Методическая статья

Создание "гуманизированные" Drosophila S2 клеточной линии Чувствительные к фармакологическим ингибирование Kinesin-5

DOI:

10.3791/53594

⸱

20 января 2016 г.

 , 
1Molecular and Cellular Biology Graduate Group, Biology Department, University of Massachusetts, Amherst

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает, как создать клеточную линию Drosophila S2, чувствительную к низкомолекулярным ингибиторам кинезина-5. Также описывается использование этих клеток в клеточном анализе коррекции ошибок.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кинетохоры — это большие белковые структуры, которые собираются на центромерах во время деления клеток и связывают хромосомы с веретенообразными микротрубочками. Правильное распределение генетического материала требует, чтобы сестринские кинетохоры на каждой хромосоме стали биориентированными, прикрепляясь к микротрубочкам от противоположных полюсов веретена, прежде чем перейти в анафазу. Тем не менее, ошибочные, небиориентированные состояния прикрепления являются распространенным явлением, и существуют клеточные пути как для обнаружения, так и для коррекции таких прикреплений во время деления клеток. Процесс, с помощью которого нарушаются неправильные взаимодействия кинетохора и микротрубочек, называется коррекцией ошибок. Для изучения коррекции ошибок в живых клетках путем химического ингибирования мотора кинезин-5 целенаправленно генерируются неправильные прикрепления, что приводит к монополярной сборке веретена, а после вымывания препарата наблюдается переход от неправильной ориентации к биориентации. Большое количество хромосом во многих типах клеток модельных культур тканей создает проблему для наблюдения за отдельными событиями коррекции ошибок. дрозофила Клетки S2 являются лучшими объектами для таких исследований, поскольку они обладают всего 4 парами хромосом. Тем не менее, низкомолекулярные ингибиторы кинезина-5 неэффективны против кинезина-5 дрозофилы (Klp61F). В этой статье мы описываем, как построить клеточную линию дрозофилы, которая эффективно заменяет Klp61F на кинезин-5 человека, что делает клетки чувствительными к фармакологическому ингибированию мотора и пригодными для использования в клеточном анализе коррекции ошибок.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Равное разделение генома во время деления клетки требует правильных взаимодействий между ДНК и репликации микротрубочек веретена. Микротрубочки физически взаимодействовать с хромосомами через ансамбль белков, которые собирает в центромерах известных как кинетохорах 1. Правильное распределение хромосом требует сестра кинетохоры которые с двойной ориентацией, в которой каждый сестра связано с микротрубочками, происходящих из противоположных полюсов шпинделя. Кинетохор микротрубочек (кт-МТ) вложения, которые не в двойной ориентацией конформации быстро и эффективно дестабилизирована, чтобы обеспечить возможность установить biorientation в процессе, известном как исправление ошибок. Исправление ошибок анализа, который ранее был создан в клетках млекопитающих 5 требует сборки монополярных шпинделей с помощью обратимых низкомолекулярные ингибиторы против EG5 (кинезин-5). Лечение наркотиками порождает множество ошибочных syntelic вложений, в котором ботч сестра кинетохоры приложить к тому же полюса веретена. Последующее смыв препарата позволяет визуализации процесса коррекции ошибок. Исправление ошибок анализ может быть сделано в присутствии низкомолекулярные ингибиторы или нокдаун для изучения вклада кандидатов белков к исправлению ошибочных вложения кт-МТ.

Возможность визуализировать исправление ошибок в живых клетках является мощным инструментом для дальнейшего понимания молекулярного механизма, участвующих в этом сложном процессе. Тем не менее, большое количество хромосом, присутствующих в большинстве клеточных линий представляет собой вызов в наблюдении отдельных вложения кт-MT. Дрозофилы S2 клетки будут идеально подходит для применения коррекции ошибок анализа, поскольку они содержат всего лишь как 4 хромосомы 6, но низкомолекулярные ингибиторы кинезин 5, такие как S-тритил-L-цистеина (STLC) и monastrol 7-9 не влияет шпинделя в сборе или кинезин-5 моторную функцию в клетках дрозофилы. Поэтому мы родыТед клеточная линия дрозофилы S2 выражения человеческого кинезин-5 под индуцируемого промотора, чувствительного к кинезин-5 ингибиторов. Этот протокол описывает, как нокдаун эндогенной дрозофилы кинезин-5 гомолог, Klp61F, и использовать эту линию клеток в клеточной основе коррекции ошибок анализа.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. трансфекции Клетки S2

  1. Из ранее культивируемых 25 см 2 колбу, добавляют GFP-альфа-тубулина, экспрессирующих S2 клетках 10 до конечного объема 2 мл на 100% слияния, и дать им возможность полу-прилипать к нижней части 35 мм блюдо культуры ткани для приблизительно 1 ч.
  2. Выньте носители из чашки. Трансфекции 2 мкг Eg5-mCherry построить 11 с 1 мл среды Шнайдера с добавлением 10% FBS (далее обозначается как средства массовой информации Шнейдера), и реагента для трансфекции, в соответствии с протоколом производителя. Печать блюдо с парафильмом и инкубировать клетки при 25 ° С в течение 16-18 ч.
  3. Добавить 1 мл СМИ Шнайдера. Возврат клеток до 25 ° С инкубатор.
  4. На 3 день после трансфекции, передать 500 мкл трансфицированных клеток в новой 35 мм ткани блюдо культуры, содержащий 1,5 мл СМИ Шнайдера для индукции испытаний. Индуцируют экспрессию Eg5-mCherry, добавив CuSO 4 до конечной концентрации 500 мкМ. Печать блюдо в парафильмом и инкубировать при 25 ° CO / N.
  5. Для того, чтобы покровные A-покрытием Конканавалин, пипетки достаточно объемные конконовалина раствор (0,5 мг / мл, растворенный в H 2 O), чтобы покрыть кислота мыть покровное, удалить избыток, и позволяют покровное высохнуть на воздухе.
  6. Поместите 22 мм х 22 мм конканавалин покровное A A покрытием в чистом 35 мм блюдо культуры ткани, а затем 500 мкл семян на 100% слияния индуцированных клеток на покровное и позволяют клеткам придерживаться в течение 1 часа при комнатной температуре.
  7. Для проверки выражения Eg5-mCherry, собрать покровное в розовом камеры (или соответствующий изображения судна) со средствами массовой информации для визуализации при комнатной температуре на флуоресцентного микроскопа. Используйте соответствующие источники света и наборы фильтров для визуализации клеток. Например, микроскоп используется в данном исследовании обладает светодиодной источник белого света и EGFP (FITC / Су2) и Dsred (TRITC / Су3) фильтр кубов. Eg5-mCherry локализуется в микротрубочек и обогащается NEAг шпинделя полюса.
  8. Убедившись, что клетки экспрессируют как EG5-mCherry и GFP-альфа-тубулина, передавать остаток трансфицированных клеток, неиндуцированных к 25 см 2 культуре ткани колбу, содержащую 4 мл среды Шнайдера.
  9. Добавить бластицидин S НСl при конечной концентрации 25 мкг / мл в колбу трансфицированных клеток и продолжают расщепление в присутствии 25 мкг / мл бластицидин S HCl до гибели клеток не перестает быть уверены, чтобы проверить на экспрессию Eg5-mCherry периодически. Выдержите клеточных линий в 25 ° C инкубатора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: процент клеток, экспрессирующих Eg5-mCherry увеличивается с течением времени.
  10. После клетки, стабильно трансфицированные, по-прежнему разделены в отсутствие лекарства и заморозить 12 клеток для использования в будущем.

2. РНК-интерференция

  1. ПЦР амплификации ~ 500 б.п. область Klp61F из кДНК (LD15641) с использованием праймера с добавлением Т7 промотора (последовательность предоставленной в список материалов),используется в качестве матрицы для синтеза дцРНК.
    1. Установите четыре ПЦР реакции, 50 мкл каждый, содержащие 100 нг матричной ДНК, 25 мкМ каждого праймера, соответствующего буфера, и полимеразы. Установите протокол ПЦР на амплификаторе в соответствии с протоколом производителя полимеразной из отдела.
    2. Бассейн и чистые четыре ПЦР реакции с использованием ПЦР очистить комплект в соответствии с протоколом производителя. Хранить чистый шаблон при -20 ° С.
  2. Подготовка двухцепочечной РНК (дцРНК) из шаблона, используя набор транскрипции Т7 РНК, следуя инструкциям изготовителя. Ожидать ~ концентрацию 5-15 мг / мл дцРНК. Хранить дцРНК при -20 ° С.
  3. Чтобы Knockdown Klp61F с дцРНК, позволяют S2 клетки, экспрессирующие EG5-mCherry на 25% слияния на полу-прилипать к нижней части 35 мм чашки для культивирования тканей в течение 1 часа.
  4. Удалить носитель из блюд и добавить 5 мкг дсРНК против Klp61F (Drosophila кинезин-5), разбавленный в 1 мл сыворотки Шнайдер "с СМИ.
  5. Выдержите при комнатной температуре в течение 1 часа, затем добавить 1 мл СМИ Шнайдера с 10% FBS. Инкубируйте клетки при 25 ° С.
  6. 24 ч после обработки дцРНК, индуцируют экспрессию Eg5-mCherry добавлением CuSO 4 до конечной концентрации 500 мкМ. Инкубируйте клетки при 25 ° С в течение еще 24 ч.

3. живых изображений сотовый

  1. Поместите 22 мм х 22 мм Конканавалин покровное покрытием в чистую 35 мм блюдо культуры ткани.
  2. Семенной 500 мкл клеток, которые были обработаны с дцРНК и индуцированных O / N на покровное покрытием конканавалин А и позволить им следовать в течение приблизительно 1 ч.
  3. Соберите покровное в розовом камеры (или соответствующий сосуд) для визуализации.
  4. Найти митотических клеток, экспрессирующих как EG5-mCherry и GFP-альфа-тубулина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: делящихся клеток, экспрессирующих GFP-только альфа-тубулина должны монополярных шпинделей, так как Klp61F, который необходим для шпинделя биполярности, сбит 10,13,
  5. Соберите покадровой изображения биполярных веретен (например, 1 кадр в минуту) в клетках, экспрессирующих как EG5-mCherry и GFP-альфа-тубулина.
  6. В то время как изображения, извлекайте носитель из роз камеры, и заменить его со средствами массовой информации, содержащий Шнайдера 1 мкм STLC в течение 3 последовательных обменов СМИ (~ 5 мл всего) в камере для визуализации крах шпинделя.
  7. Для вымывания препарата и обратить вспять крах шпинделя, тщательно удалить STLC содержащих носители из роз камеры, и мыть в СМИ Шнайдера 4x (всего 6-8 мл) перед заправкой роза палату в последний раз свежей средой. Продолжить изображений.

