Методическая статья

Оценка Planar-Cell-полярности фенотипов в цилиопатии Mouse Mutant улитки

DOI:

10.3791/53559

⸱

21 февраля 2016 г.

1Cell and Matrix Biology, Institute of Zoology, Johannes Gutenberg-Universität Mainz

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первичные реснички влияют на различные сигнальные пути. Улитка млекопитающих идеально подходит для изучения передачи сигналов о полярности планарных клеток (PCP). Дисфункция ресничек влияет на разрастание улитки, клеточный рисунок и ориентацию волосковых клеток, показания PCP. Наша цель состоит в том, чтобы проанализировать передачу сигналов PCP в улитке мышей с помощью фенотипического анализа, иммуногистохимии и сканирующей электронной микроскопии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние годы первичные реснички стали ключевыми регуляторами развития и заболевания, влияя на многочисленные сигнальные пути. Одним из самых ранних сигнальных путей, связанных с цилиарной функцией, был неканонический сигнальный путь Wnt, также называемый сигнализацией планарной клеточной полярности (PCP). Одним из лучших мест для изучения эффектов передачи сигналов планарной полярности (PCP) во время развития позвоночных является улитка млекопитающих. Нарушение передачи сигналов PCP в улитке мыши нарушает рост улитки, клеточный рисунок и ориентацию волосковых клеток, на которые влияет дисфункция ресничек. Целью данного протокола является описание анализа передачи сигналов PCP в развивающейся улитке млекопитающих с помощью фенотипического анализа, иммуногистохимии и сканирующей электронной микроскопии. Дефекты конвергенции и разгибания проявляются в виде укорочения кохлеарного протока и/или изменений в клеточном структуре, которые могут быть количественно оценены после вскрытия у развивающихся мутантов мышей. Изменения ориентации стереоцилиарного пучка и длины или положения киноцилий можно наблюдать и количественно оценивать с помощью иммунофлуоресценции или сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Более глубокое понимание роли цилиарных белков в клеточных сигнальных путях и других биологических явлениях имеет решающее значение для нашего понимания клеточной биологии и биологии развития, а также для разработки целевых стратегий лечения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первичные реснички длинные микротрубочки основе придатки, которые простираются от поверхности большинства клеток млекопитающих. Первичная реснички часто путают с подвижных ресничек, из которых всегда много на одну ячейку, и цель которого заключается в переходе жидкость через поверхности мембран. Первичная реснички, напротив, принять сенсорные роли и, следовательно, также называют сенсорной ресничек. После давно забыли, это органеллы недавно был 'вновь' в результате его ассоциации с множеством генетических заболеваний человека 1. В идеале позиционируется как сигнальной органеллы, первичная ресничка было показано, чтобы регулировать многочисленные сигнальные пути, многие из которых имеют важное значение не только в тканевого гомеостаза и болезни, но также и во время развития 2.

Одним из первых сигнальных путей показано, что связано с ресничек дисфункции был неканонической сигнализации Wnt путь, известный также как полярность плоская клеток (PCP) пути > 3. Это сигнальный каскад первоначально определены у дрозофилы, имеет решающее значение для эмбриогенеза; в частности, для конвергенции и расширения процессов и для правильной ориентации клеток в плоскости эпителия 4. Последовательное сигнализация основного набора регуляторных белков переводит направленные сигналы, которые, в конечном счете привести к цитоскелета перестроек и приводят к согласованной поляризации эпителиальных клеток в плоскости 5. Процесс сближения и расширения абсолютно необходим для канала улитки, чтобы удлинить и для правильного клеточного паттерна 6. Как это регулируется с помощью активации PCP пути, один из самых ярких фенотипов улитки PCP мутантов является сокращенной канал улитки с неорганизованной сенсорного эпителия 7. Аналогичным образом, мутантные мыши, у которых нет реснички, также демонстрируют такую ​​конвергенции и расширения фенотип 8,9, хотя как именно это регулируется еще предстоит выяснить.

ve_content "> Поскольку конвергентные и расширение процессов являются критическими для выроста канала улитки и сотовой паттерна сенсорного эпителия внутри канала улитки, развивающийся улитка является идеальным органом, в котором для изучения сигналов PCP во время развития позвоночных. Орган Корти, термин, данный специализированного сенсорного эпителия, что линии канал улитки, состоит из несенсорных опорных клеток и механосенсорных волосковых клеток, которые должны быть равномерно ориентированных на улитке функционировать 10. в механосенсорные волосковые клетки так называемый из-за stereociliary пучки, которые простираются от кутикулы пластины (апикальной поверхности) каждой сенсорной волосковых клеток 11. Они действуют как первичных преобразователей в mechanosensation и несмотря на их номенклатуре в качестве стереоцилиях, фактически состоит из модифицированного актиновых филаментов на основе микроворсинок. Внутри каждого шеврона-образной волос расслоение, три ряда стереоцилиях организованы в очень упорядоченной и регулярной годовыхttern в лестница манере. Реальный микротрубочек на основе реснички, называемые киноцилии, которые необходимы для развития и ориентации stereociliary пучков 12. По каждой ячейке волос, одна киноцилия физически подключен к стереоцилий расслоения, расположенный в центре рядом с самой высокой строки стереоцилий. Точная функция киноцилии неясно, и одна гипотеза, что Киноцилия 'тянет' Стереоцилии в форме, как они созревают с микроворсинок 12. У позвоночных киноцилии в улитке имеются только временно и убрать из волосковых клеток у мышей до начала слушания 11,13,14.

