Method Article

Визуализации мембранного потенциала с двумя типами генетически кодируемых флуоресцентных датчиков напряжения

DOI:

10.3791/53566

⸱

February 4th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Transdisciplinary Studies, Graduate School of Convergence Science and Technology, Seoul National University, 2Center for Functional Connectomics, Korea Institute of Science and Technology, 3College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University, 4Advanced Institutes of Convergence Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описан метод визуализации изменений мембранного потенциала с использованием генетически закодированных индикаторов напряжения.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Генетически закодированные индикаторы напряжения (GEVI) улучшились до такой степени, что они начинают быть полезными для записей in vivo. В то время как конечная цель состоит в том, чтобы визуализировать активность нейронов in vivo, необходимо иметь возможность визуализировать активность одной клетки, чтобы обеспечить успешное получение препаратов in vivo. В этой процедуре будет описано, как визуализировать мембранный потенциал в одной клетке, чтобы обеспечить основу для последующего изображения in vivo. В данной работе мы описываем методы визуализации GEVI, состоящих из потенциал-чувствительного домена, слитого либо с одним флуоресцентным белком (FP), либо с двумя флуоресцентными белками, способными осуществлять резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) in vitro. Использование разветвителя изображения позволяет одновременно проецировать изображения, созданные двумя разными длинами волн, на одну и ту же камеру устройства с зарядовой связью (ПЗС). Разделитель изображения размещает второй куб фильтра в световом тракте. Этот второй фильтрующий куб состоит из дихроичного и двух эмиссионных фильтров для разделения донорных и акцепторных длин флуоресцентных волн в зависимости от FP GEVI. Такая конфигурация позволяет одновременно регистрировать как акцепторного, так и донорского флуоресцентных партнеров, в то время как потенциалом мембраны манипулируют с помощью конфигурации зажима для всей клетки. При использовании GEVI, состоящего из одного FP, второй куб фильтра может быть удален, что позволяет зеркалам в разветвителе изображения проецировать одно изображение на ПЗС-камеру.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основное внимание в этой статье является демонстрация оптических изображений изменений в мембранных потенциалов в пробирке с использованием генетически закодированные флуоресцентные белки. Изменения визуализации мембранного потенциала предлагает захватывающие возможности изучения деятельности нейронов схем. При внесении изменений в мембранного потенциала приводит к изменению интенсивности флуоресценции, каждый пиксель камеры становится суррогатной электрод позволяет ненавязчивая измерения активности нейронов. На протяжении более сорока лет, органические красители напряжения чувствительных были полезны для наблюдения изменений мембранного потенциала 1-4. Тем не менее, эти красители не хватает клеточную специфичность. Кроме того, некоторые типы клеток трудно окрасить. Генетически кодируемые индикатор напряжения (GeViS) преодолеть эти ограничения, имея клетки должны быть изучены конкретно выразить флуоресцентный напряжения чувствительных зонд.

Есть три класса GeViS. Первый класс Gevi использует ВОltage зондирования домен из напряжения зондирования фосфатазы либо одной флуоресцентного белка (FP) 5-9 или передача энергия резонанса Ферстер (лад) пары 10-12. Второй класс датчиков использует микробного родопсина в качестве флуоресцентного индикатора непосредственно 13-15 или через электрохромное FRET 16,17. Третий класс использует два компонента, генетический компонент является мембрана закреплена ФП и второй компонент, будучи связанный с мембраной закалки краситель 18-20. В то время как второй и третий классы полезны для в пробирке и нарезать экспериментов 19,20, только первый класс датчиков в настоящее время полезно в естественных условиях анализов 6.

В этом докладе мы продемонстрируем визуализацию мембранного потенциала с использованием первого класса GeViS (рис 1) в пробирке. Это первый класс датчиков напряжения является самым простым для перехода в режим визуализации в естественных условиях. Так GeViS уtilizing домен напряжения зондирования, слитый с FP являются около 50 раз ярче, чем класс родопсина датчиков, они могут быть отображены с помощью дуговой лампы подсветки, не требуя чрезвычайно мощный лазер. Другим следствием неравенства в яркости, что первый класс GeViS может легко превысить автофлуоресценции мозга. Родопсина основе зонды не могут. Третий класс датчика так же ярко, как в первый класс, но требует добавления химических гасителем который трудно вводить в естественных условиях.

Мы, следовательно, демонстрируют приобретение зонда с одним FP (Bongwoori) 8 и зонда, состоящей из пары FRET (Nabi 2) 12. FRET строит в настоящем докладе, бабочки версии ВМРП-CR (напряжение чувствительных флуоресцентных белков - клевер-mRuby2) 11, состоящей из зеленого флуоресцентного донора, клевер, и красного флуоресцентного акцептора, mRuby2, названный Наби 2,242 и 2,244 Наби

figure-introduction-1
Рисунок 1. Два типа генетически кодируемых указателей напряжения (GeViS) отображается в этом отчете (а) моно FP основе Gevi имеющий трансмембранный напряжения зондирования домен и флуоресцентный белок. (B) на основе Gevi FRET состоит из транс-мембранного напряжения зондирования домена, донора и акцептора FRET. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Заявление по этике: Протокол эксперимента животное было одобрено Институциональные уходу и использованию животных комитета по протоколу животного KIST 2014-001.

1. Подготовка оборудования

  1. настройка изображений
    1. Поместите перевернутую флуоресцентного микроскопа на столе виброизоляции. Используйте большом увеличении (60X иммерсионным объективом с числовой апертурой 1,35) объектива и фильтра куба снабженную дихроичным зеркалом и фильтров, подходящей для флуоресцентных белков, используемых для визуализации напряжения.
      Примечание: Эта установка использует инвертированного микроскопа с тем чтобы использовать цели с более высокой NA, но прямые микроскопы могут быть также использованы. Действительно, инвертированный микроскоп только для развития зонда, поскольку выше числовая апертура (NA) линзы объектива собирает больше света, чем тот, с низким NA, тем самым улучшая отношение сигнала к шуму (SNR; может быть описана как пик оптического сигнала, деленной на стандартное отклонение базовой линиифлуоресценции) из записи. Для не-разработчиков, мы рекомендуем прямой микроскоп для таких приложений, как ломтик или в естественных записей.
    2. Подготовьте источник света, например., Дуговая ксеноновая лампа, оснащена механическим затвором для эффективной эпифлуоресцентной изображений широкого поля. Направьте свет микроскопа с помощью световода крепление. Свет будет проходить через фильтр возбуждения и находит свое отражение в первом дихроичного зеркала в фильтре куба. Совместите свет равномерно освещает образец с максимальным интенсивности света над полем зрения 21.
      Примечание: Традиционно, 75 Вт дуговая лампа была использована так как более высокие мощность лампочки создают больше, но не более яркие поля освещения. Лазеры могут быть использованы, но ограничены одной длине волны. Светодиоды становятся ярче и действительно может быть источником света выбора предлагая различных длин волн и не требующего механический затвор.
    3. Смонтировать две ПЗС-камеры к fluorescENCE микроскоп, как показано на рисунке 2D.
      Примечание: Первая камера CCD имеет высокое пространственное разрешение и используется для идентификации клетки, экспрессирующей Gevi в плазматической мембране, подлежащего испытанию. Для изменения изображений мембранного потенциала, убедитесь, что второй ПЗС-камера имеет высокую частоту кадров, таких как 1000 кадров в секунду (FPS). Используйте двойную адаптер порт камеры (рис 2D- (3)), чтобы переключить путь формирования изображения между двумя ПЗС-камер. В данной настройке demagnifier используется, чтобы поместить изображение от объектива на ПЗС-матрицы во втором ПЗС-камеры.
    4. Установите разветвитель изображения между первым (медленно) и второго (быстрых) ПЗС-камер для работы с изображениями на основе FRET Gevi. Вставьте фильтр куб, имеющий дихроичное зеркало (560 нм) и двух фильтров выбросов (520 нм / 40 & 645 нм / 75) в разветвитель изображений. Это приведет к двум полей зрения, по одному для флуоресценции донора и другой, представляющей акцепторный флуоресценцию. Удалить этот Second светофильтров при визуализации с Gevi с одним FP.
      Примечание: Сингл FP основе Gevi проходят в этом методе Bongwoori который использует FP, супер эклиптики pHluorin A227D (SE A227D). Были выбраны фильтр возбуждения (472 нм / 30), фильтр твердых (497 нм / длинный пас) и дихроичное зеркало (495 нм) на основании его спектры возбуждения и излучения 5. Как правило, возбуждения и излучения фильтры должны иметь наибольшее перекрываются друг с спектра флуорофора приобрести яркое изображение в то время как дихроичное зеркало блокирует любой свет возбуждения передается через фильтр эмиссии. Выбор фильтров и дихроичных зеркал для записи Gevi основе FRET пары 11 по тому же принципу, за исключением того, что требует второй фильтр куб в сплиттер изображения для одновременного наблюдения донора и акцептора флуоресценции. Первый фильтр куб помещают в коробку микроскоп фильтра должен иметь фильтр возбуждения (475 нм / 23) для Clover. Затем испускаемый еluorescence от обоих FPs будет передан второй фильтровальной куба через первый дихроичным зеркалом (495 нм). Второй фильтр куб имеет дихроичное зеркало (560 нм) и двух фильтров выбросов (520 нм / 40 для клевера и 645 нм / 75 для mRuby2) для при этом каждый FP отделения флуоресценции от двух разных кадров в секунду.
Одно Gevi основе FP
(Bongwoori) 		FRET основанную Gevi пара
(Nabi 2,42 & Nabi 2.44)
Первый фильтр куб помещают в микроскоп фильтр возбуждения 472 нм / 30 475 нм / 23
дихроичное зеркало 495 нм 495 нм
эмиссионный фильтр 497 нм / длинный пас -
Во-вторых светофильтров помещают в светоделителе дихроичное зеркало -
выбросов фильтр 1 - 520 нм / 40
эмиссионный фильтр 2 - 645 нм / 75

Таблица 1. Два разных наборов фильтров используется для одного FP основе Gevi и лобзиком Based Gevi Recordings

  1. виброизоляция
    1. Не монтировать любое оборудование с движущимися компонентами на стол виброизоляции. Убедитесь, что кабели, подключенные к неизолированным оборудования свободны, чтобы избежать вибрации образца.
  2. Зажим камера патч
    1. Уплотнение дна патч зажим камеры с тонким # 0 покровным стеклом, так как рабочее расстояние объектива относительно невелико. Это является недостатком перевернутой установки микроскопа.
      Примечание: Как компромисс иметь высокую NA объектива, рабочее расстояние уменьшается. Для того, чтобы поместить specimан течение очень короткого рабочего расстояния, покровное стекло и покровное (этап 2) должны быть как можно тоньше.
  3. Контроль температуры
    1. Убедитесь, что раствор ванны течет через регулятор температуры для поддержания исправленного-клетки около 33 ° С в течение всего эксперимента.
  4. соединения, оборудование
    1. Подключите усилитель патч зажим и механический затвор источника света к командной коробке Штык Neill-Concelman (BNC) камеры высокоскоростной CCD. Это позволит обработки изображений, чтобы управлять усилителем, камеру и источник света одновременно.
      Примечание: Электрические и визуализации компоненты должны быть синхронизированы с тем чтобы обеспечить для одновременных электрических и оптических записей электрической активности.

figure-protocol-1
Рисунок 2. Если на персонажения настройки для работы с изображениями напряжения с GeViS рабочего процесса следующие пути света, (А) 75W ксеноновой дуговой лампы, (B) возбуждающего света от дуговой лампы фильтруется фильтром возбуждения, а затем отражается первым дихроичным зеркалом, прежде чем он достигает предметном столике, вставка в правом верхнем углу показывает конфигурацию целой клетки, (C) медленная скорость CCD камера используется, чтобы помочь как выбор зажимом клеток и патч, (г) часть захвата изображений; (1) высокая скорость CCD камера, (2) изображение разветвитель для обоих FRET сопряжение и моно FP GeViS, (3) demagnifier чтобы соответствовать изображение на ПЗС-матрицы в камере высокоскоростной CCD, (4) двухпортовый адаптер камеры для переключения пути изображений и (5) медленное камеру скорость CCD с высоким пространственным разрешением для идентификации ячейки к патч, (E & F) приобретение изображения с основанным одного FP Gevi (E) и FRET основе Gevi(F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

2. Выражение GeViS

  1. В клетках эмбриональной почки человека 293
    1. Культура эмбриональной почки человека 293 (НЕК 293) клетки с модифицированным Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки при 37 ° С в СО 2 инкубаторе (5% CO 2). Используйте ткани культуры блюдо с диаметром 100 мм и высотой 20 мм. Начало культуры с 2 х 10 3 - 6 х 10 3 клеток / см 2 и инкубировать пока они не достигнут 80-90% слияния для последующего трансфекции.
    2. В день трансфекции, аспирацию клеточную среду и осторожно мыть один раз фосфатным буферным раствором Дульбекко. Дисперсные клетки НЕК 293 с 0,25% -ным раствором трипсина-ЭДТА в течение 1-2 мин, аспирации решение и осторожно постучите блюдо отсоединить грлоктей. Добавить свежий DMEM (10% FBS) и диссоциации слипаются клетки с помощью пипетки. Определить концентрацию клеток с помощью гемоцитометра.
    3. Поместите 0.08 - толщиной 0,13 мм, диаметр 10 мм покровные предварительно покрывают поли-L-лизина в культуральной пластины тканевой 24-луночного. Семенной клетки НЕК 293 на покровных в 1 х 10 5 клеток / см 2 плотность клеток.
      Примечание: Так как клетки НЕК 293, способны образовывать щелевые контакты друг с другом, количество семян должно давать изолированных клеток.
    4. Транзиторно трансфекции клеток с соответствующим генной конструкции, кодирующей Gevi с помощью реагента Липофекция следующие инструкции производителя.
      Примечание: генные конструкции, используемые для этого шага, используемой пкДНК3.1 (Bongwoori) и pUB2.1 (Nabi 2,242) в качестве магистральных векторов. Количество используется ДНК 100 нг для каждого покровного; Однако условия трансфекции должны быть определены эмпирически для каждого Gevi быть проверены.
  2. В диссоциированного бедра мышиpocampal первичные нейроны
    1. Рассеките гиппокампе из эмбриональных день 17 C57BL6 / N мышей, а затем отделить нейронов гиппокампа, как описано ранее 22,23.
    2. Тарелка диссоциированные нейроны на поли-D-лизин покрытием 0.08-0.13 мм толщиной, 10 мм диаметр покровные на 1 × 10 5 клеток / мл клеточной плотности. Инкубируйте клетки при 37 ° С в СО 2 инкубаторе (5% CO 2).
    3. Трансфекции диссоциированных нейронов транзиторно в 6 - 7 дней в пробирке (DIV) с генной конструкции, кодирующей Gevi с помощью реагента для трансфекции с фосфатом кальция, как описано ранее 24.
      Примечание: генные конструкции, используемые для этого шага, используемой пкДНК3.1 (Bongwoori) и pUB2.1 (Nabi 2,244) в качестве магистральных векторов. Количество ДНК использовали 1 мкг каждого покровное. Опять же, условия трансфекции должны быть определены эмпирически для каждого Gevi тестируемого.
  3. Проверьте уровень экспрессии до напряжением ИмаGing
    1. Возьмите планшет для тканевых культур от СО 2 инкубатора и наблюдать флуоресценцию от трансфицированных клеток под микроскопом эпифлуоресцентной.
    2. После подтверждения флуоресценцию от мембраны, передавать покровное к камере латание для визуализации напряжения в разделе 3.
      Примечание: изображения напряжения проводится 16 - 24 часов после трансфекции. Однако, как различные флуоресцентные белки имеют разные времена созревания, некоторые GeViS нужно больше времени в пост трансфекции. Например, пары FRET, содержащие mRuby2 в этом протоколе может занять больше времени, чтобы выразить так как созревание mRuby2 занимает значительно больше времени, чем Кловер 11. Флуоресценции как донора и акцептора должны быть проверены.

3. визуализации протокол Напряжение

  1. Выберите здоровую клетку с хорошим выражением мембраны
    1. Используя микроскопию, найти здоровую клетку (рис 4В), что показывает сильноеМембрана локализованы флуоресценции по сравнению с внутренней флуоресценции. Старайтесь не латать закругленные клетки. Круглые клетки либо деления или умирают, и их трудно исправить. Нанесите тестовый импульс 5,0 мВ по амплитуде и 5,0 мс по длительности, чтобы помочь последующих экспериментов локальной фиксации.
  2. Подготовьте камеру для визуализации напряжения
    1. После выбора ячейки для патч, поместите патч зажим пипетки над ячейкой. Доведите пипетки вниз, пока он слегка коснулась клеточную мембрану. На этом этапе необходимо соблюдать 1 МОм - 2 МОм рост сопротивления мембраны на зажиме исправление программного обеспечения 25.
      Примечание: Иногда, хороший гига-ом печать может произойти, просто прикасаясь к клеточную мембрану. Пока Giga-ом уплотнение является стабильной, она должна быть в порядке.
    2. Создание гига-ом печать, осторожно применяя отрицательное давление через пипетку. Набор потенциал пипетки на желаемом держащей потенциала.
    3. Сохраняя печать гига-ом, изображение ее клеток с помощью камеры высокой скорости CCD и сосредоточить его на площадь мембраны.
    4. Разрыв клеточной мембраны, применяя импульсы всасывания через рот или шприц осторожно, чтобы сделать всю конфигурацию 26 клеток.
    5. Изображение патч зажаты ячейку под всей конфигурации зажима клеток в соответствии с опытно-конструкторских с помощью обработки изображений
      1. Начало обработки изображений. Нажмите [приобретать] - меню [SciMeasure камеры], чтобы открыть страницу "CCD ACQUIRE '.
      2. Создать новый файл данных для сохранения изображений.
      3. Нажмите [Аналоговый выход], а затем [Читайте ASCII], чтобы открыть файл протокола импульса провести томографию. Нажмите на "средний внутренние повторений", если необходимо усреднить данные. Затем закройте страницу "Аналоговый выход".
        Примечание: Этот протокол импульса должна быть разработана и сохранена в виде файла '.txt' в соответствии с целью каждого эксперимента до этого шага.
      4. Набор конкретных AcquisПараметры ition со страницы 'CCD ACQUIRE. Входной конкретные значения для 'число кадров для приобретения »и« число испытаний ".
        Примечание: число кадров определяется скоростью сбора и сроках протокола подачи импульсов. Например, если изображения на частоте 1 кГц, 1000 кадров равна 1 сек времени записи.
      5. Нажмите [брать данные (оптика + BNC)], чтобы начать запись. В то время как изображения напряжение проходит, смотреть в окно осциллографа с помощью программного обеспечения патч зажим, чтобы обеспечить устойчивую конфигурацию Цельноклеточные всей записи.
        Примечание: Чтобы проверить реагировать диапазоном напряжения Gevi, размера сигнала в; F / значение F или временным разрешением на протяжении всего физиологического диапазона напряжения, провести целый напряжение ячейки зажим эксперимент с протоколом импульса ступив импульсов напряжения в диапазоне от -170 мВ до 130 мВ. Чтобы определить производительность Gevi в разрешении потенциалы действия вызвали из культивируемых примаRy нейроны, изображения клетка под конфигурации целой клетки токовых клещей.

4. Сбор данных

  1. Расчет; F / F
    1. Начало обработки изображений. Нажмите [FILE] - [Чтение данных файла], чтобы открыть файл данных для анализа. Заметим изображение клеток в его Отдых Интенсивность света (РЛИ) на правой стороне
      Примечание: Программное обеспечение усредняет первые 5 кадров, чтобы определить RLI записи.
    2. Нажмите на ссылку "показать BNC-« довести значений тока и напряжения, измеренные на экране.
    3. Изменение режима страницы из 'RLI раме' до 'Рамка вычитания ", чтобы использовать функцию рамки вычитания для идентификации пикселей с высокой скоростью отклика оптических сигналов. Это и есть истинная сила визуализации, так как каждый пиксель может быть проверены на предмет возможных изменений в флуоресценции.
    4. Выберите два временных точек (F 0 и F 1) для вычитания. Определить, в каком районе клеткипоказывая сигналы, реагирующие на мембранный потенциал изменения.
      Примечание: SNR для кадров вычитания изображений может быть улучшено путем выбора нескольких фреймов для каждой точки времени, чтобы временно усреднения сигнала. Программное обеспечение вычитает среднее интенсивность света, взятую из выбранных кадров и вычисляет значения F 1 -F 0 (; F). Обычно один выбирает часовой точку, приобретенного в ходе холдинг потенциалом и другой момент времени, принятым в период стимуляции.
    5. Назначить пиксели, которые должны быть проанализированы с помощью перетаскивания или нажав каждый пиксель с компьютерной мышью. Обратите внимание на графическое представление средней интенсивности флуоресценции из выбранных пикселей на левой стороне окна программного обеспечения. Рисунки 4B & 5B показывают репрезентативные изображения из анализа кадра вычитания.
    6. Разделите вычитается пикселей по RLI (F 0). Нажмите [Разделить по RLI,] приобретать значения; F / F
  2. Экспорт данных
      Рассчитать значения; F / F для каждого шага напряжения дальнейшего анализа напряжения свойства Gevi в зондирования. Используйте эти значения для рисования графиков, такие как; F / F по сравнению с напряжением на последующих данных анализов.
  3. Удалить тока и напряжения графики по unclicking меню "Показать BNC-». Перейти к [ВЫХОД] - [Сохранить трасс, как показано (ASCII)], чтобы экспортировать флуоресценции след в формате файла ASCII для подбора кривой анализа стандартным программным обеспечением графиков.

Анализ 5. Данные

  1. Напряжение зондирования собственностью Gevi
    1. Draw изменение флуоресценции от напряжения графике (FV), откладывая значения; F / F от напряжения в программе анализа данных. Кривую по функции Больцмана (таблица 2), чтобы определить диапазон напряжений оптического сигнала, нажав [Анализ] - [Место] - [сигмоидального нужным] - [Открыть диалоговое], а затем выберите функцию Больцмана.
      Примечание: Установка для функции делает его possiblе охарактеризовать свойства зондирования напряжения различных зондов напряжения или сравнить свои выступления в различных клетках. Функция Больцмана может быть использован для зондов, испытанных в данной работе, поскольку кривые FV из этих зондов показывают сигмоидального шаблон.
    2. Нормализация каждое значение; F / F, используя начальные и конечные значения (А 1 и А 2) вычисляется с помощью функции.
      Примечание: В уравнении Больцмана, минимальная составляет A 1 и максимум в 2. Для нормализации, используйте редакторы электронных таблиц программного обеспечения для настройки значений; F / F, определив 1 в качестве нуля и А 2 в качестве одного. Средние значения нормированы; F / F и рассчитать стандартную ошибку для статистического анализа.
    3. Replot нормированной; F / F значения в сравнении с напряжением, как описано ранее в разделе 5.1.1).
  2. Скорость оптического отклика
    1. Откройте файл ASCII приобретенные с шага 4.2.2) с анализом данныхПрограмма и построить след; F / F в зависимости от времени.
    2. Нажмите на кнопку 'селектор данных "в программном обеспечении анализа данных и выберите один момент времени, соответствующий началу ступенчатой ​​импульса напряжения и второй момент времени, когда оптический сигнал достиг устойчивого состояния. Установить этот диапазон как к одинарной и двойной экспоненциальной функцией затухания, нажав [Анализ] - [Место] - [Экспоненциальный нужным] - [Открыть диалоговое], и выбрать экспоненциальную функцию затухания. Сообщить лучшую подгонку.
      Примечание: По прилегающие к одинарные или двойные функции экспоненциального затухания, количественные постоянные времени, представленные т могут быть приобретены. Это поможет экспериментаторы сравнить кинетику их замеров с различными показателями напряжения. Флуоресценции след может показать быстрые и медленные компоненты, которые могут быть описаны с двойной функцией экспоненциального распада. В этом случае расчет приведет двух временных констант с различными амплитудами.
    3. Рассчитать тысе константы взвешенное Тпозволяют сравнить кинетику зондов, проявляющих два временных компонентов к зондов с одной компонентой.
      Примечание: Взвешенный тау рассчитывается как сумма т 1, умноженной на относительную амплитуду А 1, плюс т 2, умноженной на относительную амплитуду, A 2, как определено по следующей формуле; figure-protocol-2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Транзиторно трансфицированные клетки могут проявлять существенное изменение в интенсивности флуоресценции и степень экспрессии плазматической мембраны. Даже на той же покровным некоторые клетки будут иметь различные уровни внутреннего флуоресценции. Это наиболее вероятно из-за количества агентом трансфекции поглощенной клеткой. Иногда слишком много выражение заставляет клетку испытать развернутую реакцию белка, что приводит к апоптозу 27 (яркий, округлые клетки, с высоким внут...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нервная система использует напряжение несколькими различными способами, ингибирование вызывает небольшое гиперполяризации, синаптической вход вызывает небольшое деполяризацию и действие потенциальных результатов в относительно большом изменении напряжения. Возможность измерения изменения мембранного потенциала от GeViS предлагает многообещающий потенциал анализа нескольких компонентов нейронных цепей одновременно. В этом докладе мы демонстрируем основным методом изменения изображений в мембранного потенциала с использов...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана программой World Class Institute (WCI) Национального исследовательского фонда Кореи, финансируемой грантом Министерства образования, науки и технологий Кореи WCI 2009-003 и проектом институциональной программы Корейского института науки и технологий 2E24210. Сунму Ли был поддержан Глобальной программой стипендий для докторов философии (NRF-2013H1A2A1033344) Национального исследовательского фонда (NRF) при Министерстве образования (MOE, Корея).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Инвертированный микроскопOlympusIX71
60X объектив объектив (числовая апертура = 1,35)OlympusUPLSAPO 60XO
Возбуждающий фильтрSemrock  FF02-472/30Для визуализации напряжения суперэклиптики pHluorin в Бонгури
Дихроичное зеркалоSemrockFF495-Di03-25x36
Эмиссионный фильтрSemrockFF01-497/LP
75 Вт ксеноновая дуговая лампаCAIRNOptoSource IlluminatorСветодиоды и лазеры также являются эффективными источниками света
Медленная ПЗС-камераHitachiKP-D20BU
Двухпортовый адаптер камерыOlympusU-DPCAD
Высокоскоростная ПЗС-камераRedShirtImaging, LLCNeuroCCD-SM
Разветвитель изображенияCAIRNOptosplit 2
Возбуждающий фильтрSemrockFF01-475/23-25Для визуализации напряжения FRET пары на основе GEVI, состоящей из клевера и mRuby2)
Дихроичное зеркалоSemrockFF495-Di03-25x36
Фильтр излученияChromaET520/40
Дихроичное зеркалоSemrockFF560-FDi01-25X36
Фильтр излученияChromaET645/75
Система виброизоляцииKinetic systems250BM-IC, 5702E-3036-31
Камера для коммутацииWarner instrumentsRC-26G, 64-0235
#0 Micro Coverglass (22 x 40 мм)Электронная микроскопия Sciences72198-20
Регулятор температурыWarner instrumentsTC-344B
#0 (0,08 ~ 0,13 мм) - 10 мм диаметр стеклянного покровного стеклаTed Pella260366
липофекционного агентаLife Technologies11668-027
Реактив фосфата кальцияClontech - Takara631312
Усилитель патч-клещейHEKAEPC 10 USB усилитель
Многоканальный сбор данныхHEKAPatchmaster
Программное обеспечение для сбора и анализа изображенийRedShirtImagingNeuroplex
Spreadsheet прикладное программное обеспечениеMicrosoftMicrosoft Excel 2010
Программное обеспечениедля анализа данныхOriginLabOriginPro 8.6.0
ДеммагнификаторQioptiq LINOSOptem стандартный фотоаппарат Соединитель 0,38x SC38 J Зажим
Конфокальный микроскопNikonA1R Конфокальный микроскоп
Антивыцветающий реактивLife TechnologiesP36930

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246, 508-509 (1973).
  2. Cohen, L. B., et al. Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential. J. Membrane Biol. 19, 1-36 (1974).
  3. Tasaki, I., Warashina, A. Dye-membrane interaction and its changes during nerve excitation. Photochem Photobiol. 24, 191-207 (1976).
  4. Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5, 874-885 (2004).
  5. Jin, L., Han, Z., Platisa, J., Wooltorton, J. R., Cohen, L. B., Pieribone, V. A. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75, 779-785 (2012).
  6. Cao, G., Platisa, J., Pieribone, V. A., Raccuglia, D., Kunst, M., Nitabach, M. N. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154, 904-913 (2013).
  7. St-Pierre, F., Marshall, J. D., Yang, Y., Gong, Y., Schnitzer, M. J., Lin, M. Z. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nat Neurosci. 17, 884-889 (2014).
  8. Piao, H. H., Rajakumar, D., Kang, B. E., Kim, E. H., Baker, B. J. Combinatorial mutagenesis of the voltage-sensing domain enables the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential. J Neurosci. 35, 372-385 (2015).
  9. Jung, A., Garcia, J. E., Kim, E., Yoon, B. J., Baker, B. J. Linker length and fusion site composition improve the optical signal of genetically encoded fluorescent voltage sensors. Neurophoton. 2, 021012(2015).
  10. Dimitrov, D., et al. Engineering and characterization of an enhanced fluorescent protein voltage sensor. PLoS One. 2, e440(2007).
  11. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 1005-1012 (2012).
  12. Sung, U., et al. Developing fast fluorescent protein voltage sensors by optimizing FRET interactions. PLoS One. 10, e0141585(2015).
  13. Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Maclaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nat Methods. 9, 90-95 (2012).
  14. Flytzanis, N. C., et al. Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons. Nat Commun. 5, 4894(2014).
  15. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nat Methods. 11, 825-833 (2014).
  16. Gong, Y., Wagner, M. J., Zhong Li, J., Schnitzer, M. J. Imaging neural spiking in brain tissue using FRET-opsin protein voltage sensors. Nat Commun. 5, 3674(2014).
  17. Zou, P., et al. Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET. Nat Commun. 5, 4625(2014).
  18. Chanda, B., Blunck, R., Faria, L. C., Schweizer, F. E., Mody, I., Bezanilla, F. A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons. Nat Neurosci. 8, 1619-1626 (2005).
  19. Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108, 3147-3160 (2012).
  20. Weigel, S., Flisikowska, T., Schnieke, A., Luksch, H. Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices. J Neurosci Methods. 233, 28-33 (2014).
  21. Waters, J. C. Live-Cell Fluorescence Imaging. Methods in Cell Biology Volume 81. Sluder, G., Wolf, D. E. , Academic Press. 115-140 (2007).
  22. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  23. Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  24. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat Protoc. 1, 695-700 (2006).
  25. Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. 101-102 (2003).
  26. Osorio, N., Delmas, P. Patch clamp recording from enteric neurons in situ. Nat Protoc. 6, 15-27 (2010).
  27. Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annu Rev Biochem. 74, 739-789 (2005).
  28. Wilt, B. A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Photon shot noise limits on optical detection of neuronal spikes and estimation of spike timing. Biophys J. 104, 51-62 (2013).
  29. Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knopfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3, e2514(2008).
  30. Peterka, D. S., Takahashi, H., Yuste, R. Imaging voltage in neurons. Neuron. 69, 9-21 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Genetically Encoded Voltage IndicatorsFluorescent Voltage SensorsFRET based GEVISingle Fluorescent ProteinImage SplitterWhole Cell Patch ClampHEK293 CellsMembrane Potential ImagingFluorescence Change AnalysisCCD Camera Acquisition

Related Articles