Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Создание первичного фибробластов Культуры с уха мыши и хвост тканей

36.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53565

⸱

10 января 2016 г.

 , 
1Immunology Program, Department of Microbiology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering, National University of Singapore

В этой статье

Краткое содержание

Опишем простой и быстрый экспериментальную процедуру для генерации первичных фибробластов из ушей и хвостов мышей. Процедура не требует специальной подготовки животных и может быть использован для генерации фибробластов культур от ушей, хранящихся при комнатной температуре в течение 10 дней.

Аннотация

Первичные клетки получают непосредственно из тканей и, как считается, более представительным физиологического состояния клеток в естественных условиях, чем установленные клеточных линий. Тем не менее, первичных клеточных культур, как правило, имеют конечный срок службы, и их необходимо часто восстановлена. Фибробласты легко доступным источником первичных клеток. Здесь мы обсудим простой и быстрый экспериментальную процедуру, чтобы установить первичные культуры фибробластов из ушей и хвостов мышей. Протокол может быть использован для установления первичных культур фибробластов из ушей, хранящихся при комнатной температуре в течение 10 дней. Когда протокол внимательно следил, загрязнения, вряд ли произойдет, несмотря на использование нестерильных ткани хранится в течение длительного времени в некоторых случаях. Фибробласты быстро размножаются в культуре и может быть расширена до значительного числа перед прохождением репликативной старение.

Введение

Первичные клетки получают из живой ткани, и культивируют при условиях в пробирке. Это, как правило, предполагается, что первичные клетки больше напоминают физиологическое состояние и генетический фон ткани, из которой они возникли, чем иммортализованных или опухолевых клеточных линий 1. По этой причине, первичные клетки представляют собой полезную модель для изучения биологического вопросы 2,3. Однако, в отличие установленных клеточных линий, которые растут на неопределенный срок, в конце концов, первичные клетки претерпевают старение в культуре, и необходимо часто восстановлена.

Обычно используемые первичные клетки включают фибробласты, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, Т-клетки, В-клетки, костный мозг, полученный макрофаги кости (BMDM) и костного мозга дендритные клетки кости (BMDC). Фибробласты часто используют в качестве модели первичной культуре клеток. Они предлагают основные преимущества по сравнению с другими первичными клетками. Клеточные культуры легко устанавливаются, легко поддерживается и не требуют purificaние клеток, предшествующих культуры. Они имеют быструю первоначальную пролиферацию и не требование для специализированных протоколов среднего или активации. Фибробласты могут быть эффективно трансфецировали использованием биологического, химического и физического протоколы 4,5. Существует возможность сохранять уши до 10 дней при комнатной температуре до установления клеточных культур. Фибробластов культур способствуют визуализации цитоплазматических процессов и подходит для перепрограммирования в индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток 6.

Фибробласты являются важными клетками соединительной ткани, которые секретируют коллаген протеины и внеклеточный матрикс 7. Они обеспечивают структурную основу во многих тканях 8 и играют важную роль в заживлении ран и восстановления тканей 9,10.

Здесь мы опишем простой и быстрый (<4 ч) протокол о создании фибробластов культур из ушей и хвостов мышей 11. Протокол требует минимального мышьопыт урожай тканей (в отличие от других протоколов 12,13) ​​и может быть использован для установления культур из ушей, хранящихся в среде при комнатной температуре в течение до 10 дней.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Мышей содержали в свободных от патогенов условиях в соответствии с институциональными принципов вплоть до euthanization (институциональной уходу и использованию животных комитета (IACUC) руководящих принципов в Национальном университете Сингапура и Национального консультативного комитета лабораторных животных исследований (NACLAR) руководящих принципов).

1. Мыши

  1. Заказать одну мышь соответствующего генетического фона. Этот протокол основан на ткани, полученной от одного C57BL / 6 мыши.

2. Подготовка полной среде

  1. Подготовка полной среды путем добавления следующих компонентов для Roswell Park Memorial института (RPMI 1640): 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 100 мкМ аспарагин, глутамин 2 мМ, 1% пенициллина-стрептомицина раствора.

3. Подготовка растворов фермента

  1. Подготовьте коллагеназы D раствора в 15 мл коническую пробирку нижней.
    1. Взвесьте 10 мг коллагеназы Д. Диssolve коллагеназы D в 4 мл полной среды.
  2. Подготовка проназой решение в 1,7 мл микроцентрифужных трубки.
    1. Взвесьте 10 мг проназой.
    2. Добавьте 5 мкл 1 М Трис-буфера (рН 8,0). Добавить 1 мкл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0).
    3. Долить 494 мкл стерильной воды.
    4. Инкубируйте проназы раствора при 37 ° С на водяной бане в течение 30 мин.

