Методическая статья

Соленость-зависимой Токсичность Анализ серебра наноколлоидов Использование Оризии яйца

DOI:

10.3791/53550

⸱

18 марта 2016 г.

 , 
1Graduate School of Life Sciences, Toyo University, 2Research Center for Life and Environmental Sciences, Toyo University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбриональные стадии наиболее восприимчивы к ксенобиотикам. Хотя химическая токсичность зависит от солености, не существует метода проверки зависимости солености токсичности для водных организмов. В данной статье мы описываем новый и высокопроизводительный метод определения зависимости токсичности для водных эмбрионов от солености.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Соленость является важной характеристикой водной среды. Для водных организмов она определяет среду обитания пресной воды, солоноватой воды и морской воды. Испытания токсичности химических веществ и оценки их экологических рисков для водных организмов часто выполняются в пресной воде, но токсичность химических веществ для водных организмов зависит от рН, температуры и солености. Там не существует метода, однако, для проверки солености зависимость токсичности для водных организмов. Здесь мы использовали Оризии (Oryzias latipes) , потому что они могут приспособиться к пресной воде, соленой воды и морской воды. Различные концентрации эмбриона выращивания среды (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x и 30x) были использованы для проверки токсичности частиц серебра nanocolloidal (ВНС) в Оризии яйца (1x ERM и 30x ERM имеют осмотического давления, эквивалентной к пресной и соленой воде, соответственно). В шести хорошо пластмассовых плит, 15 оризии яйца в трех экземплярах подвергались ВНС на 10 мг / л &# 8722; 1 в различных концентрациях ERM при рН 7 и 25 ° C в темноте.

Мы использовали рассекает микроскоп и микрометр для измерения частоты сердечных сокращений на 15 сек и глаз диаметра на 6-й день и всю длину тела личинок на вылупления день (раздел 4). Эмбрионы не наблюдалось до вылупления или 14-й день; Затем мы подсчитали штриховки скорость каждый день в течение 14 дней (раздел 4). Чтобы увидеть накопление серебра в эмбрионах, мы использовали индуктивно связанной плазмы масс-спектрометрии для измерения концентрации серебра тестовых растворов (раздел 5) и dechorionated эмбрионов (раздел 6) .The токсичность ВНС до оризии эмбрионов, очевидно, увеличивается с увеличением солености. Этот новый метод позволяет проверить токсичность химических веществ в различных соленостью.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С момента создания Организации экономического сотрудничества и принципами клинических испытаний развития (ОЭСР) для тестирования химических веществ в 1979 году, 38 руководящих принципов тестирования были опубликованы в разделе 2 руководящих принципов, воздействие на биотические системы 1. Все водные организмы тестируемых были из пресноводных сред обитания, а именно пресноводных растений; водоросли; беспозвоночные, такие как дафнии и хирономид; и рыбы, такие как оризии, данио и радужной форели. По сравнению с соленой водой окружающей среды, пресноводные среды более непосредственно влияют человека экономической и промышленной деятельности. Таким образом, пресноводные среды стали приоритетными для тестирования, потому что они подвергаются более высокому риску от загрязнения.

В прибрежных районах, в том числе лиманов, соленость колеблется от солоноватой воды и морской воды условий, и эти участки часто загрязнены промышленной деятельности 2. Прибрежные районы и связанные с ними водно-болотные угодья характеризуются чIGH экологическое биоразнообразие и продуктивность. Поэтому прибрежные экосистемы должны быть защищены от химического загрязнения. Тем не менее, было ограничено экотоксикологическую исследований в солоноватой воде сред обитания и морской воды.

Sakaizumi 3 изучали токсичные взаимодействия между метилртути и солености в японских яиц оризии и обнаружили , что увеличение осмотического давления исследуемого раствора повышается токсичность метилртути. . Sumitani и др 4 использовали Оризии яйца для исследования токсичности свалок; они обнаружили, что осмотическое эквивалентность фильтрате к яйцам было ключом к индукции аномалий во время эмбриогенеза. Кроме того, Kashiwada 5 сообщалось , что пластиковые наночастицы (39,4 нм в диаметре) легко проникшего через оризия яйца хориона при солоноватой условиях (15x эмбрион выращивания среды (ERM)).