Полная потеря ресничек в развивающихся результатов улитки сильно укороченных кохлеарных каналов, неправильно формируется и неправильно ориентированной stereociliary пучки, а также неправильно расположенные Кинетосомы 8,9. Функциональная ресничка не просто состоит из ресничного аксонемы. Многие белки, связанные с ресничкамиФункция происходят в комплексах локализованных в ресничками связанной поддоменов, таких как базального тельца, в переходной зоне, или мерцательной аксонемы 15. Базальное тельце, происходит от материнской центриоли из центросомы, также микротрубочки организационным центром для микротрубочек, проходящих от реснички в теле клетки и может регулировать внутриклеточный людьми, а также с торговлей ресничек. Зона цилиарного перехода является еще одним регионом, где функция цилиарной регулируется с точки зрения организации импорта и экспорта цилиарных соединений 16.

Многочисленные исследования выявили связь между ресничками и неканонической Wnt (РСР сигнализации), хотя точный механизм остается неясным 17. Избыточность цилиарных и PCP генов и чувствительность клеточной полярности к обобщенным клеточных нарушений, затрудняют напрямую связать мутацию в PCP конкретных дефицитов. Один из считанных выходы сигнализации PCP является расположение базальных тела и Primarу ресничка, поэтому разделения первичного от вторичных дефектов является сложной задачей. Некоторые исследования в данио и мыши мутантов не предложили никакой связи между ресничками и Wnt сигнализации 18-20. Расхождение в данных могут отражать виды, ткани или височно-зависимые различия в цилиарных взносов в Wnt сигнализации. Кроме того, нормальная Wnt отзывчивость может быть сохранена, если базальные тельца остаются функциональными. Более глубокое проникновение в роли цилиарных белков в клеточных сигнальных путей и других биологических явлений имеет решающее значение для нашего понимания сотовой биологии и биологии развития, а также для развития целевых стратегий лечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование и эвтаназии всех животных в соответствии с институциональными и правительственными нормами и правилами, обычно через СО 2 вдоха и цервикальной дислокации.

1. Подготовка реагентов

Примечание: Перед началом, подготовить все реагенты, используя аналитические химикаты класса. Сделать решения с использованием молекулярно-класс дистиллированную и деионизированную воду, если не указано иное.

  1. Фосфатным буфером физиологический раствор (PBS 1x): Make 1 л 1x PBS путем растворения 8g NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na 2 HPO 4 и 0,24 г KH 2 PO 4 в 1 л H 2 O. Доводят рН до 7,4 с помощью HCl. PBS не нужно быть стерильными и могут храниться при комнатной температуре. Обратите внимание, что этот буфер производится без CaCl 2 или MgCl 2.
  2. Параформальдегид (4% PFA): Подготовьте 4% -ный раствор PFA в 1x PBS в вентилируемом вытяжном шкафу. Добавить 40 г параформальдегида порошка до 1 л 1x PBS. Чтобы растворить, размешать и теплом около 60 ° C,и медленно добавить NaOH каплям для повышения рН. После того как порошок растворится, скорректировать рН до 7,4 с HCl. Смесь фильтруют через фильтр 0,45 мкм и заморозить аликвот. Размораживание свежий аликвоту для каждого эксперимента.
  3. Тритон буфера: Приготовить 0,1 М Трис-HCl (рН 7,5), 0,15 М NaCl, 0,1% Тритон Х-100 Раствор растворением 8,77 г NaCl в 1 л 0,1 М Трис-HCl (рН 7,5). Добавить 1 мл Тритон Х-100. Перемешать до растворения. Магазин Тритон буфера при комнатной температуре.
  4. Тритон блок: Подготовка 10% сыворотки козьего в буфере Triton добавлением 1 мл козьей сывороткой к 9 мл буфера Triton. Хранить при 4 ° С. При использовании первичных антител, затронутые в мыши, добавить антимышиного IgG Fab фрагментов при разведении 1 из 200 к блоку Triton для стадии блокирования.
    Примечание: Если планируете использовать образцы для сканирующей электронной микроскопии (SEM), подготовить дополнительные реагенты, которые перечислены ниже.
  5. Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) с кальцием и магнием: Выполнить 1x раствор HBSS разбавлением из маточного растворав стерильной дистиллированной H 2 O. Как HBSS буфера сложно сделать и есть риски, желательно заказать Premade 10x маточного раствора. Конечная концентрация HBBS буфер обычно используемых заключается в следующем: 1,26 мМ CaCl 2, 0,49 мМ MgCl 2 -6H2O, 0,41 мМ MgSO 4 -7H2O, 5,33 мМ КСl, 0,44 мМ KH 2 PO 4, 4,17 мМ NaHCO 3, 137,93 мМ NaCl 0,34 мМ Na 2 HPO 4, 5,56 мМ декстроза.
  6. Hepes буфера: Приготовьте 0,1 М раствора Hepes в HBSS 1x, путем растворения 23,8 г HEPES в 1 л 1x HBSS буфера.
  7. Сканирующая электронная микроскопия фиксатор (СЭМ Фикс): Подготовьте фиксатором для SEM разбавлением электронной микроскопии класса глутаральдегид (2,5%) и параформальдегида (4%) в буфере Hepes. Добавить CaCl 2 до конечной концентрации 10 мМ.
  8. 1% четырехокиси осмия (OsO 4) в буфере Hepes; 1% четырехокиси осми в воде: Развести исходного раствора осмия в буфере Hepes, и separatelг в стерильную дистиллированную Н2О, до конечной концентрации 1%. Четырехокиси осми является высокотоксичным и наиболее часто продаются как 4% -ного раствора.
  9. 1% (вес / объем) Дубильная кислота: Растворить 0,5 г дубильной кислоты в 50 мл стерильной дистиллированной H 2 O. Фильтр стерилизовать путем фильтрования через фильтр с размером пор 0,45.
  10. Дифференцированный этанол серии раствор: Разведите этанола пробы 200. стерильной дистиллированной Н2О вносить решения 30, ​​50, 70, 90 и 95% этанола. В течение последних полосканий этанола, требуется 100% этанола 200 Доказательство. Используйте только что открытой бутылки этанола пробы 200. для окончательного полоскания.

