Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Поведенческая Анализ на Mechanosensation из MARCM основе Клоны в

9.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53537

⸱

30 декабря 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, College of the Holy Cross, 2School of Medicine, Georgetown University, 3Department of Biochemistry, Giesel School of Medicine, Dartmouth College, 4School of Medicine, Tufts University, 5Transgenomic Inc., 6Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, UMass Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Чтобы идентифицировать новые мутации, влияющие на механочувствительность, мы разработали анализ, который измеряет поведенческую реакцию на тактильную стимуляцию щетины мухи у мутантных клонов, полученных методом MARCM. Комбинация методов позволяет идентифицировать механочувствительные мутации, которые в противном случае были бы смертельными.

Аннотация

Из-за структурной и функциональной гомологии с волосковых клеток млекопитающих внутреннее ухо, нейроны, которые иннервируют дрозофилы внешних органов чувств обеспечивают отличную модель системы для изучения mechanosensation. Этот протокол описывает простой сенсорный поведение в плодовых мушек, которые могут быть использованы для идентификации мутаций, которые мешают mechanosensation. Тактильная стимуляция macrochaete щетины на грудную клетку мухи вызывает рефлекса дл ухода из первой или третьей ноге. Мутации, которые мешают механотрансдукции (таких, как NOMPC), или с другими аспектами рефлекторной дуги, могут ингибировать реакцию ухода. Традиционный экран взрослых поведения пропустил бы мутантов, существенную роль в процессе развития. Вместо этого, этот протокол сочетает в себе сенсорный экран с мозаичным анализа с репрессируемый клеток маркера (MARCM), чтобы только ограниченных областях гомозиготных мутантных клеток, которые будут созданы и отмечен выражession из зеленого флуоресцентного белка (GFP). Тестируя MARCM клонов для аномальных поведенческих реакций, можно экранировать коллекцию летальных мутаций р-элементов для поиска новых генов, вовлеченных в mechanosensation, которые были бы пропущенных более традиционными методами.

Введение

Люди полагаются на способность преобразовывать механические стимулы из окружающей среды, такие как прикосновение, давление, вибрация или звуковые волны, в сенсорную информацию, которая может быть обработана нервной системой, в процессе, называемом механотрансдукцией. Многие из общих механистических особенностей механотрансдукции между человеком и беспозвоночными совпадают1, что делает дрозофилу полезной моделью для изучения молекулярных механизмов механотрансдукции. Drosophila melanogaster содержит два набора специализированных органов чувств (тип I и II), которые способны преобразовывать механические стимулы в потенциалы действия. Механорецепторы I типа имеют нейрон с одним дендритным или сенсорным отростком, окруженный тремя опорными клетками2. К механорецепторам I типа относятся щетинистые механорецепторы, чувствительные к слуху хордотональные органы (орган Джонстона) и колокольчатые сенсиллы, которые передают информацию о взмахах крыльев3. Щетинки, которые покрывают спинную сторону мухи, являются наиболее распространенными и легкодоступными из органов типа I. Подобно внеклеточной среде волосковых клеток, связанной со слухом и равновесием у позвоночных, опорные клетки, окружающие механочувствительные нейроны мух, секретируют эндолимфу с высоким содержанием калия, которая создает необычный градиент концентрации калия1. Механочувствительные нейроны, как млекопитающих, так и мух, используют этот высокий уровень внеклеточного калия для деполяризации клетки. В ответ на механическую стимуляцию щетинок макрощетины по направлению к стенке тела сенсорные нейроны реагируют всплеском потенциалов действия, вызванным деполяризацией калия клеточной мембраны. Сенсорные нейроны дрозофилы, которые иннервируют щетинки, напоминают механочувствительные клетки других организмов, включая волосковые клетки позвоночных, как по структуре, так и по функциям1,5. Доступность внешних органов чувств дрозофилы для экспериментальных манипуляций и обилие генетических методов, доступных исследователям, делают дрозофилу отличной модельной системой для исследования молекулярных основ механоощущения.

У мухи стимуляция одного сенсорного нейрона, который иннервирует щетину, приводит к наблюдаемой поведенческой реакции. Стимуляция различных щетинок вызывает специфические, воспроизводимые поведенческие реакции, в зависимости от щетины, которая стимулируется. При тактильной стимуляции обезглавленные мухи дикого типа проявляют сложный рефлекс груминга, при котором они очищают область вокруг стимулированной щетины с помощью шаблонного набора движений ног5-7. Будучи гомозиготными по известным одногенным мутациям, которыепрепятствуют обучению 7 или координации и локомоторнойактивности5, мухи аномально реагируют на механическую стимуляцию. Таким образом, этот груминг-рефлекс является полезным инструментом для изучения влияния мутаций одного гена на конкретное, воспроизводимое поведение.

