Методическая статья

Радиоактивной и Количественная клеточном уровнях фосфоинозитидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании-Flow мерцаний

DOI:

10.3791/53529

⸱

6 января 2016 г.

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Program in Molecular Science, Ryerson University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фосфоинозитиды сигнализируют липиды, чья относительная численность быстро меняется в ответ на различные раздражители. Эта статья описывает метод измерения обилие фосфоинозитидов метаболически нумерующих клеток с 3 H-мио -inositol с последующей экстракцией и деацилирования. Извлеченные глицеро-inositides затем разделяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и количественно с помощью проточной сцинтилляции.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фосфоинозитиды (PtdInsPs) являются важными сигнальными липидами, ответственными за привлечение специфических эффекторов и наделение органелл молекулярной идентичностью и функцией. Каждый из семи PtdInsP различается по своему распределению и численности, которые жестко регулируются специфическими киназами и фосфатазами. Обилие PtdInsP может резко меняться в ответ на различные сигнальные события или нарушение регуляторного механизма. Чтобы понять, как эти события приводят к изменениям количества PtdInsP и их результирующему влиянию, важно количественно оценить уровни PtdInsP до и после сигнального события или между контрольными и аномальными условиями. Однако из-за их низкой распространенности и схожести количественная оценка относительных количеств каждого PtdInsP может быть сложной задачей. В данной статье описан метод количественного определения уровней PtdInsP путем метаболического мечения клеток 3H-мио-инозитолом, который входит в состав PtdInsP. Затем фосфолипиды осаждаются и деацилируются. Полученные растворимые 3H-глицероинозитида далее экстрагируют, разделяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и детектируют с помощью проточной сцинтилляции. Подробно описана маркировка и обработка образцов дрожжей, а также инструментальная настройка ВЭЖХ и проточного сцинтиллятора. Несмотря на потерю структурной информации о содержании ацильной цепи, этот метод чувствителен и может быть оптимизирован для одновременного количественного определения всех семи PtdInsP в клетках.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фосфоинозитиды (PtdInsPs) являются важными сигнальными фосфолипидами, которые помогают регулировать различные клеточные функции, включая передачу сигнала, мембранный транспорт и экспрессию генов, которые затем модулируют поведение клеток более высокого порядка, такое как деление клеток, идентичность органелл и метаболическая активность1-3. Существует семь разновидностей PtdInsP, которые образуются в результате фосфорилирования 3, 4 и/или 5 позиций инозитоловой головной группы фосфатидилинозитола (PtdIns), родительского фосфолипида. Важно отметить, что семь видов PtdInsP распределены неравномерно, и локальная концентрация каждого вида PtdInsP может увеличиваться или уменьшаться в определенных субклеточных участках, где они связываются с определенным набором белковых эффекторов, что в совокупности позволяет каждому PtdInsP контролировать идентичность и функцию мембраны своего хозяина3,4. Кроме того, уровни каждого PtdInsP необходимо строго контролировать, поскольку это может значительно повлиять на интенсивность сигнала, производимого PtdInsP. Локализация и уровни каждого PtdInsP зависят от таргетирования и активности многочисленных липидкиназ, фосфатаз и фосфолипаз, которые опосредуют синтез и оборот каждого PtdInsP3,4. Следовательно, неправильная регуляция регуляторного механизма PtdInsP может нарушить функцию клеток, что приводит к таким заболеваниям, как рак и дегенеративные заболевания2,5,6. Чтобы полностью понять роль и функции PtdInsP и их регуляторный механизм, были разработаны методы на основе микроскопии и биохимии для отслеживания и количественного определения PtdInsP.