Типичная маленькая модель рыбы, японские оризия (Oryzias latipes ) используется в фундаментальной биологии и экотоксикологии 6. Японские оризия могут жить в условиях , начиная от пресной воды в морскую воду из - за их высокоразвитых хлоридных клеток 7. Они, следовательно, могут быть полезны для тестирования в условиях с широким диапазоном соленостью.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Японские оризия, используемые в данном исследовании, были обработаны гуманно в соответствии с институциональными рекомендациями Тойо университета, с учетом для облегчения бедствия и дискомфорта.

1. Серебряный наноколлоиды (ВНС)

  1. Покупка очищенные вторые национальные (20 мг / л -1, 99,99% чистоты, частицы со средним диаметром около 28,4 ± 8,5 нм , взвешенных в дистиллированной воде).
  2. Проверка чистоты и концентрации серебра с индуктивно связанной плазмой масс - спектрометрии (МС-ИСП) анализ в соответствии с руководством по эксплуатации 8. Способ предварительной обработки для ICP-MS анализа описана в разделе 7.

2. Подготовка SNC Solutions (Смеси Silver коллоидов и Ag +) с различными соленостью

  1. Подготовка 60 × ERM , состоящий из 60 г NaCl, 1,8 г KCl, 2,4 г CaCl 2 · 2H 2 O и 9,78 г MgSO 4 · 7H 2 O в 1 л Ultrapure воды; доведения рН до 7,0 с помощью 1,25% раствора NaHCO 3 в сверхчистой воде.
  2. Перемешать раствор ERM при 25 ° С в течение ночи.
  3. Смешайте с разведенным вторые национальные ERM. Приготовьте 40 мл каждого SNC-ERM смешанного раствора. Конечная концентрация составляет 10 мг / л -1 ВНС в различных концентрациях ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, или 30x).
  4. Регулировка рН SNC-ERM смешанного раствора до 7,0 с помощью 0,625% NaHCO 3 в сверхчистой воде. регулирование рН очень важно при приготовлении раствора SNC, так как Ag + высвобождение облегчается кислой среды 9.
  5. Используйте AgNO 3 в качестве эталонного соединения для ВНС.
    1. Смешайте AgNO 3 с разбавленным ERM. Приготовьте 40 мл AgNO 3 -ERM смешанном растворе при концентрации AgNO 3 15.7 мг / л -1 (10 мг / л -1 серебра) в различных концентрациях ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, или 30x) ,
      Примечание: Для исследования токсичности серебра коллоидный, AgNO 3Решение, которое является источником растворимого серебра, используют в качестве эталонного соединения для ВНС, которые представляют собой смесь из серебра коллоидов и растворимого серебра.

