной разбрасыватель в 7 мл LB.
    2. Подготовьте глицерине от 0,5 мл (добавить в 0,2 мл стерильной глицерина и хранят при -20 &# 730; С), и использовать оставшиеся 6,5 мл подготовить ДНК со стандартной коммерчески доступной ДНК минипрепаративную комплект следующим направлениям производителя.
  3. Линеаризации объединенного плазмидной ДНК (1,0 - 2,0 мкг) с соответствующим ферментом рестрикции переварить 16 при 37 ° С в течение 1 - 1,5 ч. Изолировать линеаризованной ДНК с экстракцией фенолом / хлороформом с последующим осаждением этанолом и ресуспендирования в воде согласно спецификациям набора РНК-полимеразы, используемой. Обобщить смысл РНК с коммерческого набора РНК-полимеразы следующим направлениям производителя.
  4. Подготовка иглы для микроинъекции (используя иглы съемник с стеклянной капиллярной трубки) приблизительно 20 мкм диаметром; измерения иглы советы по сложным микроскопом с калиброванной окулярного микрометра. Примечание: Настройки съемник иглы должны быть определены эмпирически для получения иглу с помощью тоненького кончика, что, когда порвал с тонким пинцетом дает нужный размер наконечника.
  5. Приготовьтесь (нажать глину вравномерным слоем на дне тарелки) глины выстроились 35 х 10 мм чашки Петри с параллельными канавками, чтобы держать ооцитов в месте во время микроинъекции; производить канавки с молл зонда или пипетки Пастера плавленого на кончике в пламени. В качестве альтернативы глины, подготовки агарозном блюда делает углубления с эластомерной плесени 17. Передача ооцитов с широким отверстием пипетки до 3% Ficoll в 1X MBS (примерно 2 мл) в строках в глиняных картонных блюд.
  6. Использование microinjector, заполните иглу с 1 нг / нл РНК и настроить баланс, чтобы произвести небольшое положительное давление (для предотвращения составления цитоплазме ооцита).
  7. Вводите ооциты с примерно 20 нл РНК в экваториальной области. Разрешить 1 час для инъекции ооцитов, чтобы остаться в Ficoll-MBS, а затем перенести мягко 1x MBS. Инкубировать в течение 8 - 24 часов при 20 ° С до животного крышки анализа.

3. Животное Кап Анализ

  1. Подготовьте 3 / 4x NAM и получить тонкий пинцет, цикл волос, изогнутые фрагменты покровное, глиняные картонных DISГЭС с чашеобразных углублений провести ооцитов. Сделать изогнутые фрагменты покровного по разваливается покровные стекла на мелкие фрагменты (примерно 1 - 2 мм х 2 - 4 мм) и не проходя через пламя до краев ногтей и свисать, создавая изогнутую часть.
  2. Оплодотворите X. Laevis яйца 18 через в пробирке или природного спаривания и культуры гаструлы (10 - 11 ч после оплодотворения при комнатной температуре) в 0.1x MBS до сортировать по сцене; собирать середине гаструла (этап 11 - 11,5) 10 эмбрионов.
  3. Эмбрионы перевод в чашке Петри примерно наполовину с 3/4-кратным ДН. Использование двух пар тонких щипцов, удалить оплодотворения (желточный) мембрану из гаструлы.
  4. Передача ооцитов 3 / 4x ДН (примерно 2 мл) в глиняных картонных блюд и иммобилизации в отдельных впечатлений в глине, производя впечатления для размещения индивидуальных эмбрионов в канавки были описаны выше.
  5. Эмбрионы передачи в глиняных картонных блюд и сократить шапки животных от гastrulae с помощью двух пар тонких щипцов. Позаботьтесь, чтобы изолировать животное колпачок эктодермы только и не экваториальный ткани 18.
  6. Поместите животное колпачок на животных полушарии каждого ооцита с внутренней поверхностью, контактирующей животного крышкой ооцит. Удержание рекомбинантов вместе с применением изогнутого стекла покровное фрагмент и применения понижающее давление на стекло, уплощение эктодермы, как покровное контактов глину (колпачки животное может оставаться открытой с внутренним слоем воздействию поверхности ооцита на 6 - 8 ч или больше ).
    Примечание: В качестве альтернативы, поместите животное колпачок в глиняном отступа с его внутренней поверхности вверх и разместить яйцеклетки на крышке; обеспечить рекомбинантный с небольшими расширениями глины.
  7. Культура в 20 ° С до контрольных эмбрионов не достигают желаемого почву для анализа.
  8. Отдельная рекомбинантный путем удаления покровное / глины и выделения эктодермы щипцами и петлей для волос.
  9. Fix эктодермальные фрагменты в течение 1 часа в MEMFA (3,8%формальдегида в MEM [М MOPS 0,1 рН 7,4, 2 мМ EGTA, 1 мМ и MgSO 4]).
  10. Фрагменты передачи (и эмбрионы управления) от MEMFA в этаноле и хранят при -20 ° С.