Во многих случаях PtdInsPs связываются со своими белковыми эффекторами через определенный белковый домен7-9. Эти белковые модули часто сохраняют свои свойства сворачивания и распознавания липидов при экспрессии отдельно от всего белка. Это привело к появлению зондов PtdInsP путем слияния специфического PtdInsP-связывающего белкового домена с флуоресцентным белком (FP), таким как зеленый флуоресцентный белок (GFP), для субклеточного обнаружения PtdInsP с помощью микроскопии. Действительно, во многих исследованиях использовались FP-слитые белковые модули PtdInsP для идентификации локализации и динамики конкретных видов PtdInsP с помощью визуализации живых клеток1,10. Например, домен гомологии Плекстрина фосфолипазы C δ1 (PLCδ1), слитой с GFP, специфически распознает фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат [PtdIns(4,5)P2] на плазматической мембране, в то время как тандемные копии домена FYVE раннего эндосомного антигена 1 (EEA1) были использованы для отслеживания фосфатидилинозитол-3-фосфата (PtdIns3P) на эндосомах10-13. В целом, методы, основанные на микроскопии, отлично подходят для визуализации локализации и динамики PtdInsP, но есть несколько предостережений, в том числе то, что PtdInsP-связывающие домены могут также взаимодействовать с дополнительными факторами, отличными от целевых видов PtdInsP, и что они не могут обнаруживать изменения ниже цитозольной флуоресценции FP-зондов.

Биохимические методы, включая тонкослойную хроматографию, масс-спектрометрию и радиоизотопное мечение, также могут быть использованы для характеристики и количественной оценки уровней каждого PtdInsP14-16. Эти методы требуют выделения липидов для обнаружения клеточных уровней PtdInsPs. Масс-спектрометрия может быть использована для определения характеристик фосфолипидов из липидных экстрактов и имеет неоценимое значение для определения состава ацильной цепи PtdInsPs14,17. Тем не менее, масс-спектрометрия в основном является полуколичественной, и по-прежнему трудно разрешить и одновременно количественно определить виды PtdInsP с одной и той же молекулярной массой14,17. Для сравнения, радиоизотопное мечение PtdInsPs с последующим сцинтилляцией потока, сопряженным с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), полезно для разделения и одновременного количественного определения всех семи видов PtdInsPs18. Использование ВЭЖХ с колонной с сильным анионообменным (SAX) обеспечивает разделение на основе молекулярной массы, заряда и формы, тем самым фракционируя деацилированные PtdInsPs (Gro-InsP) даже с той же молекулярной массой и зарядом. Связывание элюента ВЭЖХ с проточным сцинтиллятором затем генерирует радиоактивные сигнальные пики для каждой разновидности Gro-InsPs относительно исходного родительского глицерин-инозитола (Gro-Ins)18. В конечном итоге это соответствует относительным уровням PtdInsP в клетках.

Радиоактивное мечение PtdInsPs и сцинтилляция, связанная с ВЭЖХ, является полезным инструментом для исследования регуляции и функции фосфатидилинозитола 3,5-бисфосфата [PtdIns(3,5)P2], PtdInsP, который составляет всего ~0,1-0,3% от PtdIns16,19,20. Синтез PtdIns(3,5)P2 осуществляется 5-киназой PtdIns3P под названием Fab1 у дрожжей и PIKfyve у млекопитающих21. Этой реакции противодействует 5-фосфатаза PtdIns(3,5)P2, называемая Fig4 у дрожжей или mFig4/Sac3 у млекопитающих22-24. Интересно, что как PIKfyve/Fab1, так и mFig4/Fig4/Sac3 существуют в едином комплексе и регулируются белком-адаптером каркаса, Vac14 у дрожжей или mVac14/ArPIKfyve у млекопитающих25,26. В дрожжевых клетках, удаленных VAC14, Fab1 не функционирует эффективно, что приводит к снижению уровня PtdIns(3,5)P2 на 90%27,28. С другой стороны, Atg18 является эффекторным белком PtdIns(3,5)P2, который может контролировать вакуолярное деление 29. Atg18 также является негативным регулятором PtdIns(3,5)P2, поскольку делеция его гена, ATG18, вызывает 10-20-кратное увеличение уровня PtdIns(3,5)P2 29,30. В целом, изменения в уровнях PtdIns(3,5)P2 серьезно влияют на функцию вакуоли дрожжей и лизосом млекопитающих, влияя на такие процессы, как мембранный транспорт, созревание фагосом, аутофагия и транспорт ионов 6,19,21,31.

В этой статье описывается процесс радиоизотопного мечения PtdInsPs с 3H-мио-инозитолом в дрожжах для обнаружения относительных уровней PtdIns(3,5)P2 в штаммах дрожжей дикого типа, vac14Δ и atg18Δ. На примере этого показана разрешающая способность ВЭЖХ для разделения отдельных PtdInsP, а также чувствительность сцинтилляции потока для обнаружения следовых следов 3-H-мио-инозитола. Мы также подробно рассмотрим, как можно оптимизировать методологию маркировки и выделения 3H-меченых PtdInsP из клеток млекопитающих, образцы которых, как правило, более сложны, поскольку эти клетки обладают всеми семью видами PtdInsP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Приведенный ниже текст подробно описывает метод измерения PtdInsPs в дрожжах. Она обеспечивает экспериментальные данные для маркировки клеток дрожжей с 3 H-мио -inositol, добывающих и deacylating липидов и протокола ВЭЖХ-элюции для фракционирования и количественно деацилированный PtdInsPs. Пожалуйста, обратите внимание, что маркировка, деацилирования, разрешение и количественное PtdInsPs в клетках млекопитающих требуют оптимизации и длинные профили ВЭЖХ-элюирования. Эти детали могут быть найдены в других местах, хотя мы обсудим некоторые аспектов в обсуждении. В целом, методика для извлечения липидов, deacylate и извлечь водорастворимые GRO-InsPs из дрожжевого дается и показано на фиг.1.

1. Протокол для маркировки и Анализ PtdInsPs в дрожжах

  1. Клеточная культура и радиоактивной
    1. Выращивают жидкой культуральной 20 мл дрожжевого штамма SEY6210 при 30 ° С с постоянном встряхивании в полном синтетическихСМИ середины логарифмической фазы или оптической плотности при 600 нм (OD 600) приблизительно 0,6-0,7 с.
      Примечание: Не используйте YPD СМИ, так как это может повлиять на 3 Н мио -inositol включение. Этот размер культура должна обеспечить достаточный материал для 2-3 ВЭЖХ трасс.
    2. Гранул в общей сложности 10-14 OD дрожжевых клеток (обратите внимание, что 1 мл культуры с OD 600 = 1 содержит около 1x10 7 клеток) центрифугированием при 800 х г в течение 5 мин в 12 мл с круглым дном трубки. Ресуспендируют с 2 мл инозитол-среды, свободной (IFM) (см таблицу 1 для IFM состава).
    3. Повторите центрифугирования и аспирации средства массовой информации. Ресуспендируют гранул с 440 мкл IFM и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин.
    4. Добавить 60 мкл 3 H-мио -inositol (1 мкл = 1 мкКи) к каждому образцу и инкубировать при растущей температуре 30 ° С в течение от 1 до 3 ч с постоянном встряхивании.
      Внимание: 3 Н мио -inositol является радиоактивным помощникриала, который должен быть обработан после соответствующей подготовки. Кроме того, все расходные материалы, которые делают контакт с 3 H-материал, содержащий должны быть утилизированы надлежащим образом и обозначается как радиоактивных отходов.
      Примечание: Температура роста может быть изменен в соответствии с требованиями тех пор, пока все штаммы в сравнении выращивают при той же температуре.
    5. Передача клеточной суспензии (500 мкл) в микроцентрифужных пробирку, содержащую 500 мкл 9% хлорной кислоты и 200 мкл кислоты промывали стеклянные шарики. Смешайте инверсии и инкубировать на льду в течение 5 мин.
    6. Vortex образца при максимальной скорости в течение 10 мин и передачи лизатов к новому трубки микроцентрифужных использованием гель-наливного наконечника, чтобы избежать стеклянные шарики.
    7. Гранул образца при 12000 х г в течение 10 мин при 4 ° С и аспирата супернатант.
    8. Ресуспендируют гранул путем обработки ультразвуком ванны в 1 мл охлажденного льдом 100 мМ EDTA. Гранул снова, как и прежде.
  2. Деацилирование и добыча
  3. Свежий подготовить 5,0 мл Деацилирование реагента путем объединения 2,3 мл метанола, 1,3 мл 40% раствора метиламина, 0,55 мл 1-бутанола и 0,80 мл воды. Обратить перемешать.
  4. Аспирируйте ЭДТА и разрушать ультразвуком осадок в 50 мкл воды.
  5. Добавить 500 мкл реагента деацилирования и разрушать ультразвуком перемешать. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин.
  6. Тепловые липидов в течение 50 мин при 53 ° С в нагревательный блок. Сушат образцы полностью вакуумным центрифугированием в течение 3 ч или O / N.
    1. Убедитесь, что химическая ловушка устанавливается между вакуумной центрифуге-и вакуумным насосом, чтобы предотвратить попадание паров в воздухе.
  7. Ресуспендируют гранул с 300 мкл воды ванны ультразвуком и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин. Высушите образцы от вакуумного центрифугирования в течение 3 ч или O / N. Повторите этот шаг еще раз.
  8. Разрушать ультразвуком осадок с 450 мкл воды. Это водную фазу в процессе экстракции.
  9. Свежий подготовить 10 мл extractioп реагента добавлением 8,0 мл 1-бутанола, 1,6 мл этилового эфира и 0,40 мл этилового эфира муравьиной кислоты. Обратить перемешать.
  10. Добавить 300 мкл экстракционного реагента в водной фазе. Вихревой смесь на максимальной скорости в течение 5 мин и слои разделяют центрифугированием при максимальной скорости (18000 х г) в течение 2 мин.
  11. Собирают нижнюю водную фазу в новую пробирке, избегая при этом верхний органический слой, интерфейс и осадок. Повторите экстракцию водной фазы в два раза больше свежей экстракционной реагента.
  12. Полностью высушите собранную водный слой путем вакуумной центрифугирования. Дисперсные осадок в 50 мкл воды ванны ультразвуком.
  13. Добавьте 2 мкл каждого образца 4 мл сцинтилляционной жидкости в сцинтилляционный флакон 6 мл полиэтиленовую. Определить количество отсчетов (в КФМ) в каждом образце жидкой фазе, используя открытое окно.
  14. Не хранить образцы при -20 ° С до готовности для ВЭЖХ.
  • Разделение3 Н-глицеро-inositides методом ВЭЖХ
    1. Получают буфер A путем фильтрации 1 л воды высшей степени очистки с бутылкой сверху 0,22 мкм вакуум-фильтре с последующим дегазации.
    2. Получают буфер B, сделав 1 л раствора 1 М двухосновного фосфата аммония (APS, МВт 132,06) в воде и доведения рН до 3,8 с помощью фосфорной кислоты. Фильтр фосфат аммония с бутылкой сверху 0,22 мкм вакуум-фильтре с последующим дегазации.
    3. Соберите пузырек впрыска по оснащению 2 мл флакон с пружинным 250 мкл малого объема вставки. Загрузите 10 млн CPM и добавьте воду при общем объеме 55 мкл. Приготовьте чистый флакон с 55 мкл воды.
    4. Крышка флаконы с винтовой крышкой оборудованных с ПТФЭ / силиконовой перегородками (красный лицевой стороной внутрь флакона). Поместите каждый флакон в автоматической выборки лоток ВЭЖХ, начиная с пустой флакон.
    5. Используйте ВЭЖХ и соответствующее программное обеспечение, которое управляет буфера потока, дегазирует буферы и контролирует образец injectiна. Используйте онлайн сцинтиллятор потока и его соответствующее программное обеспечение для регулирования скорости потока искрящийся и контролировать сигнал на 3 Н-распада.
      1. Использование SAX жидкого хроматографическую колонку с размерами 250 мм х 4,6 мм и содержащую 5 мкм кремнезема смолы в ВЭЖХ. Экипировка столбец с колонки охранника, чтобы предотвратить введение примесей.
      2. Установите 3 Н-совместимого мобильного 500 мкл потока в сцинтиллятора потока.
        Примечание: Фракционирование может быть сделано с Agilent 1200 серии бесконечности ВЭЖХ системы контролируемого программного обеспечения Chemstation или с другими коммерчески доступных систем ВЭЖХ. Поток мерцание ВЭЖХ элюента может быть сделано с сцинтиллятора β-RAM потока контролируемой с помощью программного обеспечения или другого Лаура коммерчески доступного сцинтиллятора потока или совместимого программного обеспечения.
    6. Инициализировать четвертичного насоса, при скорости потока 1,0 мл / мин с 100% -ным буфером А.
    7. Настройка профиля уравновешивания на ВЭЖХконтролировать градиент буферов А и В (называем это "Протокол равновесия"): 1% буфера В в течение 5 мин, 1-100% B в течение 5 мин, 100% B в течение 5 мин, 100-1% B в течение 5 мин, 1% B в течение 20 мин. Установите предел давления в 400 бар, 1,0 мл / мин скорости потока, и 30 мин во время выполнения.
    8. Настройте профиль элюции (рисунок 2) на ВЭЖХ контролировать градиент буферов А и Б (называют это "Протокол"): 1% B в течение 5 мин, 1-20% B в течение 40 мин, 20-100% В течение 10 мин, 100% B в течение 5 мин, 100-1% B в течение 20 мин, 1% B в течение 10 мин. Установите предел давления в 400 бар, 1,0 мл / мин скорости потока, и 90 мин во время выполнения.
    9. Настройка протокола обнаружения на сцинтиллятора потока (называем это "протокол обнаружения"), чтобы запустить в течение 60 мин при скорости потока текучей среды сцинтилляционного 2,5 мл / мин и времени выдержки 8,57 сек.
    10. Программирование автоматизированной последовательности впрыска на ВЭЖХ начать с воды заготовки на "Протокол для уравновешивания", а затем по электроннойACH радиоактивным изотопом пробы на "Протокол". Инициализировать последовательность, когда будете готовы.
    11. В то время как вращение сохраняется в протоколе уравновешивания создать партию на сцинтиллятора для измерения расхода всех образцах с "Протокол обнаружения." Инъекция каждого нового образца будет инициализировать "Протокол" на ВЭЖХ, а запуск сцинтиллятор потока, чтобы начать "Протокол обнаружения."
    12. По завершении всех трасс, промыть ВЭЖХ, колонка и сцинтиллятор течь со 100% буфера А в течение 30 мин при 1,0 мл / мин скорости потока.
  • Анализ данных
    1. Используйте программное обеспечение Laura или любое другое программное обеспечение, которое может количественно спектры хроматографии. Шаги, описанные в этом разделе показаны на рисунке 3.
    2. Откройте файлы, нажав кнопку "Файл", "Открыть" и выберите файл исходных данных для каждого образца.
    3. На вкладке "хроматограммы", зоом, чтобы растянуть каждый из меньших пиков (около 1000 на счету [у-ось]), сохраняя разрешение по времени. Осмотрите каждого пика, если необходимо.
    4. Выделите каждый из пиков для анализа с помощью "Добавить ROI" инструмент. Определить пики по времени элюирования: Родительский GRO-Ins в 10 мин, Гро-Ins3P на 18 мин, Гро-Ins4P на 20 мин, Гро-Ins (3,5) P 2 на 29 мин и Гру-Ins (4,5 ) Р 2 при 32 мин.
    5. На вкладке "Регионы" таблицы, записывать "площадь (графов)» каждого пика. Обратите внимание на "Старт (мм: сс)" время и "конец (мм: сс)" времени каждого пика.
    6. Для вычитания фона, выделить области, примыкающей к вершине, охватывающей такое же количество времени. Вычитание число отсчетов из соответствующего пика.
    7. Нормализовать площадь каждого пика против родителей Гру-Ins (в виде "% от общего объема PtdIns"). Затем, нормализуют каждую из вершин в каждой экспериментальной состоянии по отношению к контрольной группы (в виде "п-кратно увеличение по сравнению с контролем ").
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация каждого пика может быть сделано в отношении общего счета, но так как родительский Гру-Ins гораздо более обильные, чем всех других PtdInsPs результаты, как правило, похожи.
    8. Экспорт данных для хроматографов, нажав кнопку "Файл", "Сохранить как ..." и выберите "CSV (разделенные запятой)" формат файла. Участок данных в электронной таблице и представить по мере необходимости.

    • Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Используя этот метод, дрожжи PtdInsPs были метаболически метили с 3 H-мио -inositol. После маркировки, фосфолипиды осаждают хлорной кислотой, а затем фосфолипидов деацилирования и извлечения водорастворимого Gro-InsPs (фиг.1). На этом этапе важно, чтобы определить общую радиоактивный сигнал, связанный с извлеченной Гру-InsPs в жидкой фазе, чтобы обеспечить достаточное отношение сигнал-шум для очень низкой численности PtdInsPs как PtdIns (3,5) P 2...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Эта статья подробно описывает экспериментальный протокол, необходимый для количественного клеточные уровни PtdnsPs с помощью ВЭЖХ связью потока мерцаний от дрожжей. Методика дает возможность обмена веществ маркировки PtdInsPs с 3 H-мио -inositol с последующей обработкой липидов и извлечения водорастворимого 3 Н-Gro-InsPs, ВЭЖХ фракционирование и анализа. Использование этого метода, относительные уровни PtdInsPs в клетках при различных условиях может быть количественно, как показано на PtdI...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

    Благодарности

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    C.Y.H. был поддержан стипендией для выпускников Онтарио от правительства Онтарио. Эта статья стала возможной благодаря финансированию, предоставленному R.J.B. Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям, Канадской программой исследовательских кафедр и Университетом Райерсона.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    1-БутанолБиобазBC1800Реагент
    Аммонийфосфат двухосновнойBioshopAPD001ACS Сульфат
    аммонияБиобазовыйADB0060Ультрачистый сорт
    АвтосамплерAgilentG1329BAgilent 1260 бесконечная серия
    БиотинSigmaB4501
    Борная кислотаБиобазовыйBB0044Молекулярно-биологический класс
    Хлорид кальцияБиобазовыйCT1330Водный, промышленный класс
    Пантотенат кальцияSigmaC8731
    Сульфат меди (II)Sigma451657безводный
    D-глюкозаБиобазовыйGB0219Безводный, биотехнологический класс
    Модификация Дульбекко Eagle's MediumLife11995-065с 4,5 г/л глюкозы, 110 мг/л пируата, L-глутамина
    Модификация Dulbecco биомедицинских препаратов Eagle's MediumMP0916429 С глюкозой 4,5 г/л, без L-глуатмина, без инозитола
    EDTABiobasicEB0107Бескислотный, ультрачистый
    этиловый эфирCaledon labs1/10/4700Безводный, реагент класса
    ЭтилформиатSigma112682Реагент класса
    Фетальная бычья сывороткаWisent 080-450Происхождение из США, премиум качество, термоинактивированная
    фетальная бычья сыворотка, DialyzedLife26400044США происхождение
    FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05Сцинтилляционная жидкость для сцинтилляции потока 
    Фолиевая кислотаBiobasicFB0466USP
    grade HEPES буферный растворLife156300801 М раствор
    Инозитол, Myo-[2-3H(N)]Perkin ElmerNET114005MC9:1 этанол в воду
    Инсулин-Трансферрин-Селен-ЭтаноламинLife51500056100x раствор
    Железо(III) хлоридSigma157740Реагент grade
    Laura - Программное обеспечение для сбора и анализа данных хроматографииLabLogic Systems LtdВерсия 4.2.1.18Программное обеспечение для сцинтиллятора потока
    L-глутаминSigmaG7513200  mM, раствор, стерильно-фильтрованный, BioXtra, подходит для клеточной культуры
    Магнияхлорид SigmaM8266Безводный
    сульфат марганцаBiobasicMB0334Моногидрат, ACS класс ACS
    МетанолCaledon labs6701-7-40ВЭЖХ
    Sigma42646640% (v/v)
    МонокалийфосфатБиобазовыйPB0445Безводный, ACS класс
    Никотиновая кислотаБиобазовыйNB0660Реагент
    класса OpenLAB CSD ChemStation AgilentRev. C.01.03 Программное обеспечение для ВЭЖХ
    p-аминобензойная кислота (PABA)BioshopPAB001.100Свободная кислота
    Пенициллин-стрептомицинSigmaP4333100X, жидкая, стабилизированная, стерильно-отфильтрованная, проверенная на клеточной культуре
    Перхлорная кислотаSigma244252реагент ACS, 70%
    PhenoSpher SAX колонкаPhenomenex00G-315-E05 &; m, 80 Å, 250 x 4,6 мм
    Фосфорная кислотаCaledon labs1/29/8425Реагент марки
    Хлорид калияБиобаза PB0440Марка ACS
    Йодид калияБиобазаPB0443Марка ACS
    Пиридоксина гидрохлоридSigmaP9755
    Четвертичный насосAgilentG1311CAgilent 1260 серия infinity
    RiboflavinBioshopRIB333.100Марка USP
    Хлорид натрияBiobasicDB0483Биотехнологический класс
    Молибдат натрияSigma243655
    Термостатированный отсек колонкиAgilentG1316AAgilent 1260 серия бесконечность
    Тиамина гидрохлоридSigmaT4625Марка реагента; Внесите раствор 0,02% (w/v), образует суспензию. смешивать и замораживать аликвоты
    Ultima GoldPerkin Elmer6013321Сцинтилляционный коктейль для жидкого сцинтилляционного подсчета
    Сульфат цинкаБиобазовыйZB2906Гептагидрат, реагент марки
    бета;-RAM 4IN/US системыModel 4Flow scintillator - 500 µ l проточная ячейка; альтернативный сцинтилляторный анализатор радиоматического потока от Perkin Elmer 
    Раствор метиламина класса

    Ссылки

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
    2. Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
    3. Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
    4. Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
    5. Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
    6. Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
    7. Lemmon, M. A. Phosphoinositide recognition domains. Traffic. 4 (4), 201-213 (2003).
    8. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
    9. Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
    10. Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
    11. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
    12. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
    13. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
    14. Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
    15. Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
    16. Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
    17. Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
    18. Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
    19. Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
    20. Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
    21. Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
    22. Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
    23. Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
    24. Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
    25. Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
    26. Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
    27. Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
    28. Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
    29. Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
    30. Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
    31. Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
    32. Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
    33. Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
    34. Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
    35. Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
    36. McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
    37. Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
    38. Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
    39. Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
    40. Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
    41. D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
    42. Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
    43. Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    Phosphoinositide QuantificationHPLC Flow ScintillationTritium LabelingYeast Cell AnalysisPhospholipid ExtractionDeacylation ProcedureRadioactive DetectionGradient ElutionPeak IntegrationData Normalization

    Похожие статьи