3. Оризии Культура и яйца Уборка урожая

  1. Получить Оризии (О. latipes) (оранжево-красный штамм) (60 самцов и 60 самок).
  2. Культура оризия как группы (20 мужчин и 20 женщин в качестве одной группы) в 1x ERM в 3 л цистернах с использованием проточного системы культивирования Оризии.
    1. Культура при следующих условиях:
      Диапазон рН культуральной среды: 6,2 до 6,5
      свет: темно цикл: 16: 8 ч
      Температура культуральной среды: 24 ± 0,5 ° С
      Осмотическое давление питательной среды: 257 мОсм
  3. Поток Оризии на Артемия Салина науплиев в 10:00 (раз в день) и кормить искусственную сухой рыбы диету в 09:00, 11:00, 13:00, 15:00, 17:00 (пять раз в день).
    1. Получить А. заИпа науплии.
    2. Приготовьте 5 л 3,0% -ного раствора соли в пластиковый стакан.
    3. Добавьте 30 г артемии яйца в растворе соли в стакане.
    4. Инкубировать яйца при температуре 25 ° С в течение 48 ч при барботировании (4 л / мин -1) при помощи аэрации насоса.
    5. Через 48 ч остановить бульканье.
    6. Дайте раствору отстояться в течение от 5 до 10 мин , чтобы отделить вылупившихся А. салина Науплиусы (нижняя часть раствора) из Незаштрихованная яиц и яичной скорлупы (верхняя часть раствора).
    7. Удалите верхний слой раствора декантацией.
    8. Фильтр нижнюю часть раствора через сито с отверстиями 283 мкм, и собирают науплии, которые проходят через на сетку с отверстиями 198 мкм.
    9. Поток науплии к оризии в течение 6 часов.
  4. После того, как самка оризия породили, удалить внешние кластеры яйца аккуратно из тел самок »или собирать яйца из нижней части аквариума с помощью смвсе чистые (нетто размер 5 см х 5 см, размер отверстия 0,2 мм х 0,2 мм).
  5. Ополосните яйцо кластера проточной водопроводной водой в течение 5 сек.
  6. Добавьте все промытые кластеров яиц в растворе 30х ERM.
  7. Удалить кластеры из раствора через 1 мин и поместите кластеры яичные между сухие бумажные полотенца и рулон мягко.
  8. Положите яйца обратно в 30x ERM.
  9. Выберите оплодотворенную икру под рассекает микроскопом.
  10. Местом 810 яиц в 1x ERM в шесть-луночных пластиковых пластин с помощью щипцов.
  11. Инкубировать яйца при температуре 25 ± 0,1 ° С в термостате до стадии развития 21. (Стадии развития этих оризии эмбрионов были определены из работы Iwamatsu 10.)
  12. Выберите из инкубационных яиц на стадии развития 21 под рассекает микроскопом.
  13. Полоскание выбранные яйца с 1x ERM.
  14. Тема промытых яйца экспериментов по воздействию (раздел 4).

4. Токсичность Испытание ВНС или AgNO 3 При различных ERM соленостью

  1. Промыть Оризии яйца (этап 21) три раза с испытуемым раствором [ВНС (10 мг / л -1) или AgNO 3 (15.7 мг / л -1 , как 10 мг / л -1 серебра) при каждой концентрации ERM (1x, 5x , 10x, 15x, 20x или 30x) при рН 7]. В качестве контроля используют яйца в 1 × до 30 × ERM при рН 7.
  2. Добавьте 15 промытые яйца до 5 мл каждого испытуемого раствора в шести-луночных пластиковых пластин. (Выполните экспериментов по воздействию три раза для SNC или AgNO 3 токсичность тестирование с использованием каждого испытуемого раствора.)
  3. Оберните пластин в алюминиевую фольгу.
  4. Инкубируйте обернутые пластин при 25 ° С в темноте до вылупления или в течение 14 дней.
  5. Соблюдайте экспонированных яйца каждые 24 ч для биологических изменений и мертвых яиц (рисунки 1 и 2).
  6. Обмен испытуемых растворов каждые 24 ч.
  7. Выполните наблюдения следующим образом.
    1. На 6-й день воздействия, подсчитать частоту сердечных сокращений (за 15 сек) оF медака эмбрионы под микроскопом рассекает с помощью секундомера (фиг.3А).
    2. На 6 -й день воздействия, измерить размер глаз (диаметр) оризии эмбрионов под микроскопом рассекает с помощью микрометра (фигура 3В).
    3. На инкубационных день, измеряют полные длины тела личинок под препаративным микроскопом с помощью микрометра (рис 3в).
    4. Подсчитать общее количество выставленных яиц , которые люк в течение 14 дней (Рис 3).