Устойчивая поведенческая реакция на стимуляцию одной щетинки макрощетины обладает потенциалом для помощи в идентификации новых генов, участвующих в механотрансдукции. Этот протокол используется для тестирования коллекции мутантных мух на отсутствие поведенческой реакции, указывающей на то, что мутация мешает механоощущениям. В коллекции мутантов, отобранных для скрининга, мутации вызывают летальность до взрослого возраста, и поэтому их невозможно проверить с помощью традиционных скринингов поведения взрослых. Первоначально этот набор летальных p-элементов был объединен с сайтами рекомбинации FRT для тестирования дефектов роста клеток в клонах. Клоны были созданы специально для глаз, потому что взрослые мухи могут выжить в лабораторных условиях без функциональногозрения. Тем не менее, удаление всех механочувствительных ощущений может привести к тому, что взрослые особи будут сильно нарушать координацию или умрут до того, как произойдет эксклозия5. В этом протоколе используется мозаичный подход, чтобы обойти летальность мутаций и обеспечить тестирование на взрослой стадии. Генетический метод, называемый мозаичным анализом с помощью репрессируемого клеточного маркера (MARCM)9, используется для получения гомозиготных мутантных клеток в ограниченном числе органов чувств взрослых мух, в то время как остальная часть организма остается гетерозиготной. Эти мухи MARCM легко доживают до взрослого возраста, но щетинки гомозиготны по летальным генам, представляющим интерес.

MARCM позволяет областям гомозиготных мутантных клеток генерироваться и отмечаться экспрессией зеленого флуоресцентного белка (GFP), в то время как остальная часть организма остается гетерозиготной в этом конкретном локусе и не маркирована9. MARCM сочетает в себе отдельные мутации p-элемента с пятью общими генетическими элементами: GFP под контролем восходящей активирующей последовательности (UAS-GFP), белок-репрессор Gal80 под контролем общего промотора (tub-Gal80), транскрипционный фактор Gal4 под контролем общего промотора (tub-Gal4), фермент рекомбиназы FRT, экспрессируемый через промотор, контролируемый тепловым шоком, и сайт рекомбинации FRT10. Управляя митотической рекомбинацией с помощью рекомбиназы, активированной тепловым шоком, ограниченное число клеток становится гомозиготными по мутации и помечается GFP. Экспрессия GFP подавляется в гетерозиготных клетках присутствием Gal80 на копии хромосомы дикого типа.

Протокол теплового шока для MARCM был оптимизирован для индуцирования рекомбинации во внешних органах чувств щетины мухи, в то время как большая часть организма остается гетерозиготной и, таким образом, не помечена GFP. Мозаичные мушки, созданные с использованием этого протокола, содержали гомозиготные мутации, чаще всего в посталарных или дорсальных центральных щетинках на поверхности нотума.

Мы проверили полезность этой комбинации MARCM и скрининга поведения груминга с известным механочувствительным мутантом, NOMPC. Ионный канал, не обладающий механорецепторным потенциалом С (NOMPC), является важным компонентом механотрансдукционного пути у дрозофил5,11-13. NOMPC принадлежит к суперсемейству переходных рецепторных потенциалов (TRP) катионных каналов5 и удовлетворяет всем критериям, чтобы квалифицироваться как механочувствительный канал у дрозофил14,15: 1) NOMPC экспрессируется в инфузориях сенсорных нейронов 1 типа дрозофилы 13,16-18, 2) нулевые личинки NOMPC не имеют электрического отклика на тактильную стимуляцию13, 3) эктопическая экспрессия NOMPC в сенсорных нечувствительных клетках может индуцировать чувствительность к механической стимуляции13, 4) гетерологичная экспрессия NOMPC в клетках Шнайдера 2 приводит к механочувствительному каналу13, и 5) взрослые мутанты NOMPC демонстрируют дефекты в своей реакции на механическую стимуляцию5. Учитывая эти данные, мы предположили, что мутантные клоны NOMPC будут демонстрировать измененную или подавленную реакцию груминга в ответ на механическую стимуляцию щетины.