4. Анализ ответов в эктодермы по гибридизация (ISH)

  1. Готовят растворы для ISH.
    1. Подготовка 1X PBS: 0,01 М фосфатный буферный солевой раствор NaCl, 0,138 М, рН 7,4
    2. Подготовьте PBS-Tween (PTW): 1X PBS, 0,1% Tween-20
    3. Приготовьте раствор 100X Денхарта: 2% BSA, 2% поливинилпирролидон, 2% фиколл
    4. Подготовка гибридизации буфер: 50% формамида, 5x SSC, 1 мг / мл РНК дрожжей Torula, 1 мкг / мл гепарина, раствора 1x Денхарта, 0,1% Твин-20, 0,1% CHAPS, 10 мМ ЭДТА, DEPC-H 2 O
    5. Подготовьте малеиновой кислоты буфера (МАВ): 100 мм малеиновой кислоты, 150 мМ NaCl, рН 7,5
    6. Подготовка МАБ + блок: МАБ, 2% блокирующий реагент (тепла до 60 ° С, чтобы растворить)
    7. Подготовка щелочной фосфатазы (AP) буфера: 100 мМ ТрисрН 9,5, 50 мМ MgCl 2, 100 мМ NaCl, 0,1% Твин, дН 2 O
  2. Подготовка РНК зонд.
    1. Использование коммерческого набора РНК-полимеразы и рыть-NTP смесь, добавить 1,5 мл трубки (50 мкл реакции): 25,5 мкл DEPC-H 2 O, 10 мкл 5X транскрипции буфера, 2,5 мкл 10х DIG-NTP смесь, 5 мкл 100 мМ ДТТ, 2 мкл Rnasin, 2 мкл ДНК-матрице линеаризованной (~ 1 мкг / мкл), 3 мкл РНК-полимеразы и инкубируют 37 ° С в течение 90 мин.
    2. Добавить 2 мкл РНК-полимеразы и инкубировать 37 ° C в течение 60 мин.
    3. Проверка 2 мкл реакции на 1% агарозном геле.
    4. Добавить 1 мкл RQ1 РНКазы ДНКазы и инкубировать 37 ° C в течение 20 мин.
    5. Осадок зонд путем добавления 50 мкл DEPC-H 2 O, 25 мкл 10 М ацетата аммония и 313 мкл этанола. Хранить при -20 ° С в течение ночи (O / N) затем восстановить РНК центрифугированием при 13800 х г в течение 20 мин. Промыть 500 мкл 75% этанола, кратко спина, удалитьэтанол и позволяют гранулы высохнуть на воздухе. Добавить 50 мкл DEPC-H 2 O.
    6. Добавить гибридизации буфер до конечной концентрации ~ 0,5 мкг / мкл.
  3. Подготовка ткани для гибридизации. Если не указано иное, заполнения флаконов на вершину с каждым изменением Решение, описанное (приблизительно 4 мл).
    1. Удалить этанола из флаконов и эмбрионов передачи в 75% этанола / PTW, то 50% этанол / PTW в течение 10 мин каждый, горизонтально на качалке.
    2. Вымойте три раза в PTW в течение 5 мин каждый на качалке.
    3. Трансфер до 10 мкг / мкл протеиназы К лечения в PTW; рок трубки вертикально 15 мин.
    4. Промыть два раза 10 минут каждый в 0,1 М триэтаноламин рН 7,8 - рок труб по вертикали.
    5. Добавить 12,5 мкл уксусного ангидрида в пробирки и рок вертикально 5 мин. Повторите с дополнительной уксусного ангидрида 12,5 мкл в течение 5 мин.
    6. Стирать в PTW 5 мин на рокера вертикально.
    7. Refix в 4% параформальдегид 20 мин на качалке. Тепло Гибридизация буфера60 ° C.
    8. Вымойте три раза в PTW в течение 5 мин каждый на качалке.
    9. Удалить все, но ~ 1 мл PTW из каждой пробирки и добавить 250 мкл Hyb буфера; нежно вихревой трубы, чтобы перемешать. Рок трубы вертикально 5 мин.
    10. Замените 60 ° Hyb буфера (0,5 мл) и перемешивают осторожно в 60 ˚C 10 мин. Замените свежим Hyb буфера и агитировать на 60 ˚C два 4 ч.
    11. Тепло зонд (1 мл на 0,5 мкг / мкл в буфере Hyb) до 60 ° С (3 мин). Удалить Hyb буфера и добавить зонд труб. Перемешайте осторожно O / N на 60 ° C.
  4. Подготовка ткани для антитела.
    1. Теплый Hyb буфера и 2x SSC + 0,1% Tween-20 решения 60 °.
    2. Заменить зонд решение с Hyb буфера (сохранить зондов при -20 ° С в течение 2 - 3 раза повторного). Мыть в 60 ° С в течение 10 мин.
    3. Вымойте три раза при 60 ° С в 2х SSC-Tween (20 мин каждый при перемешивании).
    4. Вымойте три раза при 60 ° С в 0,2 x SSC-Tween (20 мин каждый при перемешивании).
    5. Вымойте два раза в МАБ (RT) в течение 15 мин каждый горизонтально на качалке.
    6. Добавить 1 мл МАБ + блок. Вымойте 2 ч вертикально на качалке.
    7. Трансфер в 1 мл МАБ + блока, содержащего 1/2000 Anti-дигоксигенин-AP. Rock вертикально в 4 CO / N.
  5. Подготовка ткани для цвета реагента.
    1. Заменить раствор антител с МАБ; мыть три раза в МАБ 5 мин каждый горизонтально на качалке.
    2. Вымойте три раза в МАБ 1 час каждый горизонтально на качалке.
    3. Вымойте два раза в AP буфера 10 мин каждый горизонтально на качалке.
    4. Передача ткани многократного а пластиковый лоток, удалить AP буфером и BM Фиолетовый реагента (~ 1 мл). Разрешить протекания реакции в темно-5 мин до O / N.
    5. При необходимости окрашивания достигается, трансфер ткани флаконов PTW. Вымойте два раза 10 минут в каждом PTW на качалке.
    6. Fix в растворе Буэна в 4 CO / N на качалке.
    7. Промойте Буэна с тремя 70% этанола / 30% PTW моет при комнатной температуре. Действуйте тО захвата изображения с помощью эпи-освещение и микроскопа монтажа камеры, отбеливание, при необходимости, 18 лет.