5. Выделение серебра из растворимой SNC Solution и Silver Analysis

  1. Изолировать растворимого серебра из каждого раствора SNC (смесь серебра коллоидов и растворимого серебра) с помощью фильтрации через 3 кДа мембранный фильтр при 14000 х г и 4 ° С в течение 10 мин. С помощью 3 кДа мембранного фильтра для выделения растворимого серебра из ВНС, так как сообщенное средний диаметр агрегированных ВНС в 1x ERM составляет 67,8 нм 11 аго , что из Ag + составляет 0,162 нм 12; 3 кДа мембрана исключает частицы диаметром 2 нм или более 13.
  2. Измерьте концентрацию серебра в 50 мкл отфильтрованного раствора (= растворимая концентрации серебра) с помощью ICP-MS анализа (рис 3e) в соответствии с инструкцией по эксплуатации ICP-MS 8. Способ предварительной обработки для ИСП-МС анализа описана в разделе 7.

6. Измерение Серебряного биоаккумуляции в оризии Эмбрионы

  1. Expose Оризии яйца (стадия 21) ВНС или AgNO 3 , как описано в разделе 4.
  2. На 6 -й день воздействия, удалить хориона из яйца (то есть, dechorion) с использованием Оризии инкубационных фермента в соответствии с протоколом , описанным в оризии книге 14.
  3. Измерьте концентрацию серебра в dechorioned яиц путем анализа ICP-MS в соответствии с ИСП-МС Руководство по эксплуатации 8 (рис 3f). предварительная обработкаметод ICP-MS анализа описана в разделе 7.

7. Измерение серебра концентрации с помощью ICP-MS анализа

  1. Добавить примеры [50 мкл раствора серебра (для проверки концентрации серебра; раздел 1); три dechorionated эмбрионов (раздел 5); или 50 мкл отфильтрованного раствора (раздел 5)] в стакане тефлоновой 50 мл.
  2. Добавить 2,0 мл сверхчистой азотной кислоты в химический стакан емкостью 50 мл.
  3. Нагреть смесь на горячей плите при 110 ° С до тех пор, как раз, прежде чем она высыхает (около 3 ч).
  4. Для того, чтобы полностью растворить органическое вещество, добавьте 2,0 мл сверхчистой азотной кислоты и 0,5 мл перекиси водорода в стакан.
  5. Нагреть смесь снова на горячей плите, пока незадолго до ее высыхания (около 3 ч).
  6. Остаток растворяют в 4 мл 1,0% раствора сверхчистой азотной кислоты.
  7. Передача 4 мл раствора в пробирку для центрифугирования.
  8. Повторить от 7,6 до 7,7 раза (в общей сложности три раза). Конечный объем составляет 12,0мл.
  9. Измеряют концентрацию серебра в образце (растворенного в 1,0% сверхчистой азотной кислоты) , с помощью анализа ICP-MS в соответствии с руководством по эксплуатации 8.
    1. Используйте внутренний и внешний стандартное решение (см список материалов) для количественного определения концентрации серебра. Внутреннее и внешнее стандартное решение аккредитована Американской ассоциации по аккредитации лабораторий (A2LA). Пределы обнаружения серебра были 0,0018 нг / мл - 1 (раствор) и 0,016 нг мг-вес -1 (эмбриона тела).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Влияние солености на токсичность SNC была очень очевидна: индукция уродства или смерти была соленость зависимых (1 и 2). Мы измеряли фенотипических биомаркеров (частота сердечных сокращений, размер глаз, полная длина тела и скорость вылупления) в SNC (10 мг / л -1) -exposed эмбрионов. Эти фенотипические биомаркеры выявили соленость зависящих от SNC токсичности.