MARCM-акция, содержащая мутацию NOMPC, была разработана для использования в эксперименте по проверке принципа груминга. Мозаичных мушек стимулировали в щетинках макрохет, содержащих гомозиготные мутантные клетки NOMPC. Мы ожидали ингибирования реакции груминга после стимуляции щетины макрощетины. Мы обнаружили, что только 2 из 14 протестированных мутантных щетинистых мух дали один ответ на повторную стимуляцию; Большинство из них не реагировали на стимуляцию гомозиготной мутантной щетиной. Подтвердив, что этот поведенческий анализ на основе MARCM вызывает аномальный рефлекс груминга у известного механочувствительного мозаичного мутанта, этот метод может быть использован для скрининга дополнительных механочувствительных мутаций.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Кресты для генерации MARCM Мухи

  1. Поддержание мух на кукурузной муки мелассы средах (6,5 г / л агара; 23,5 г / л дрожжевого, 60 г / л кукурузной муки, 60 мл / л мелассы; 4 мл / л смеси кислот; 0,13% Tegosept) или стандартного Drosophila средах при 22 градусах Цельсия в 12-ч цикла свет / темнота.
    Примечание: Ниже, чем стандартная температура используется для поддержания MARCM-акции здоровым. Это расширяет с развитием время между яйцом и зрелом возрасте до 14 дней.
  2. Использование девственных самок (примерно 1 - 8 дней) от MARCM-готов складе, содержащий необходимые генетические элементы (GFP под контролем вышестоящего активирующий последовательности (UAS-GFP), репрессор белка Gal80, фактора транскрипции Gal4, в теплового шока приводом рекомбиназа, и рекомбинация сайт FRT).
    Примечание: Наша MARCM Готовые запасы содержать следующие генотипы: elavGal4, БАС-CD8-GFP, HS-flipase; FRT40A, tubGal80 / суо; tubGal4 / TM3Sb.
    Примечание: Удельный FRT-сайт будет зависеть от локализации мутациив геноме. Например, FRT40A используется для проверки мутации на левом плече хромосомы 2, такие как NOMPC (см 10 для более подробной информации по протоколам MARCM).
  3. Кросс-MARCM готов девственные самок и самцов, которые содержат мутацию интерес и соответствующий FRT-сайт (например, W-; NOMPC3, FRT40A / суо; + / +). Для управления для эффективного индукции MARCM, установить второй крест с использованием самцов мух, содержащие один и тот же сайт FRT, но без мутации. Используйте приблизительное соотношение 5: 1 самок самец в крестах.

2. Временный яйцо Прокладка

  1. После выдерживания мухи сцепиться в течение по крайней мере одну ночь, переместить взрослых в новые флаконы свежей средой. Разрешить мух откладывают яйца в темном помещении в течение примерно 4 часов, прежде чем снова передачи кресты в новых флаконах. Обратите внимание на время начала и окончания того периода откладки яиц.
    Примечание: короткие интервалы являются приемлемыми, когда, как представляется, большое количество яиц на СМИ до конца 4-часовой intervaл.
    1. Хранить флаконы с достаточным количеством яиц (примерно более 20) и хранить в 12-ч цикла свет / темнота в 22 градусов по Цельсию, что тепловому шоку позже.
      Примечание: Бутылочки с низким количеством яиц на СМИ (менее примерно 20) вряд ли дадут достаточное количество взрослых мух для поведенческого тестирования и в интересах эффективности рекомендуется не сохраняются для дальнейшего тестирования.
      Примечание: Наши мухи поднял с освещением в 8 утра до 8 вечера. Мы нашли вечернее время точки привести к более высокой плотности яиц, поэтому обычно выполнять приурочен кресты между 4 - 8 часов и 8 PM-полночь. Мухи откладывают яйца на РТ в темном шкафу, а затем возвращаются в инкубатор на следующий день так, чтобы не нарушить регулярный цикл света-темноты в инкубаторе.

3. Выполните тепловой шок, чтобы побудить митотической рекомбинации

  1. Примерно 85 - 100 ч после откладки яиц, место vМОГВ в водяной бане при 37 ° С в течение 1 часа. Убедитесь, что уровень воды достигает высоты над СМИ в пузырьках, но не в полной мере погрузиться флаконов для предотвращения личинок от утопления.
  2. Удалить флаконы из водяной бани и позволяют восстановительный период 1 час при комнатной температуре.
  3. Место флаконов обратно в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 1 часа.
  4. Удалить из флаконов на водяной бане и в магазине инкубатора на 12-часовой свет / темнота цикла при 22 градусах Цельсия до вылупления.