5. Сиб Выбор и клонирование

  1. Выберите бассейн с высокой активностью (наибольший резонанс в ткани эктодермы).
  2. Титрование (разбавить LB для соответствующей плотности) в глицерине для бассейна с высокой активностью и пластины из десяти новых пластин с примерно одной десятой колонии от предыдущей стадии (с использованием раздел 2 в протоколе выше).
  3. Уменьшить размер пула, пока деятельность не прослеживается в одной колонии.
  4. Получение ДНК-последовательность, с использованием стандартных праймеров в векторе.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В ответ на экспрессию мРНК введенного в ооцитах, отвечая животных колпачок ткань анализировали на экспрессию Otx2 от гибридизация (рисунок 2 и таблица 1); Otx2 выражается в предполагаемый линзы эктодермы (PLE) от закрытия нервной трубки через объектив плакоде утолщение 19. Однако, поскольку Otx2 выражается также в передней части нервной эктодермы, а также не-нервной головной эктодермы вне PLE, это связано ка...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способ, описанный здесь, для функционального клонирования генов, способных индуцировать ответ в компетентный эктодермы может быть использован, чтобы идентифицировать широкий спектр продуктов генов. Этот метод расширяет прошлой работе путем объединения ткани вызывающие анализы методов с выражением клонирования. Мы используем метаболических путей ооцита Xenopus в качестве источника производства индуцировать факторы, прямо или косвенно, после инъекции РНК. Это, в сочетании с использованием известных методов для кл...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом на профессиональное развитие для C.Z.P. от Фонда Университета Шеперда. Авторы хотели бы поблагодарить Бретта Зиркла и Малию Десотель за полезные обсуждения протоколов, а также доктора Кэрол за щедрую помощь.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12/101 Исследования развития антителHybridoma Bank12/101Моноклональное антитело для обнаружения мышечной ткани
20x SSC BufferSigmaS6639для ISH
Уксусный ангидридSigmaA6404для ISH
Anti-Dig-APRoche11093274910для ISH
Aurum Plasmid Mini KitBio-Rad732-6400Очистка плазмидной ДНК
Блокирующий реагентRoche11096176001для ISH
BM PurpleRoche11442074001для
гибридизационной печи ISH Boekel FisherScientific13-245-121для ISH
Bouin's SolutionSigmaHT10132для ISH
BSASigmaA9647для OCM
CHAPSSigmaC3023для ISH
Коллагеназа АRoche10103578001Дефолликуляция ооцитов
ЦистеинСигмаC121800Дежелли эмбрионы
DEPC-H2OFisher ScientificBP5611для ISH
Dig-RNA Меченая смесьRoche11277073910для зондов ISH
Дюмон #5 щипцыWorld Precision Instruments500233для оболочки Vitelline удаление
этил3-аминобензоатаSigmaA5040MS222 анестетика
Ficoll PM 400SigmaF4375для инъекционных сред
ФормамидSigmaF9037для ISH
Гентамицина сульфатаSigmaG1914для OCM
Стеклянные капиллярыWorld Precision Instruments48783,5" длиной, внутривенный, D, 0,530 мм
Стеклянные флаконы для образцовFisher Scientific06-408Bдля ISH
Петлядля волос Волосы, помещенные в пастеровскую пипетку для манипуляций с тканями
Гепарин натриевая сольSigmaH4784для ISH
Injector Nanoliter 2010World Precision InstrumentsNanoliter 2010Микропроцессорный микроинъектор
Instant OceanКаролина972433Аквариумная соль для восстановления лягушек
IRBG XGC Xenopus проверенная полноразмерная камера кДНКИсточник бионауки989_IRBGбиблиотека кДНК 
Пластины LB Agar с 100 & микро; г/мл АмпициллинTeknovaL5004150 мм предварительно залит LB-Amp планшеты для отбора сиба
LB Luria BrothTeknovaL8650LB для сбора колоний в сиб-селекции из планшетов и разведения культур
Magnetic mRNA Isolation KitEngland BioLabsS1550Sдля выделения поли(А)-обогащенной РНК
Maleиновая кислотаSigmaM0375для ISH
Ручной микроманипуляторMicrofil World Precision InstrumentsM3310RРучной микроманипулятор