Частота сердечных сок...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оризии является пресноводная рыба, которая является весьма терпимы к морской воде; он не очень хорошо известно , что первоначальная естественная среда обитания этой рыбы была соленой воды у берегов Японии 6. Следовательно, оризии рыбы имеют хорошо развитые хлоридные клетки 7. Это уникальное свойство предоставляет ученым новый способ проверки токсичности химических веществ в окружающую среду в зависимости от солености (пресная вода к морской воде) с использованием только одного вида рыбы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны г-же Каори Симидзу и г-ну Масаки Такасу из Высшей школы наук о жизни Университета Тойо за их техническую поддержку. Этот проект был поддержан исследовательскими грантами от Специального исследовательского фонда и Исследовательского центра био-наноэлектроники Университета Тойо (Словакия); Фондом содействия научным исследованиям Корпорации содействия и взаимопомощи частным школам Японии (в Словакия); Новый проектный фонд оценки рисков, от Министерства экономики, торговли и промышленности (ЮК); грантом в помощь сложным поисковым исследованиям (премия 23651028 SK); грантом на научные исследования (B) и (C) (присуждение 23310026 и 26340030 SK); а также грантом на проект «База стратегических исследований для частных университетов» (премия S1411016 SK) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Наноколлоиды серебраUtopia Silver Supplements
NaClNacalai Tesque, Inc.31319-45Для изготовления ERM
KClNacalai Tesque, Inc.28513-85Для изготовления ERM
CaCl2· 2H2ONacalai Tesque, Inc.06730-15Для изготовления ERM
MgSO4· 7H2ONacalai Tesque, Inc.21002-85Для изготовления ERM
NaHCO3 Накалай Теске, Инк.31212-25Для изготовления ERM
AgNO3Nacalai Tesque, Inc.31018-72
pH-метрHORIBA, Ltd.F-51S
BalanceMettler-Toledo International Inc.MS204S
medaka (Oryzias latipes) оранжево-красный штаммНациональный институт экологических исследований
medaka проточная система культивированияMeito Suien Co.MEITOsystem
Artemia salina nauplii eggsJapan pet design Co. Ltd4975677033759
аэрационный насосJapan pet design Co. Ltdбесшумный w300
Otohime личинка β-1Marubeni Nissin Feed Co. LtdOtohime личинка β-1Искусственный сухой рацион рыб
препарирующий микроскопLeica microsystemsM165FC
микрометрФудзикогаку, ООО
инкубаторNksystemTG-180-5LB
шейкерELMI Ltd.Aizkraukles 21-136
6-луночные пластиковые пластиныGreiner CELLSTARM8562-100EA
алюминиевая фольгаAS ONE Co.6-713-02
секундомерDRETEC Co. Ltd.SW-111YE
3 кДа мембранный фильтрEMD Millipore Corporation0,5 мл центробежный фильтр
50 мл тефлоновый стаканAS ONE Co.
Custom claritas standardSPEXertificateZSTC-538Для внутреннего стандарта
Custom claritas standardSPEXertificateZSTC-622Для внешнего стандарта
сверхчистой азотной кислотыKanto Chemical Co.28163-5B
перекись водорода Канто Кемикал Ко.18084-1Bдля атомно-абсорбционной спектрометрии
ICP-MSThermo ScientificThermo Scientific X Series 2 
Плита для подогреваTiger Co.CRC-A300
1045002333431097

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , OECD. Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761 (2015).
  2. National Coastal Condition Report. , Environmental Protection Agency, Office of Water and Office of Research and Development. Washington, DC. (2001).
  3. Sakaizumi, M. Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes. J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).
  4. Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites. J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).
  5. Kashiwada, S. Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes). EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).
  6. Iwamatsu, T. The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , University Education Press. Japan. (2006).
  7. Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes. Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).
  8. XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , Thermo Fisher Scientific Inc.. Available from: http://202.127.146.37/eWebEditor/uploadfile/20130314161434190.pdf (2007).
  9. Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions. ES & T. 46 (11), 6278-6287 (2012).
  10. Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).
  11. Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos. Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).
  12. Shannon, R. D. Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides. Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).
  13. Pore size chart. , Spectrum Laboratories, Inc.. Available from: http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html (2015).
  14. Wakamatsu, Y. Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , National BioResource Project (NBRP) Medaka. Available from: [cited 2015] https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи