Методическая статья

Визуализации мембранного потенциала с двумя типами генетически кодируемых флуоресцентных датчиков напряжения

DOI:

10.3791/53566

⸱

4 февраля 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Transdisciplinary Studies, Graduate School of Convergence Science and Technology, Seoul National University, 2Center for Functional Connectomics, Korea Institute of Science and Technology, 3College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University, 4Advanced Institutes of Convergence Technology

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описан метод визуализации изменений мембранного потенциала с использованием генетически закодированных индикаторов напряжения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Генетически закодированные индикаторы напряжения (GEVI) улучшились до такой степени, что они начинают быть полезными для записей in vivo. В то время как конечная цель состоит в том, чтобы визуализировать активность нейронов in vivo, необходимо иметь возможность визуализировать активность одной клетки, чтобы обеспечить успешное получение препаратов in vivo. В этой процедуре будет описано, как визуализировать мембранный потенциал в одной клетке, чтобы обеспечить основу для последующего изображения in vivo. В данной работе мы описываем методы визуализации GEVI, состоящих из потенциал-чувствительного домена, слитого либо с одним флуоресцентным белком (FP), либо с двумя флуоресцентными белками, способными осуществлять резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) in vitro. Использование разветвителя изображения позволяет одновременно проецировать изображения, созданные двумя разными длинами волн, на одну и ту же камеру устройства с зарядовой связью (ПЗС). Разделитель изображения размещает второй куб фильтра в световом тракте. Этот второй фильтрующий куб состоит из дихроичного и двух эмиссионных фильтров для разделения донорных и акцепторных длин флуоресцентных волн в зависимости от FP GEVI. Такая конфигурация позволяет одновременно регистрировать как акцепторного, так и донорского флуоресцентных партнеров, в то время как потенциалом мембраны манипулируют с помощью конфигурации зажима для всей клетки. При использовании GEVI, состоящего из одного FP, второй куб фильтра может быть удален, что позволяет зеркалам в разветвителе изображения проецировать одно изображение на ПЗС-камеру.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основное внимание в этой статье является демонстрация оптических изображений изменений в мембранных потенциалов в пробирке с использованием генетически закодированные флуоресцентные белки. Изменения визуализации мембранного потенциала предлагает захватывающие возможности изучения деятельности нейронов схем. При внесении изменений в мембранного потенциала приводит к изменению интенсивности флуоресценции, каждый пиксель камеры становится суррогатной электрод позволяет ненавязчивая измерения активности нейронов. На протяжении более сорока лет, органические красители напряжения чувствительных были полезны для наблюдения изменений мембранного потенциала 1-4.....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Заявление по этике: Протокол эксперимента животное было одобрено Институциональные уходу и использованию животных комитета по протоколу животного KIST 2014-001.

1. Подготовка оборудования

  1. настройка изображений
    1. Поместите перевернутую флуоресцентного микроскопа на столе виброизоляции. Используйте большом увеличении (60X иммерсионным объективом с числовой апертурой 1,35) объектива и фильтра куба снабженную дихроичным зеркалом и фильтров, подходящей для флуоресцентных белков, используемых для визуализации напряжения.
      Примечание: Эта установка использует инвертированного микроскопа с тем чтобы использовать цели с более....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Транзиторно трансфицированные клетки могут проявлять существенное изменение в интенсивности флуоресценции и степень экспрессии плазматической мембраны. Даже на той же покровным некоторые клетки будут иметь различные уровни внутреннего флуоресценции. Это наиболее вероятно из-за количества агентом трансфекции поглощенной клеткой. Иногда слишком много выражение заставляет клетку испытать развернутую реакцию белка, что приводит к апоптозу 27 (яркий, округлые клетки, с высоким внут.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нервная система использует напряжение несколькими различными способами, ингибирование вызывает небольшое гиперполяризации, синаптической вход вызывает небольшое деполяризацию и действие потенциальных результатов в относительно большом изменении напряжения. Возможность измерения изменения мембранного потенциала от GeViS предлагает многообещающий потенциал анализа нескольких компонентов нейронных цепей одновременно. В этом докладе мы демонстрируем основным методом изменения изображений в мембранного потенциала с использов.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана программой World Class Institute (WCI) Национального исследовательского фонда Кореи, финансируемой грантом Министерства образования, науки и технологий Кореи WCI 2009-003 и проектом институциональной программы Корейского института науки и технологий 2E24210. Сунму Ли был поддержан Глобальной программой стипендий для докторов философии (NRF-2013H1A2A1033344) Национального исследовательского фонда (NRF) при Министерстве образования (MOE, Корея).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Инвертированный микроскопOlympusIX71
60X объектив объектив (числовая апертура = 1,35)OlympusUPLSAPO 60XO
Возбуждающий фильтрSemrock  FF02-472/30Для визуализации напряжения суперэклиптики pHluorin в Бонгури
Дихроичное зеркалоSemrockFF495-Di03-25x36
Эмиссионный фильтрSemrockFF01-497/LP
75 Вт ксеноновая дуговая лампаCAIRNOptoSource IlluminatorСветодиоды и лазеры также являются эффективными источниками света
Медленная ПЗС-камераHitachiKP-D20BU
Двухпортовый адаптер камерыOlympusU-DPCAD
Высокоскоростная ПЗС-камераRedShirtImaging, LLCNeuroCCD-SM
Разветвитель изображенияCAIRNOptosplit 2
Возбуждающий фильтрSemrockFF01-475/23-25Для визуализации напряжения FRET пары на основе GEVI, состоящей из клевера и mRuby2)
Дихроичное зеркалоSemrockFF495-Di03-25x36
Фильтр излученияChromaET520/40
Дихроичное зеркалоSemrockFF560-FDi01-25X36
Фильтр излученияChromaET645/75
Система виброизоляцииKinetic systems250BM-IC, 5702E-3036-31
Камера для коммутацииWarner instrumentsRC-26G, 64-0235
#0 Micro Coverglass (22 x 40 мм)Электронная микроскопия Sciences72198-20
Регулятор температурыWarner instrumentsTC-344B
#0 (0,08 ~ 0,13 мм) - 10 мм диаметр стеклянного покровного стеклаTed Pella260366
липофекционного агентаLife Technologies11668-027
Реактив фосфата кальцияClontech - Takara631312
Усилитель патч-клещейHEKAEPC 10 USB усилитель
Многоканальный сбор данныхHEKAPatchmaster
Программное обеспечение для сбора и анализа изображенийRedShirtImagingNeuroplex
Spreadsheet прикладное программное обеспечениеMicrosoftMicrosoft Excel 2010
Программное обеспечениедля анализа данныхOriginLabOriginPro 8.6.0
ДеммагнификаторQioptiq LINOSOptem стандартный фотоаппарат Соединитель 0,38x SC38 J Зажим
Конфокальный микроскопNikonA1R Конфокальный микроскоп
Антивыцветающий реактивLife TechnologiesP36930

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246, 508-509 (1973).
  2. Cohen, L. B., et al. Changes in axon fluorescence during act....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GEVI FRETwhole cell patch clampHEK293

Похожие статьи