Количественный Fundus автофлюоресценции для оценки заболеваний сетчатки

Краткое содержание

Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) поддерживает сенсорную сетчатку, перерабатывая побочные продукты зрительного цикла, которые накапливаются в виде липофусцина. Эти продукты являются автофлуоресцентными и могут быть качественно визуализированы in vivo. В данной статье мы описываем метод количественной визуализации липофусцина РПЭ с помощью конфокальной сканирующей лазерной офтальмоскопии.

Аннотация

Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) расположен рядом с вышележащей сенсорной сетчаткой и поддерживает функцию зрительной системы. Среди задач, выполняемых РПЭ, — фагоцитоз и обработка наружных сегментов фоторецепторов через органеллы, полученные из лизосом. Эти продукты распада, хранящиеся и называемые гранулами липофуссцина, частично состоят из бисретиноидов, которые имеют широкие спектры поглощения флуоресценции и излучения, которые могут быть клинически обнаружены как аутофлуоресценция глазного дна с помощью конфокальной сканирующей лазерной офтальмоскопии (cSLO). Накопление липофусцина связано с увеличением возраста, но также обнаруживается в различных проявлениях как при приобретенных, так и при наследственных дегенеративных заболеваниях сетчатки. Таким образом, изучение характера накопления и корреляция таких паттернов с изменениями в вышележащей сенсорной сетчатке имеют важное значение для понимания патофизиологии и прогрессирования заболевания сетчатки. Здесь мы описываем метод, используемый нашей лабораторией и другими лабораториями, который использует cSLO для количественной оценки уровня липофусцина RPE как в здоровых, так и в больных глазах.

Введение

Пигментный эпителий сетчатки глаза (ПЭС) поддерживает функцию сенсорной сетчатки через многочисленные процессы ^1. Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является наиболее важной причиной слепоты неизлечимой в промышленно развитых странах и характеризуется изменениями в ПЭС, включая потерю пигмента, потеря функции и атрофия. В AMD и при нормальном старении, ПЭС накапливает флуоресцентные, лизосом полученные органеллы, содержащие фрагменты фагоцитированы фоторецепторов, именуемых липофусциновых гранул. Накопление ПЭС липофусцина, как считалось, указывают на окислительные дисфункции ^1, но недавние исследования показали , что морфология РПЭ остается нормальным в возрасте от глаз с высокими уровнями липофусциновых ^2. Тем не менее, аномальные закономерности распределения липофусцина, в частности , потери липофусцина, являются документированные маркеры для AMD и AMD прогрессии, как гистологически и клинически ^3,4

Дефектные процеспеть РПЭ липофусцина также было показано, происходит в некоторых наследственных дегенерации сетчатки. Пациенты , страдающие от болезни Stargardt (STGD) накапливаются липофусцина в ПЭС в молодом возрасте, в конце концов развивается потеря зрения подобное тому , которое наблюдалось в ⁵ драмов. Эти результаты свидетельствуют о том , что накопление липофусцина само по себе может быть токсичным и привод RPE дисфункции ^6,7. Однако детальное изучение изображений предметов с STGD с течением времени не подтвердили , что накопление липофусцина фокусного привело к последующей потерей РПЭ ^8. Следовательно, хотя липофусциновых аномалии являются маркерами дегенерации сетчатки, роль для прямой токсичности липофусцина остается недоказанной.

ПЭС является наиболее задний слой клеток сетчатки, но генерирует большинство флуоресцентного сигнала от глазного дна. Генерация и обнаружение автофлуоресцентной (AF), полученный из ПЭС может быть выполнена с использованием сканирующей конфокальной лазерной офтальмоскопии (cSLO), что позволяет VIsualization пространственного распределения фундус AF. Некоторые дегенерации сетчатки глаза демонстрируют отличительные закономерности фундус автофокусировки и вспомогательные средства визуализации AF в диагностике и мониторинге этих условий. Хотя стандарт визуализации AF является клинически важным, количественная АФ (Каф) стала важным средством оценки состояния здоровья ППД. Мы и другие разработали стандартизированный подход , который может достоверно определить уровни Каф в определенных местах сетчатки глаза ^9. Каф имеет потенциальное применение в диагностике и мониторинг состояния сетчатки глаза, а также может иметь применение в прогнозе и риска стратификации. Кроме того, диагностические возможности Каф также были описаны для некоторых заболеваний сетчатки ^10-12. Здесь мы предлагаем пошаговый детали для выполнения нашей техники сопровождается наглядной демонстрацией его применения в оценке здоровых и больных глаз.

Протокол

Заявление по этике: Все пациенты, зарегистрированные в этих исследованиях было сделано в соответствии с утвержденным институциональным экспертным советом надзора на Нью-Йоркской школы медицины университета.

1. Отбор пациентов и начальной подготовки для работы с изображениями

Примечание: Следующие материалы необходимы: 0,5% офтальмологический раствор тропикамид, 2,5% офтальмологический раствор фенилэфрина, cSLO оснащен спектральной области оптической когерентной томографии (ОКТ-SD), и внутренним источником опорного напряжения флуоресценции.

1. До обработки изображений, надлежащим образом настроить cSLO для сбора данных в соответствии с инструкциями изготовителя.
2. Установите внутренний флуоресцентный ссылку в cSLO. Примечание: внутренний флуоресцентный ссылка, поскольку приобретенный у изготовителя, расположен в металлическом кольце и помещается непосредственно за объективом камеры. Если cSLO от другого производителя используется, может быть другая конфигурация, чем тот, который описан вэтот протокол.
   1. Для того, чтобы вставить ссылку в cSLO, крутить объектив, чтобы удалить его, открутить металлическое кольцо машины, и заменить его новым металлическим кольцом, содержащим ссылку.
      Примечание: внутренний флуоресцентный ссылка имеет важное значение для техники Каф, так как она позволяет коррекции для изменения мощности лазера и детектора чувствительности / усиления.
3. У пациентов, набранные для работы с изображениями пройти рутинную дилатационная обследование глаз и получить справочную информацию о прошлых глазном истории и основных медицинских условий, которые могут проявляться с глазными выводами.
4. Разбавить учеников с 0,5% тропикамид и 2,5% фенилэфрина. ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: Разбавить учеников не менее 6 мм. Примечание: Это очень важно для непрерывного прохождения света, и, таким образом, для оптимальной визуализации и измерения глазного дна.
5. До обработки изображений, установите пациента должным образом на cSLO, с подбородка на Chinrest, лоб помещается против forehead отдых, и боковые углах глаз правильно выровнен с индикаторами.

2. Базовый уровень визуализации глазного дна

1. Во-первых, изображение на глазном дне с ближней инфракрасной области спектра отражения (ИК) света (длина волны 820 нм), для того, чтобы централизовать камеру над макулы и получить грубый фокус.
   1. При правильном расположении пациента, включить настройку аппаратного обеспечения на панели управления в режиме ИК-изображения, положение камеры вручную до тех пор, пока фундус в полном фокусе, и сделайте снимок
   2. Отрегулируйте настройку на панели управления в положение "IR-ОСТ", которая использует спектрально-домен оптической когерентной томографии (SD-OCT) в сочетании с ИК-изображений для оценки макулы для основного заболевания.
   3. Используйте направляющие, присутствующие в окне изображения, чтобы правильно ориентировать ОКТ на ИК-изображении глазного дна. Для достижения оптимального SD-OCT качества, установите камеру таким образом, что Октябре изображение находится в верхней трети своего окна изображения. Приобретать по меньшей мере, одну горизонтальную линию СБНчерез ямки и охватывает все поле изображения.

3. Настройка Каф обработки изображений

1. Используйте "Высокая скорость" захвата изображения. Примечание: Этот параметр позволяет ускорить получения изображения, что снижает риск потери сигнала из-за движения пациента и в результате закупорки света радужной оболочки глаза или веки.
2. Используйте "Среднее" 9 кадров. Примечание: Эта настройка позволяет быстро, последовательного захвата 9 кадров изображения, которые могут быть впоследствии "усредненного" для снижения уровня шума и артефактов (см ниже).
3. Используйте поле "30 х 30 градусов". Примечание: Это относится к степени области сетчатки глаза захваченного во время захвата изображения.
4. До начала обработки изображений, предупредить пациента о голубом свете, так как это может вызвать тревогу в первую очередь.
5. Включите режим автофокусировки и выровнять ось камеры таким образом, что экран максимально "заполнен" фундус AF (минимальное потемнение сторон и углов изображения).
   1. Если пациенты чпр трудности терпимо относиться к ярко-синий свет, начать визуализацию с камерой подальше от глаз, а затем приблизить камеру медленно к пациенту, пока глазного дна не в полном виде.
      ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: Если свет, входящий в или выходящий из глаза затруднен, снижение сигнала приведет. Локализованные уменьшение видна как асимметричная потемнение в сторону изображения или угла. Обобщенная потеря сигнала наблюдается, когда движения глаз в одиночку препятствовать прохождению света.
6. Align камеру таким образом, что сигнал АФ находится на самом высоком уровне по всему полю. Цель для максимального сигнала, а не четкое изображение, однако они примерно соотносятся. Отрегулируйте фокусировку камеры, перемещая cSLO, чтобы изменить положение камеры либо вручную, либо с помощью офтальмоскопом джойстика.
7. Регулировка чувствительности / усиления таким образом, что фундус AF хорошо видна, но избежать чрезмерного насыщения. Во время захвата изображения, цветные пиксели, видимые в каждой внутренней ссылки (расположенный в верхней частиизображение) или на глазном дне указывают на перенасыщенность и, таким образом, потери сигнала.

4. Получение изображения

Примечание: Важнейший шаг: Цель в приобретении изображения должно быть, чтобы получить 2 высокого качества 9-кадров стеки изображений за один сеанс, чтобы контролировать изменчивость между изображениями в сеансе. После репозиции пациента и камеры, получить вторую сессию двух изображений для оценки и контроля за изменчивости. Все изображения, в конечном счете, калибруется по внутренним источником опорного напряжения (описано ниже).

1. Получение изображений только после того, как по меньшей мере 20 сек от "отбеливания" (полной экспозиции сетчатки к свету AF) , чтобы свести к минимуму поглощение света родопсина в сенсорной сетчатки ^9.
   1. Используйте этот период для оптимизации выравнивания камеры, фокус и чувствительность.
2. Есть предметы мигать перед каждым захвата изображения, как свежий слезной пленки улучшает качество сигнала.
3. Избегайте веки в плоскости приобретения.
   Примечание: Это может быть полезно, чтобы вручную открыть веки для более сложных пациентов. Авторы рекомендуют помощник выполняет эту задачу.
4. Оптимизация выравнивания перед каждым захвата изображения, чтобы гарантировать, что свет не перекрывается радужной оболочки приводит к снижению сигнала.
   Примечание: По крайней мере, незначительное движение является очень распространенным явлением, авторы рекомендуют тонкую перестройку по мере необходимости перед каждым получения изображения. Руководящий и поощрение пациента в то время как визуализация помогает уменьшить движение. Авторы также рекомендуют использовать ножной педали машины в качестве "кнопки приобретения" таким образом, чтобы свести к минимуму оператора отвлечение.
5. Выполнять обработку после изображения, вычислив "среднее" из стека 9-кадра, чтобы увеличить отношение сигнал-шум. Подсчитать среднее значение стека с использованием программного обеспечения cSLO, выбрав опцию для вычисления среднего значения.
   Примечание: Там может быть стеки , где некоторые кадры не оптимального качества (то есть, локализовали или обобщенными уменьшились сигнал относительно оптимальных кадров), поэтому внимательно осмотрите каждую стопку и снимите флажок неоптимальные кадров перед тем вычисления среднего значения.
   Примечание: Средние изображения с приемлемым соотношением сигнал-шум может быть обработан по крайней мере, 3-х кадров. Это нормально для сторон и углов каждого изображения, чтобы иметь более низкий сигнал, чем центральные 20 градусов из-за ограничений внутри самого cSLO.
   1. Если программа спросит , будет ли оператор хотел бы нормализовать уровни серого (то есть растянуть гистограмму) от 0 до 255, выберите "Нет". При этом сохраняется в неизменном виде серых уровней для анализа.

Анализ 5. Изображение

1. Анализ изображений AF , как описано ранее с использованием программного обеспечения для анализа изображений , разработанный для техники Каф (IGOR; ^9). Краткое описание типичного анализа изображений с помощью этого программного обеспечения приведена ниже.
   1. Загрузите программу Каф в IGOR и импортировать изображения (в формате .bmp), вывозимых сПрограммное обеспечение cSLO с соотношением сторон пикселей 768 х 768 (выходной параметр по умолчанию).
   2. Выберите изображение в раскрывающемся меню и начать анализ.
   3. Переставьте индикаторы калибровки на изображение таким образом, чтобы "перекрестье" залегают ямки и "кронштейн" граничащую оптический диск (эти показатели используются для масштабирования и расположите трансформирования). При правильной установке, использование программного обеспечения подсказок затем заполнить изображение с окружными трансформирования окружающих ямку (см рис 1, 2).
   4. Выберите опцию в IGOR для калибровки общих уровней серого каждого изображения на этих уровнях, присутствующих во внутренней флуоресцентной ссылки. Примечание: Этот шаг позволяет выполнять калибровку машинных факторов, связанных, в том числе электронного нулевого уровня каждого изображения и внутренний фактор опорного калибровки каждой машины, а также факторов, связанных с пациентом, включая возраст, рефракции и кривизны роговицы.
      Примечание: Программное обеспечение для анализа затем отображает фиксированный гegions на полученном изображении, и значение Каф демонстрируется в каждом регионе. Значения Каф также автоматически вводятся в формате электронной таблицы в отдельном окне ".
   5. Генерация Каф "тепловых карт", выбрав опцию в рамках командной строкой. Все изображения и данные могут быть экспортированы из программы ИГОРЯ в таблице первенствовать, выбрав соответствующие параметры.

Результаты

Этот метод был использован для изучения Каф как у здоровых ¹³ и болезненных состояний ^10-12. У здоровых глаз (рисунок 1), AF , излучаемый от ПЭС распределяется относительно равномерно по всему фундус (рис 1А). Снижение интенсивности наблюдается в центральной области макулы вследствие блокирования света макулярного пигмента, а по бокам и в углах изображения благодаря оптике глаза и камеры. Сосуды появляются темные и должны быть в чет...

Обсуждение

Аномальные РПЭ распределение липофусцина, является ли увеличиваться или уменьшаться, является чувствительным маркером заболевания сетчатки и, как правило, связана с потерей сенсорной функции сетчатки глаза. Здесь мы опишем применение Каф для оценки ПЭС липофусцина. Включение внутреннего флуоресцентного ссылкой для коррекции переменной мощности лазера и детектора чувствительности ⁹ наряду с нашей стандартизированной метод визуализации позволяет для надежной количественной оценки уровней AF. Это наша цель, что ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Spectralis HRA + OCT	Heidelberg Engineering
0,5% тропикамид офтальмологический раствор			Любая марка может быть использована
2,5% фенилэфрин офтальмологический раствор			Любая марка может быть использована
Внутренний флуоресцентный референс	Heidelberg Engineering
IGOR Pro программное обеспечение	WaveMetrics