2. Выбор ткани

  1. В идеале, изучить эмбрионов или молодых щенков в возрасте от эмбрионального день 16,5 (E16.5) и постнатальный день 3 (Р3).
    Примечание: окостенение костного лабиринта и височных костей делает рассечение все более сложным, как мышей зрелые. Кроме киноцилии, единственный истинный микротрубочек на основе ресничка узнать на волосковых клеток улитки,втягивается в процессе разработки и больше не присутствует у взрослых мышей.
  2. После фиксации ДЕКАЛЬЦ взрослых cochleae. Бесплатно разместить расчлененный (раздел 3) костные лабиринты, в 2 мл ЭДТА (4,13% в ПБС), рН 7,3, в микроцентрифужных трубки в течение 3 - 4 дней с вращением. Пополнение ЭДТА ежедневно. После того, как ткани смягчили, промыть в 1,5 мл или более PBS 3 раза в течение 5 мин на nutator с усиленной агитации.

3. улитка Препарирование

  1. Сообщение euthanization помощью смещения шейных позвонков или CO 2 ингаляции (100% СО 2), снять головку. Используйте лезвие скальпеля или небольшой ножницы, в зависимости от размера животного, чтобы рассекать головой вдоль сагиттальной средней линии, начиная с носа и расширение каудально. Удалить мозг от каждой половины черепа с парой щипцов. Определить височных костей, которые содержат развивающиеся костные лабиринты внутреннего уха (смотри стрелку на рисунке 1А).
  2. Используйте пару дляБелые грибы тщательно изолировать костные лабиринты из черепа (височной кости). Делайте это при вскрытии микроскопом. Ценовое расстояние костной ткани из черепа, запустив щипцы осторожно под костных лабиринтов. У животных до P4 костные лабиринты еще хрящевые и могут быть легко удалены, не нарушая.
  3. После вскрытия, используйте кончик рассекает щипцов, чтобы очистить Овальные и круглые окна и сделать небольшое отверстие в вершине улитки спирали. Закрепить костные лабиринты перед дальнейшей вскрытия канала улитки. Для обеспечения легкого удаления текториальной мембраны (см 3.7), зафиксировать костные лабиринты в 1,5 мл 4% PFA в течение 5 минут на льду.
    Примечание: Если удаление текториальной мембраны не требуется, больше крепление рекомендуется (см 4.1 - 4.3). Краткая фиксация височных костей до вскрытия канала улитки помогает процессу рассечение и удаление текториальной мембраны. Сообщение рассечение и облучение органа Корти, Furtее крепление не требуется.
  4. Далее рассекают костные лабиринты, чтобы выставить кохлеарный сенсорного эпителия следующим образом. Поместите костные лабиринты в черном силиконового эластомера покрытием рассекает блюдо с PBS, чтобы облегчить рассечение. Используйте minutien штифты для фиксации ткани при необходимости. Чтобы использовать minutien булавки, разместить их через вестибулярной части костных лабиринтов с вентральной улиткового спирали вверх.
    Примечание: силиконовая эластомер блюдо: Смешайте силиконового эластомера базовый компонент с толченым древесным углем, чтобы получить непрозрачного черного цвета. Добавить отвердитель и вылить в одном или нескольких чашках Петри (стеклянные или пластиковые). Сухой под вакуумом для удаления захваченных пузырьков воздуха. Сухие блюда полностью перед использованием.
  5. Используйте тонкий пинцет (# 5), чтобы удалить внешнюю хрящ подвергая канала улитки. Начало в овальное окно; вставьте нижнюю оконечность пинцетом в овальное окно и аккуратно откройте хрящ, медленно вверх по направлению кВершина.
  6. После экспозиции канала улитки, удалить вентральной, мембрана рейснерова. Используйте тонкую пару щипцов, чтобы зажать мембраны рейснерова у основания канала улитки и очистить его от в восходящем движении. Визуализация спинной части канала улитки, в том числе чувствительного эпителия.
  7. Удалить текториальной мембраны, как описано ниже (по желанию). Для SEM или иммуногистохимии киноцилии или stereociliary пучков удалить текториальной мембраны.
  8. Используйте очень тонкую пару щипцов (# 55 или тоньше), чтобы зажать текториальной мембраны у основания улитки и очистить вверх по направлению к вершине.
    ВНИМАНИЕ: покровная мембрана оптически прозрачен, что делает его трудно определить. Чаще всего мембрана отрывается в одной части и хотя это не легко визуализировать, можно почувствовать сопротивление, как это снял с открытой органа Корти.
  9. После разоблачения орган Корти, дополнительно зафиксировать ткани, как Dвневписанной ниже. Сохранил вестибулярный область облегчить дальнейшую подготовку тканей.

4. Фиксация

  1. Для регулярной иммуногистохимии исправить отсеченных костные лабиринты в 1,5 мл 4% PFA при 4 ° С на nutator в течение 2 часов.
    Примечание: Из-за чувствительности отличающиеся антитела и антигены, вариации в длине и структуре фиксации может потребоваться и должен быть оптимизирован для каждого антитела.
  2. После фиксации мыть образцы промывкой 1,5 мл или более PBS 3 раза в течение 5 мин на nutator с усиленной агитации. Образцы могут храниться в PBS при 4 ° С в течение нескольких недель перед обработкой.
  3. Если пробоподготовки для РЭМ, исправить расчлененный височных костей в SEM исправления (см 1.7) в течение 2 часов при комнатной температуре. Промыть ополаскиванием в 1,5 мл или более Hepes буфера 3 раза в течение 5 мин на nutator с усиленной агитации. Хранить в буфере Hepes при 4 ° С до дальнейшей переработки. Хранение дольше, чем на пару неделюы не рекомендуется.

5. Иммуногистохимия

  1. Выполните иммуногистохимии на расчлененных образцов в одну лунку плоским дном 96-луночного планшета. Вместо этого можно использовать ПЦР или микроцентрифужных трубку. Желательно, чтобы сохранить вестибулярную часть костного лабиринта, чтобы облегчить обработку.
  2. Проницаемыми ткани путем инкубирования в 1,5 мл Тритона буфере в течение 1 часа при комнатной температуре на nutator при легком помешивании.
  3. Блок ткани путем инкубирования в 0,5 мл Тритона блока в течение минимум 1 часа при комнатной температуре. При использовании первичных антител, затронутые в мыши, добавить анти-мышиного IgG Fab фрагменты к блоку при разведении 1 из 200 (смотри раздел 1.4). Это значительно снижает неспецифического связывания анти-IgG мыши, чтобы ткани мыши.
  4. Инкубируйте ткани с первичными антителами разводят в Triton блока O / N при 4 ° С при осторожном перемешивании. Антитела разведения зависит от антител используются (см раздел 6.1). В качестве альтернативы инкубировать первичную antibodieев в течение 2 ч при комнатной температуре. В идеале использовать минимальный объем 0,5 мл разбавления первичных антител. Если антитело является ограниченным, использовать наименьший объем разбавления антител, которые полностью обволакивает ткани.
  5. Промыть ткань промывкой 1,5 мл или более Тритон буферных, как минимум 3 раза в течение 15 мин, на nutator с усиленной агитации.
  6. Инкубируйте ткани с флуоресцентным красителем, конъюгированным вторичными антителами разбавленных на производителей рекомендуется концентрацию (обычно 1: 200-1: 1000) в Triton блока в течение 1 часа при комнатной температуре на nutator. Используйте минимальный объем 0,5 мл вторичного разведения антител.
    1. Центрифуга разбавленный вторичное антитело при 13000 х г в течение 3 мин перед использованием, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание агрегатов вторичных антител. Щит ткань от света от этого шага вперед, чтобы избежать фотообесцвечивания флуоресцентных красителей.
  7. Как и в шаге 5.5, мыть ткани путем промывки в 1,5 мл или более Triton буфера, минимум 3 раза в течение 15 мин, наnutator с усиленной агитации. Образцы Хранить в PBS при 4 ° С до готовности к монтажу.

6. Выбор антител

Примечание: Источником рекомендованных антител и их разведений перечислены в таблице конкретных материалов и оборудования. Выполните инкубацию антител, как описано в разделе 5.

  1. Для визуализации микротрубочек на основе Киноцилия, использовать мерцательной аксонему маркер, такой как анти-Arl13b (1: 1000) или анти-ацетилированный-альфа-тубулина (1: 800). Визуализация базальную тело, используя антитело против гамма-тубулина (1: 200) или любой другой центросомной маркера.
  2. Для визуализации актиновых филаментов богатых stereociliary пучки, добавить фаллоидина (1: 300 - 1000), конъюгированный с одним из нескольких различных флуорофоров к вторичной инкубации антител. Фаллоидином также этикетки других нитчатых актина структур, включая корковых актиновых филаментов, окружающих периферию каждого эпителиальной клетки волос. Это полезно при определенииконтур каждой ячейки волос. Используйте альтернативный мембранный маркер, такой как анти-ZO-1 (1: 500), если это необходимо.
  3. Добавьте волосковых клеток улитки, используя антитела против миозина VI (1: 1000) или миозина VIIa (1: 1000). Они могут быть использованы, если оценки длины улитки.

Примечание: Используйте подходящие флуоресцентный краситель-сопряженных вторичные антитела оптимизированные с требованиями микроскопом.

7. Монтаж и обработка изображений

  1. Поместите образец в черном силиконовые эластомеры блюдо с PBS. Использование тонких щипцов, удалить вестибулярный регион от кохлеарного спирали.
  2. Очень осторожно удалить основную хрящ и мезенхиму от кохлеарного спирали. Оставшийся кохлеарный спиральный содержит внутреннюю борозду, орган Корти и внешней борозды.
  3. Перенести кохлеарный спираль в каплю PBS размещены на предметное стекло микроскопа. При желании, отделить кохлеарный спираль на куски, эквивалентных одной очереди. Этот шаг не является необходимым, однако, и может привести к лOSS ткани. Апикальной поверхности (стереоцилии сторона) из волосковых клеток улитки должна быть обращена вверх по направлению к покровным.
  4. Вика прочь PBS с адсорбентом ткани или кусок фильтровальной бумаги и аккуратно переместить кохлеарный спираль, если эпителий сместился и перекрывает на себя.
  5. Добавить каплю монтажных СМИ непосредственно на образце улитки и аккуратно разместить покровное на вершине, заботясь, чтобы избежать воздушных пузырей. Нет проставки не требуется; разместить покровное непосредственно на образце. Водорастворимый, не флуоресцирующего, Полупостоянная монтажа носитель, который не требует дополнительных мер для привлечения покровное на месте рекомендуется. Монтажные средства массовой информации и толщина покровного должны быть согласованы с микроскопом спецификации.
  6. Используйте эпифлуоресцентной или лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, оснащенный большим увеличением (63 - 100X), высокой числовой апертурой (1,2 - 1,4) целей для захвата изображений апикальной поверхности улитки волосковых клеток. Использование лоWER целей (5 - 20X) принимать перекрытия изображений кохлеарного спирали количественно длину канала улитки. Соответствие лазеры возбуждения и фильтры выбросов в флуорофоров, используемых для вторичных антител.

8. сканирующей электронной микроскопии

  1. Продолжить с разделом 4.3. После промывания SEM фиксированные образцы в буфере, Hepes, выполните следующие действия при хорошей вентиляции. Следующий протокол хорошо работает для улитки ткани и позволяет избежать использования покрыти распылением с проводящего металла.
  2. Сообщение затруднительного в 1% OSO 4 в Hepes буфере в течение 1 часа, затем 3 промывок 1 мл дистиллированной воды в течение 5 мин каждый. Наименьший объем OsO 4, который полностью обволакивает ткани должны быть использованы для минимизации токсичных отходов. Нет агитация не требуется.
  3. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в каждой из следующих растворов в течение 1 ч с 3 промывок 1 мл дистиллированной воды в течение 5 мин каждый промежуточный шагов: 1% дубильных кислоты свежеприготовленные в воде и филубито до использования; 1% OsO 4 в воде, 1% дубильных кислоты в воде, 1% OsO 4 в воде.
  4. Высушить пробы через серии градуированных этанола путем инкубации в течение 10 мин в каждом из следующих разведений: 30, 50, 70, 90, и 95%. Нет агитация не требуется.
  5. Образцы Перенос через три смены, 5 мин каждый, 100% этанола (из недавно открытого бутылкой этанола пробы 200.).
  6. Запуск образцы, хотя критической точки сушилке следующие инструкции производителя.
  7. Установите образцы, используя проводящий клей углерода сверху СЭМ заглушки до визуализации на электронном микроскопе. Под стереомикроскопа, использовать пару тонких щипцов и кисти мягко позиционировать образца с кохлеарные эпителий вверх. Используйте вестибулярной части образца 'якоря' ткани на заглушку. Образцы Хранить в эксикаторе до визуализации. Выполните визуализацию SEM, как описано в Jones (2012) 21.