4. Подготовка Коллагеназа Д-проназой Mix (≤2 хвосты)

Примечание: Выполните последующие шаги в стерильных капот культуре клеток.

  1. Добавить 250 мкл раствора проназой 4 мл коллагеназы D раствора.
  2. Пропускают коллагеназы D-проназы смесь через шприц 0,2 мкм фильтр в стерильный 15 мл коническую пробирку нижней.

5. Добыча фибробластов от уха и хвост тканей

  1. Эвтаназии мышей в соответствии с соответствующими институциональными руководящих принципов.
  2. Поместите автоклавного хирургические инструменты (ножницы и пинцет) в капот культуре клеток.
  3. Добавить 10 мл полной среды в двух чашки для культивирования клеток 10 см каждый.
  4. Сокращение уши (~ 1 см) радиуса и 5 см хвост (от кончика хвоста) мыши с ножницами и инкубировать в течение 5 мин в 40 мл 70% этанола в 50 мл стерильной коническим днищем трубки.
  5. Воздушно-сухой уши и хвост, помещая их в открытом 10 см клеточной культуры блюдо в капюшоне в течение 5 мин. После сушки передачи уха и хвост штук в двух культуральных чашках помечены "уши" и "хвост", содержащий 10 мл полной среды, как описано в шаге 5.3.
  6. Удалить волосы из ушей и хвоста с помощью ножниц.
  7. Вырезать уши и хвост на куски меньше, чем 3 мм в размере, используя ножницы.
  8. Перевести нарезанные ткани в 1,8 мл флаконах криоскопической меченых "уши" и "хвост" и добавить достаточно коллагеназы решение D-проназой по объему, чтобы достичь 1,8 мл знак на флаконе.
  9. пшнурок криоскопической флаконы по горизонтали на шейкере и встряхивают образцов при 200 оборотов в минуту в течение 90 мин при 37 ° С.
  10. Через 90 мин инкубации, удалить криоскопической флаконы из шейкера и поместите флаконы в капюшоне.
  11. Добавить 10 мл полной среды в двух 10 см чашки для культивирования клеток, меченных "уши" и "хвост" друг, и положить 70 мкм ячейки фильтра в каждом блюде.
  12. Поместите усваивается уха и хвост ткани в 70 мкм ячейки фильтра в соответственно меченных блюд, приготовленных на стадии 5.11 и сильно растереть тканей с использованием 10 мл шприца для> 5 мин. Встряхнуть клеток фильтр иногда в среде мыть клетки из ячейки фильтра.
  13. Внесите суспензии клеток с каждого блюда в два 15 мл конических нижних труб помеченных "уши" и "хвост". Вымойте блюдо и фильтр с дополнительными 10 мл полной среды и добавить среду в соответствующие 15 мл конических нижних труб.
  14. Спин вниз ячейкуСуспензию в течение 7 минут при температуре ~ 580 мкг и 4 ° С с использованием охлажденного клеток центрифуги.
  15. Удалить супернатант, добавить 10 мл полной среды к осадку клеток в 15 мл коническую нижнюю трубки и клетки вновь суспендируют.
  16. Повторите шаг 5.14 и 5.15.

6. Культивирование клеточной смеси

  1. Удалить супернатант. Убедитесь, что клеточный осадок остается нетронутой.
  2. Повторное приостановить клеток в 10 мл полной среды и добавить соответствующую смесь двух 10 см чашки для культивирования клеток, меченных "уши" и "хвост".
  3. Добавьте 10 мкл раствора амфотерицина В (исходный раствор: 250 мкг / мл) в культуру.
  4. Инкубируйте клетки при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 инкубаторе.
  5. На третий день, заменить жидкость с 10 мл свежей полной среды, содержащей 10 мкл амфотерицина для удаления мусора (фиг.1 и 2).

7. Суб-культуры фибробластов

  1. Wheп культура достигает около 70% слияния (3-4 культуры день) удаления носителя и промыть клетки с 5 мл стерильного 1x фосфатным буферным раствором (PBS).
  2. Удалить PBS и добавить 2 мл стерильной 1x решение трипсина-EDTA к клеткам.
  3. Инкубируйте клетки в течение 5 мин при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 инкубаторе.
  4. Через 5 мин, осторожно нажмите культуры блюдо и добавить 6 мл полной среды к клеткам.
  5. Передача клеточной суспензии в 15 мл коническую пробирку и нижней спина трубки в течение 5 мин при температуре ~ 450 мкг и 4 ° С с использованием охлажденного клеток центрифуги.
  6. Удалить супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок клеток в 5 мл полной среды.
  7. Семенной 2 х 10 5 клеток в клеточной культуральной чашке 10 см и инкубируют клетки при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 инкубаторе в течение 3-4 дней до повторяя шаги 7.1 до 7,6.

8. Подготовка к отгрузке уши

Примечание: Выполнение тон последующие шаги в стерильных капот культуре клеток.

  1. Эвтаназии мышей в соответствии с соответствующими институциональными руководящих принципов.
  2. Поместите автоклавного ножницы и пинцет в капот культуре клеток.
  3. Добавить 50 мл полной среды в 50 мл коническую пробирку нижней.
  4. Вырезать уши (~ радиус 1 см) мыши с ножницами.
  5. Перевести уши в 50 мл коническую трубку нижней (как полученного на стадии 3) с помощью щипцов.
  6. Уплотнение 50 мл коническую трубку с нижней парафильмом перед отправкой в ​​РТ в соответствующем поле.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Добыча фибробластов ткани приводит к значительному количеству ткани мусора (Рисунок 1). В отличие от ткани мусора, фибробласты придерживаться тканевой культуре пластиковых поверхностей между день 1 и 3 культуры. Среда фибробластов культур может быть безопасно изменены в день 3 культуры, которые должны значительно уменьшить уровни мусора, присутствующего в культуре (рис 2). Фибробласты отображения удлиненную морфологию и четко видимый цитоплазму (1 и 2). Митотических кле...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы предлагаем простой, недорогой и быстрый экспериментальную процедуру, чтобы установить первичные культуры фибробластов из ушей и хвостов мышей. Извлечение должно привести к адгезивных и быстро делящихся фибробластах в течение 3 дней после выделения ткани. Важным ограничением первичных клеток старение, постоянная задержка роста 15. Использование протокола, фибробластов культуры могут быть пассировать в течение 5 6 раз, прежде чем фибробласты стать стареющей, указывается уплощение клеток, увеличение раз...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом NRF HUJ-CREATE - Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
RPMI-1640HyCloneSH30027.01
Сыворотка для теленкаплода HyCloneSV30160.03
2-меркаптоэтанолSigma-AldrichM3148
АспарагинSigma-AldrichA4159
ГлутаминSigma-AldrichG8540
Пенициллин/стрептомицинHyCloneSV30010
ЭтанолMerck Millipore107017Absolute для анализа
Коллагеназа DRoche Диагностика11088866001От Clostridium histolyticum, лиофилизированная, нестерильная
протеаза проназыMerck Millipore53702От Streptomyces griseus 
Трис буфер (pH 8)1st BASE1415Ультрачистый класс
0,5M EDTA (pH 8)1st BASEBUF-1053Биотехнологический класс
10X Фосфатный буферный раствор (PBS)1st BASEBUF-2040-10X4LУльтрачистый раствор
трипсина-ЭДТА 10XSigma-Aldrich59418C-100ML0,5% трипсин, 0,2% ЭДТА, трипсин гамма, облученный процессом SER-TAIN, без фенола красного, в физиологическом растворе
Амфотерицин BSigma-AldrichA2492-20мл250 мкм; г/мл в деионизированной воде, стерильно-фильтрованные
ножницыAesculap
ЩипцыAesculapAE-BD312R
0.2 μ М шприц фильтрSartorius Stedim16534
70 μ M клеточный фильтрSPL93070
Шприц-поршеньTerumoSS+10L
Криовиальная трубкаNUNC368362
1,7 мл микроцентрифужная пробиркаAxygenMCT-175-C
10 см чашка для клеточной культурыGreiner664160Чашка для обработки клеточной культуры 
15 мл коническая нижняя трубкаGreiner188271
50 мл коническая нижняя трубкаGreiner227261
водяная баняGFL1002
ЦентрифугаEppendorf5810R
Инкубационный шейкерSartorius StedimCertomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 световой микроскопCarl Zeiss AG

Ссылки

  1. Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
  2. Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells. Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).
  3. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. J Neuroinflammation. 9 (1), 115(2012).
  4. Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
  5. Li, M., et al. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21 (11), 1527-1543 (2010).
  6. Patel, M., Yang, S. Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6 (3), 367-380 (2010).
  7. Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
  8. Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).
  9. Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89 (3), 219-229 (2010).
  10. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. J Invest Dermatol. 127 (5), 998-1008 (2007).
  11. Shen, Y. J., et al. Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells. Cell Rep. 11 (3), 460-473 (2015).
  12. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. (44), (2010).
  13. Baglole, C. J., et al. Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts. Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).
  14. Alt, E., et al. Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential. Biol Cell. 103 (4), 197-208 (2011).
  15. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  16. Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication. J Natl Cancer Inst. 60 (2), 477-478 (1978).
  17. Moore, C. B., Allen, I. C. Primary ear fibroblast derivation from mice. Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).
  18. Liu, J., et al. Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts. Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

B
Создание первичного фибробластов Культуры с уха мыши и хвост тканей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.