Nutating MixerFisher Scientific22-363-152Коромысло для ISH
PermoplastNascoSB33495MГлина для инъекций и препарирования посуды
Фосфат Буферизованный ФизиологическийSigmaP5368для ISH
PMSGSigmaG4877для стимуляции развития ооцитов
ПоливинилпирролидонSigmaPVP40для
ISH Программируемый пуллерWorld Precision InstrumentsPUL-1000Микропипетка
Proteinase KSigmaP6556для ISH
pTnT VectorPromegaL5610построение библиотеки кДНК
Рибопроб Комбинированная системаPromegaP1450in vitro транскрипция
надстрочный полноразмерный набор для создания библиотеки кДНКLife Technologies18248013набор для построения библиотеки кДНК
Шовные материалы, 3-0 шелкFisher Scientific19-037-516Шовная нить и игла для удаления после ооцитов
TorulaRNA SigmaR3629для ISH
ТриэтаноламинSigmaT1502для ISH
Tween 20SigmaP9416для
ISH Универсальная система синтеза кДНК RiboClonePromegaC4360альтернативный набор для построения библиотеки кДНК
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome CollaborationSource Bioscience5055_XenORFeomeORFeome Clones
XL2-Blue Ultraкомпетентные клеткиAgilent Technologies200150клетки для трансформации кДНК библиотека
New игла

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).
  2. Grainger, R. Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future. Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).
  3. Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51, 835-843 (2013).
  4. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
  5. Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides. Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).
  6. Smith, W., Harland, R. Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center. Cell. 67, 753-765 (1991).
  7. Smith, W., Harland, R. Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
  8. Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1. Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).
  9. Servetnick, M., Grainger, R. Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Development. 112, 177-188 (1991).
  10. Nieuwkoop, P., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
  11. Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis. Cell. 81, 85-94 (1995).
  12. Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation. Development. 122, 4001-4012 (1996).
  13. Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities. Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).
  14. Lustig, K., Kirschner, M. Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).
  15. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE Science Education Database. , (2015).
  16. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. JoVE Science Education Database. , (2015).
  17. Viczian, A., Zuber, M. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932(2010).
  18. Sive, H., Grainger, R., Harland, R. Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).
  19. Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus. Development. 125, 3509-3519 (1998).
  20. Medina-Martinez, O., Jamrich, M. Foxe view of lens development and disease. Development. 134, 1455-1463 (2007).
  21. Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism. Methods. 66, 398-409 (2014).
  22. Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project. Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).
  23. Karpinka, J., et al. Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).
  24. Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PLoS ONE. , e79469(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Xenopus Oocyte Expression SystemAnimal Cap AssayFunctional CloningmRNA InjectionEmbryonic InductionLens Placode MarkerIn Situ HybridizationOocyte IsolationTissue RecombinationDevelopmental Biology

Related Articles