9.определение

  1. После подготовки иммуногистохимии, получать изображения с использованием эпифлуоресцентной или лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. После подготовки к SEM, использовать сканирующий электронный микроскоп с изображением образцов. Изображение апикальной поверхности органа Корти с обнаженных волосковых клеток улитки и интеркалированных поддерживающих клеток.
  2. Определить конкретные позиции вдоль канала улитки, таких как 25, 50, и 75% от основания и используют их, чтобы сравнить улитки регионы между мутантных и контрольных проб. Анализировать и сравнивать реснички мутантов со своими контроля однопометница, а различия в генетическом фоне может изменить кохлеарный фенотип.
    Примечание: Кортиев орган развивается в градиенте, который простирается от середины основания в направлении обоих вершине и основанию. У мышей, развитие не является полным, пока P14, поэтому важно, чтобы сравнить регионы на аналогичных этапах развития и позиций.
  3. Снимайте с использованием программного обеспечения, сопровождающая микроскоп, который аллож для количественного определения конкретного фенотипа при необходимости (см ниже). Используйте программное обеспечение для анализа изображений, например Image J или программного обеспечения, сопровождающая микроскоп для измерения длины, рассчитывать клеток и определить локализацию белка, как описано ниже. График эти данные в виде гистограммы, диаграммы разброса, коробка-блоттинга или гистограммы, сравнивая мутантный контроль против.
  4. Общая длина канала улитки (3А):
    1. Используя маркер волосковых клеток или фаллоидина, (который отмечает stereociliary пучки), определить и измерить, где сенсорная эпителий начинается и заканчивается. Длина канала улитки часто сокращается в ресничек мутантов.
  5. Stereociliary аномалии расслоение (рис 3B, D, E, G):
    1. Измерьте расслоение выпуклость (по высоте) в качестве кратчайшего расстояния между вершиной пучка и линией, которая проходит через оба конца в комплект 'оружия', как показано на рисунке 3G, осталось. В качестве альтернативы, количественно площадьохватываются оружия космического волосковых клеток stereociliary расслоения, как показано на рисунке 3G, верно. Если клетки волос с круглыми пучками stereociliary могут быть идентифицированы учитывать их в качестве процентах от общего числа волосковых клеток.
      Примечание: Во многих цилиарных мутантов расслоение аномалии могут наблюдаться независимо от расслоения ориентации. Трудно точно определить их stereociliary аномалии расслоение.
  6. Ориентация из stereociliary расслоений (фигура 3В, С, G):
    1. Оценивают ориентацию каждого отдельного пучка по отношению к линии, проходящей перпендикулярно к ряду столбов клеток, который отделяет внутреннюю и внешнюю волосковых клеток. Клетки с нормальной ориентацией выровнены вдоль этой оси, перпендикулярной и поэтому имеют вращение 0 °. Определить углы поворота с использованием либо 360 ° обозначения или в абсолютных отклонений от 0 °.
  7. Киноцилий позиционирования или stereociliary позиционирования расслоение (рис3B, F, H):
    1. Подсчитайте процент клеток, в которых киноцилии отсутствуют. Измерьте расстояние от киноцилии к «вершине» или центра пучка. 'Вершина' расслоения не может быть легко определить, если пучки являются аномальными, и поэтому центр пучка может быть использован вместо.
  8. Количественно положение киноцилий и stereociliary пучков на апикальной поверхности волосковых клеток, путем наложения позиционное сетку на каждой ячейке волос и маркировки местоположения либо основания киноцилии или вершины / центра stereociliary пучка. Отображение данных в виде процента от каждой категории, которая лежит в пределах конкретного региона сетки, и путем наложения местоположения друг маркировки на одном позиционном сетке.
    Примечание: В тканях контрольных киноцилии всегда прикреплен к вершине stereociliary расслоения. В ресничек мутантов, киноцилии часто отсутствуют, mislocalized пока еще привязаны, или даже полностью отделены от Stereociliary расслоение.
  9. Длина киноцилий (рис 3I):
    1. Измерьте длину киноцилии путем маркировки с мерцательной аксонемы маркера. Только измерить киноцилий которые лежат плоские пределах 1,5 мкм конфокальной плоскости в. Убедитесь, что реснички лежа наблюдая поперечное сечение отсканированной ткани. Сравнить возрасте подобранные образцы из той же области улитки так киноцилия втягивается в процессе разработки.
  10. Mislocalization из белков полярности:
    1. После иммуногистохимии с использованием антител против белков полярности, таких как Vangl2 и Gαi3, определить локализацию через визуализации.

Примечание: В некоторых ресничек мутантов, локализация белков полярности нарушается. К ним относятся Vangl2 и Gαi3, которые, как было показано, чтобы быть нарушена в Ift20, Bbs8 и Bbs6 мутантного улитки.

Примечание: Дальнейшие примеры, как количественно и Polarit дисплей волосковых клетоку может быть найден в следующих работах. Куртина, и др. (2003) Current Biology 22, Montcouquiol и др. (2003) Nature 7, Ван и др (2006) Журнал Neuroscience 23, Montcouquiol и др. (2008) Методы молекулярной биологии 24, май-Simera др. (2012) Методы молекулярной биологии 25, Инь и др (2012) PLoS One 26.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Улитка Вскрытие и Подготовка ткани