4. Подготовка к поведенческим тестированием

  1. После вылупления, обезболить мух на льду. Выберите мух генотипов, которые содержат все генетические элементы для MARCM и указать GFP выражение маркировку клонов, вероятно, будет наблюдаться на основе наблюдаемых маркеров фенотипа, используемых в материнских запасов. Обезглавьте мух иридектомия ножницами.
    Примечание: Например, мы выбрали для мух без генетических маркеров суо (фигурные крылья) и Sb (солома щетины), чтобы идентифицируетFY мухи, которые содержат все элементы, необходимые генетические создать мозаичные регионы отмечены GFP.
    Примечание: обезглавливание необходимо, чтобы предотвратить взрослых от того, когда стимулируются отлета.
  2. Поместите обезглавленные мухи в закрытой влажной среде и позволяют примерно 10 - 20 ч восстановления. Только использование летит, что право сами, когда возмущенные для дальнейшего тестирования. Тест летит в течение 30 часов обезглавливания.

5. Поведенческие тестирование

  1. Наблюдая обезглавленные мухи под флуоресцентным микроскопом рассекает, определить гомозиготных клонов, отмеченные GFP в щетины внешних органов чувств. Запишите имя щетины и левую или правую сторону. Для устранения любого потенциального смещения, член лаборатории выполнении стимуляции щетины должна быть слепой к генотипу щетины дикого типа или мутанта.
  2. Вызвать холить рефлекс отклонения GFP пометкой щетины к телу летучей с жесткой волос или тонких щипцов и наблюдать ног Response. Дайте оценку от одного до мух, которые поднимают их ногу в ответ на стимуляцию щетины и ноль баллов в мух, которые не двигаются ноги.
    Примечание: Предыдущие исследования 6,7 охарактеризовали ответ ноги, что, вызванную стимулирования особую щетину. Это включает в себя ногу, которая реагирует на каждой щетинки, а доля мух, которые реагируют на стимуляцию этой конкретной щетины. Мы только забил движений ноги, что мы ожидали, чтобы ответить на основе классификации Vandervorst в 6.
  3. Провести пять испытаний расположенные 2 мин друг от друга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успех этого протокола в значительной степени зависит от общего выхода тестируемых мух, эффективность теплового шока, чтобы вызвать митотической рекомбинации, а также возможность получить надежное поведенческую реакцию в мух, стимулированных в 2-минутными интервалами. Учитывая, что, по оценкам, 12,5% эмбрионов содержат необходимые элементы MARCM и оценкам 16,67% от взрослых, которые eclose есть потенциал для выражения GFP, важно, чтобы получить большое количество яиц в течение приурочен л...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол использует взрослая поведения анализа для выявления мутаций, которые влияют на mechanosensation у дрозофилы. Потому что коллекция мутантов содержит летальные мутации р-элементов, которые могли бы препятствовать скринингу, как взрослых, этот протокол использует сложную техники генной впервые описал Ли и Луо (1999) и подробно, как протокол Ву и Ло, (2006), чтобы обойти взрослых летальность. MARCM вызывает митотическую рекомбинацию между гомологичными хромосомами, чтобы генерировать клоновых регионы ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить фондовый центр Блумингтон, Ликун Ло, Чарльз Цукер, и Лили, и йух нун янв за щедрую обмена акций лету и следующая за финансирование: Somas-УРМ (в JD и SW), бакалавр Форд факультет летней стипендий (для SW), BD корпорация Лето исследовательский грант (для CL и DL), то Рене и Энтони М. Марлона, MD '63 Летний исследовательский грант (для DL) Джеймс С. '75 и Джейн Colihan Лето исследовательский грант (К) через Выпускники / Родитель Летний исследовательский фонд колледжа Святого Креста и Странский Фонд Лето исследовательский грант (для ТО). Особая благодарность кафедре биологии и деканат в колледже Святого Креста для поддержки всей работы в лаборатории.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пивные дрожжи (25 фунтов)MP Biomedicals ICN90331225 Корм для мух
Кукуруза (25 фунтов)MP Biomedicals ICN90141125 Корм для мух
Агар (1 фунт)MoorAgar Inc.41004Fly Food
Tegosept (5 кг)Genesee20-259Fly Food
Патока (1 галлон)Sugarmill Brand - Thomsen Food Service0 2625Fly Food
Пропионовая кислотаFisherA258-500Fly Food
Фосфорная кислотаFisherA260-500
Флаконы с дрозофилой Fly Food, узкие (PS)Genesee32-109Культуры мух
Бутылка с квадратным дном на 6 унций (PP)Genesee32-130Fly Cultures
Flugs - Пластиковые бутылки для мухGenesee49-100Fly Cultures
Вискозные шарики, большиеGenesee51-100Fly Cultures
Дрозо-наполнитель, узкийGenesee59-168Подготовка пищи
для мух Дрозо-наполнитель, бутылкиGenesee59-170Fly Food Приготовление
8A-C / лабораторная мешалка с зубчатым приводом и креплением c-образного зажима  1/15 л.с., 700 об/мин регулируемая скорость, 115 В, 50/60 ГцКливлендский миксер8A-CПриготовление пищи от мух
Чайник с водяной рубашкой Приготовлениепищи от мух
Суточная камера ростаForma ScientificРегулируемая температурой и циклом света/темноты
Водяная баняVWRДля нагрева шоковые
микроножницы Инструменты для изобразительной науки  15000-08Для снятия головок
Флуросцентный препарирующий микроскопZeissSteREO Discovery V8 С кубическим фильтром GFP (KSC295-814D)
Fluroscence Light SourceZeissX-Cite 120Волоконно-оптическая светотрубка делает это простым в настройке 
Камера для прицелаZeissAxioCam ICc1
Программное обеспечение для сбора изображенийZeiss
Ведродля холодной антезии
Самодельный поддондля холодной антезии обезглавливания
Пластиковые ящикидля восстановления обезглавленных мух во влажной среде
для льда