После удаления мозга, после средней линии сагиттального рассечения головы P0 мыши, костного лабиринта, при взгляде сзади, и могут быть просмотрены (Фигура 1А, белая стрелка) и удаляют. 1В показаны отдельные костные лабиринты с кохлеарного волос вверх, брюшная, (слева) и сзади, спинной (справа). Белая стрелка указывает на овальное окно, из кот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При подготовке кохлеарный ткани для анализа, есть несколько ключевых моментов, чтобы иметь в виду. Во-первых, различия в генетическом фоне может изменить кохлеарный фенотип, что делает необходимым для анализа и сравнения только элементы управления однопометница. Во-вторых, полное удаление текториальной мембраны требуется для получения наилучшего изображения с иммуногистохимии и имеет важное значение для SEM. Покровная мембрана является непрозрачной структурой и может скрыть клетки сенсорного эпителия непосредственно под...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор заявляет об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор хотел бы поблагодарить Мэтью Келли, Тициана Cogliati, Джессика Gumerson Уве Вольфрума Ривка LEVRON, Виола Кречмер и Zoe Манн и их критической оценки рукописи. Эта работа была профинансирована Софья Ковалевская премии (Humbodlt Foundation) и Йоханнес-Университет Гутенберга, Майнц, Германия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Инструменты/Оборудование
Силиконовый эластомер - Sylgard 184Sigma-Aldrich761028-5EAСм. примечание 2
Микрорассекающие ножницы-прямое лезвиеРазличные
тонкие щипцы (No 5 и 55) и тупые щипцыРазличные
препарирующие микроскопы.Различные
предметные стекла для микроскопа без покрытияРазличные
защитные стекла для микроскопа (22 мм & 40 мм & раз 0,15 мм)Различные
переводные пипеткиРазличные
мелкие булавки Fine Science Tools26002-10
SEM Держатель образцаtousimis8762
Шпильки для сканирующей электронной микроскопииTED PELLA16111
PELCO Вкладки: Углеродный клейTED PELLA16084-3
Флуоресцентный микроскопРазличные
осушители для критических точекРазличные
Сканирующий электронный микроскопРазличные
стекольные предметные стекла микроскопаРазличные
стеклянные покровные стеклаРазличные
салфетки Kimwipe Различные
реактивы
для тонкой малярной кисти
1× Фосфатно-солевой буфер (PBS)Gibco/Life Technologies10010023
Параформальдегид  (ПФА) (Для EM требуется оценка EM)РазличныеГотовьте 4% раствор в 1& раз; PBS каждый раз свежий. Для ЭМ требуется класс EM.
2,5% глутаральдегид Grade 1Sigma-AldrichG5882
Tris-HCl (pH 7,5)Различные
NaClРазличные
CaCl 2Различные
Triton X-100Различные
обычные козьи сывороткиразличные
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-007-003
Фторомон-G Монтажная средаSouthernBiotech0100-01
10× Хэнкс Сбалансированный солевой раствор (HBSS)Gibco/Life Technologies14065
HepesGibco/Life Technologies15630-080
Тетраоксид осмия (OsO4 )Sigma-Aldrich/Fluka Analytical75632
Дубильная кислотаSigma-Aldrich403040
Этанол 200 proofРазличные
антитела
anti Arl13bProtein Tech17711-1-APРекомендуемая концентрация 1:1,000
антиацетилированного тубулина (611-B1)Sigma-AldrichT6793Рекомендуемая концентрация 1:800
антигамма-тубулина (GTU-88)Sigma-AldrichT6557Рекомендуемая концентрация 1:200
анти Zo_1 Invitrogen40-2300Рекомендуемая концентрация 1:500
Myosin VIProteus Biosciences25-6791Рекомендуемая концентрация 1:1000
Myosin VIIaProteus Biosciences25-6790Рекомендуемая концентрация 1:1,000
anti Vangl2Merk MilliporeABN373Рекомендуемая концентрация 1:250
anti Gα i3Sigma-AldrichG4040Рекомендуемая концентрация 1:250
Alexa Fluor® 488 PhalloidinInvitrogen/Life TechnologiesA12379Рекомендуемая концентрация 1:300 - 1,000
Alexa Fluor® 568 PhalloidinInvitrogen/Life TechnologiesA12380Рекомендуемая концентрация 1:300 - 1,000

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
  2. May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1, 7(2012).
  3. Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genet. 37, 1135-1140 (2005).
  4. Ezan, J., Montcouquiol, M. Revisiting planar cell polarity in the inner ear. Seminars in cell & developmental biology. 24, 499-506 (2013).
  5. Semenov, M. V., Habas, R., Macdonald, B. T., He, X. SnapShot: Noncanonical Wnt Signaling Pathways. Cell. 131, 1378(2007).
  6. Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37, 980-985 (2005).
  7. Montcouquiol, M., et al. Identification of Vangl2 and Scrb1 as planar polarity genes in mammals. Nature. 423, 173-177 (2003).
  8. May-Simera, H. L., et al. Ciliary proteins Bbs8 and Ift20 promote planar cell polarity in the cochlea. Development. 142, 555-566 (2015).
  9. Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nat Genet. 40, 69-77 (2008).
  10. Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hearing research. 22, 117-146 (1986).
  11. Nayak, G. D., Ratnayaka, H. S., Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Development of the hair bundle and mechanotransduction. The International journal of developmental biology. 51, 597-608 (2007).
  12. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the deveoping vestibular system of the mouse. J. Neurocytol. , 821-835 (1999).
  13. Sobkowicz, H. M., Slapnick, S. M., August, B. K. The kinocilium of auditory hair cells and evidence for its morphogenetic role during the regeneration of stereocilia and cuticular plates. Journal of neurocytology. 24, 633-653 (1995).
  14. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the developing vestibular system of the mouse. Journal of neurocytology. 28, 821-835 (1999).
  15. van Dam, T. J., et al. The SYSCILIA gold standard (SCGSv1) of known ciliary components and its applications within a systems biology consortium. Cilia. 2, 7(2013).
  16. Blacque, O. E., Sanders, A. A. Compartments within a compartment: what C. elegans can tell us about ciliary subdomain composition, biogenesis, function, and disease. Organogenesis. 10, 126-137 (2014).
  17. Wallingford, J. B., Mitchell, B. Strange as it may seem: the many links between Wnt signaling, planar cell polarity, and cilia. Genes & development. 25, 201-213 (2011).
  18. Borovina, A., Ciruna, B. IFT88 plays a cilia- and PCP-independent role in controlling oriented cell divisions during vertebrate embryonic development. Cell reports. 5, 37-43 (2013).
  19. Huang, P., Schier, A. F. Dampened Hedgehog signaling but normal Wnt signaling in zebrafish without cilia. Development. 136, 3089-3098 (2009).
  20. Ocbina, P. J., Tuson, M., Anderson, K. V. Primary cilia are not required for normal canonical Wnt signaling in the mouse embryo. PloS one. 4, e6839(2009).
  21. Jones, C. G. Scanning electron microscopy: preparation and imaging for SEM. Methods Mol Biol. 915, 1-20 (2012).
  22. Curtin, J. A., et al. Mutation of Celsr1 disrupts planar polarity of inner ear hair cells and causes severe neural tube defects in the mouse. Current biology : CB. 13, 1129-1133 (2003).
  23. Wang, Y., Guo, N., Nathans, J. The role of Frizzled3 and Frizzled6 in neural tube closure and in the planar polarity of inner-ear sensory hair cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 2147-2156 (2006).
  24. Montcouquiol, M., Jones, J. M., Sans, N. Detection of planar polarity proteins in mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 468, 207-219 (2008).
  25. May-Simera, H., Kelley, M. W. Examining planar cell polarity in the mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 839, 157-171 (2012).
  26. Yin, H., Copley, C. O., Goodrich, L. V., Deans, M. R. Comparison of phenotypes between different vangl2 mutants demonstrates dominant effects of the Looptail mutation during hair cell development. PloS one. 7, e31988(2012).
  27. Rachel, R. A., et al. Combining Cep290 and Mkks ciliopathy alleles in mice rescues sensory defects and restores ciliogenesis. J Clin Invest. 122, 1233-1245 (2012).
  28. Jagger, D., et al. Alstrom Syndrome protein ALMS1 localizes to basal bodies of cochlear hair cells and regulates cilium-dependent planar cell polarity. Human molecular genetics. 20, 466-481 (2011).
  29. Collin, G. B., et al. The Alstrom Syndrome Protein, ALMS1, Interacts with alpha-Actinin and Components of the Endosome Recycling Pathway. PloS one. 7, e37925(2012).
  30. Copley, C. O., Duncan, J. S., Liu, C., Cheng, H., Deans, M. R. Postnatal refinement of auditory hair cell planar polarity deficits occurs in the absence of Vangl2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 14001-14016 (2013).
  31. Sorusch, N., Wunderlich, K., Bauss, K., Nagel-Wolfrum, K., Wolfrum, U. Usher syndrome protein network functions in the retina and their relation to other retinal ciliopathies. Advances in experimental medicine and biology. 801, 527-533 (2014).
  32. Hebert, J. M., McConnell, S. K. Targeting of cre to the Foxg1 (BF-1) locus mediates loxP recombination in the telencephalon and other developing head structures. Dev Biol. 222, 296-306 (2000).
  33. Willott, J. F. Chapter 8, Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21B(2006).
  34. Martin, G. K., Stagner, B. B., Lonsbury-Martin, B. L., et al. Chapter 8, Assessment of cochlear function in mice: distortion-product otoacoustic emissions. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21C(2006).
  35. Finetti, F., et al. Intraflagellar transport is required for polarized recycling of the TCR/CD3 complex to the immune synapse. Nature cell biology. 11, 1332-1339 (2009).
  36. Sedmak, T., Wolfrum, U. Intraflagellar transport molecules in ciliary and nonciliary cells of the retina. J Cell Biol. 189, 171-186 (2010).
  37. Yuan, S., Sun, Z. Expanding horizons: ciliary proteins reach beyond cilia. Annual review of genetics. 47, 353-376 (2013).
  38. Tarchini, B., Jolicoeur, C., Cayouette, M. A molecular blueprint at the apical surface establishes planar asymmetry in cochlear hair cells. Developmental cell. 27, 88-102 (2013).
  39. Ezan, J., et al. Primary cilium migration depends on G-protein signalling control of subapical cytoskeleton. Nature cell biology. 15, 1107-1115 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

VIIAZO 1

Похожие статьи