Ссылки

  1. Grünert, U., Gnatzy, W. K+ and Ca++ in the receptor lymph of arthropod cuticular mechanoreceptors. J Comp Physiol A. 161, 329-333 (1987).
  2. Kernan, M. J. Mechanotransduction and auditory transduction in Drosophila. Pflugers Arch. 454, 703-720 (2007).
  3. Gillespie, P. G., Walker, R. G. Molecular basis of mechanosensory transduction. Nature. 413, 194-202 (2001).
  4. Corfas, G., Dudai, Y. Adaptation and fatigue of a mechanosensory neuron in wild-type Drosophila and in memory mutants. J Neurosci. 10, 491-499 (1990).
  5. Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12, 1195-1206 (1994).
  6. Vandervorst, P., Ghysen, A. Genetic control of sensory connections in Drosophila. Nature. 286, 65-67 (1980).
  7. Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9, 56-62 (1989).
  8. Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3, e59(2005).
  9. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  10. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nature Protocols. 1, 2583-2589 (2006).
  11. Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila. J Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).
  12. Walker, R. G., Willingham, A. T., Zuker, C. S. A Drosophila mechanosensory transduction channel. Science. 287, 2229-2234 (2000).
  13. Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493, 221-225 (2013).
  14. Arnadottir, J., Chalfie, M. Eukaryotic Mechanosensitive Channels. Annual Review of Biophysics. 39, 111-137 (2010).
  15. Christensen, A. P., Corey, D. P. TRP channels in mechanosensation: direct or indirect activation? Nature Reviews Neuroscience. 8, 510-521 (2007).
  16. Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The Role of the TRP Channel NompC in Drosophila Larval and Adult Locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
  17. Lee, J., Moon, S., Cha, Y., Chung, Y. D. Drosophila TRPN(=NOMPC) channel localizes to the distal end of mechanosensory cilia. PLoS One. 5, e11012(2010).
  18. Liang, X., Madrid, J., Saleh, H. S., Howard, J. NOMPC, a Member of the TRP Channel Family, Localizes to the Tubular Body and Distal Cilium of Drosophila Campaniform and Chordotonal Receptor Cells. Cytoskeleton. 68, 1-7 (2011).
  19. de Vries, S. E., Clandinin, T. R. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Curr Biol. 22, 353-362 (2012).
  20. Jarman, A. P. Studies of mechanosensation using the fly. Hum Mol Genet. 11, 1215-1218 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

клоны MARCMанализ механосенсорного восприятиярефлекс грумингамозаичный анализстимуляция щетинокмаркировка GFPповеденческий скринингмутация NOMpcсайты FRT
Поведенческая Анализ на Mechanosensation из MARCM основе Клоны в
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.