4. Коррекция ошибок Анализ

  1. Поместите 22 мм х 22 мм с покрытием Конканавалин покровные в чистые 35 мм чашках для тканевых культур.
  2. Семя 500 мкл клеток, которые были обработаны с Klp61F дсРНК на покровное покрытием конканавалин A и позволяют им придерживаться.
  3. После клеток ADHERред добавить 1,5 мл среды Шнайдера в каждую чашку, чтобы довести до конечного объема до 2 мл.
  4. Чтобы задержать клетки в митозе, добавить MG132 до конечной концентрации 10 мкМ каждого из блюд, и инкубируют в течение 1 часа.
  5. Добавить 1 мкм STLC и инкубировать в течение 1 часа, чтобы дать монополи в форме.
  6. Промыть STLC путем промывки 3x покровные 2 мл свежей среды Шнайдера каждый раз.
  7. Выдержите покровные со СМИ Шнайдера в дополнение к любым фармакологических препаратов (например, ингибиторы киназы Aurora) или ДМСО в качестве контроля.
    Примечание: концентрации ингибитора изменяются и соответствующие конечные концентрации должны быть определены экспериментатором. Исходные растворы обычно изготавливают таким образом, что ингибитор разводили 1: 1000 в средствах массовой информации. В этом случае разведение 1: 1000 (ДМСО или подходящем растворителе) служит контролем-носителем. Мы используем B ингибитор Аврора Binucleine 2 при конечной концентрации 40 мкМ.
  8. Fix клетки в различные моменты времени TО наблюдать прогрессирование формирования биполярного веретена и оценить крепления кинетохор государства. Исправить:
    1. Быстро промойте покровные с 2 мл 1x BRB-80.
    2. Исправление клетки добавлением 2 мл 10% параформальдегида, разведенного в 1x BRB-80 в течение 10 мин. Внесите параформальдегиде тщательно в химической капотом.
    3. Проницаемыми клеток по 2 мл PBS + 1x 1% Triton-X в течение 8 мин.
    4. Промыть 3 раза скользит по 2 мл PBS + 1x 0,1% Triton-X.
    5. Передача покровные клетки стороны лицом вверх на лист парафильмом (использовать маркер, чтобы пометить парафильм надлежащим образом следить за слайдов) в 150 мм чашки Петри.
    6. Обложка покровные с 150 мкл сыворотки осла вареные (BDS) и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа, чтобы блокировать неспецифическую связывания антитела.
      Примечание: Здесь, протокол фиксации может быть остановлен будет продолжено на более позднем этапе. Покровные могут быть сохранены в камере влажности при температуре 4 ° С в течение до 24 часов. Для того, чтобы камеру влаги, выравнивают обод 150 мм блюдос мокрой лаборатории протрите и покройте блюдо крышкой на Петри.
    7. Удалить блок, и инкубируют покровные в течение 1 часа при комнатной температуре с 150 мкл первичных антител разводили надлежащим образом в BDS для окрашивания для кинетохорами и микротрубочек до конечных концентраций 2 мкг / мл (или в соответствии с рекомендациями производителя) и 1 мкг / мл, соответственно ,
      Примечание: Здесь, протокол фиксации может быть остановлен будет продолжено на более позднем этапе. Покровные могут быть сохранены в камере влажности при температуре 4 ° С в течение до 24 часов.
    8. Промыть покровные 3x 500 мкл 1X PBS + 0,1% Triton-X.
    9. Инкубируйте покровные в течение 30-60 мин при комнатной температуре с соответствующим флуорофора-сопряженных вторичными антителами разводят в BDS.
    10. Промыть покровные 3x 500 мкл 1X PBS + 0,1% Triton-X.
    11. Инкубируйте покровные 150 мкл, содержащих BDS 1 мкг / мл DAPI конечной концентрации в течение 5 мин.
    12. Вымойте покровные 2x с PBS 1x + 0,1% Triton-X, и смонтировать Coverslips сторона ячейки вниз на 3x1 "слайд с 8 мкл монтажа средств массовой информации. Краска углы ногтей, чтобы обездвижить покровные на слайды.
  9. Клетки Изображение с биполярным шпинделей, которые, выражающих EG5-mCherry. Возьмите Z серии, состоящей из 30 самолетов на 0,2 мкм интервалы во всех каналах, используя цель 100X. Тщательно проанализировать кинетохоры и микротрубочки, чтобы определить, крепежные состояния (с двойной ориентацией или syntelic вложения).

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klp61F требуется для формирования биполярных веретен. Человек кинезин-5, Eg5, может спасти функцию Klp61F в дрозофилы S2 клетках (рис 1а и D). При добавлении кинезин-5 ингибитор (STLC), микротрубочки связаны уровни падения двигателя (рис 1B и E), и обвалов шпинделя, в результате монополя (рис 1С и F) в клетках не хватает эндогенного Klp61F после успешного РНК-интерференции (Справочная фильм 1). Следует отметить, что биполярные веретена разрушаться при добавлении STLC в гуманизированных клеток S2, поскольку кинезин-5 Активность не требуется для поддержания шпинделя двуполюсность в клетках человека. Это интересно расхождение может быть результатом различий в межполюсном микротрубочек перекрытия и / или стабильности в двух модельных систем 14. Кинезин-5 Ингибирование (фиг.2А и Е) может быть rêve rsed вымывая препарат и восстановление биполярной шпинделя может следовать в течение долгого времени. После удаления ингибитора (рис 2B и F), Eg5-mCherry повторно ассоциируется с микротрубочками как биполярный шпинделя сборок (рис 2С и G), и клетки могут развиваться в биполярный анафазе (рис 2D и H, Справочная фильм 2 ).

figure-results-1
Рисунок 1. Добавление 1 мкМ STLC приводит к монополярной шпинделей в дрозофилы S2 клеток. Представитель изображения с покадровой визуализации ячейки дрозофилы S2, выражающей Eg5-mCherry (AC) и GFP-альфа-тубулина (DF) в течение того 1 мкм STLC. Eg5 ингибитор был добавлен в 3 мин. Масштаб бар = 5 мкм. Отметка = мин: сек. w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. биполярного веретена реформы при удалении STLC. Типичные изображения из покадровой визуализации в дрозофилы 2 клетки, экспрессирующие EG5-mCherry (AD) и GFP-α-тубулина (EH) во время эксперимента STLC вымывания. STLC промывают на 5 мин. Биполярного реформы шпинделя в пределах 1 часа от удаления STLC. Масштаб бар = 5 мкм. Отметка: мин.: Сек Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov "целевых =" _blank "> Справочная Фильм 1. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы скачать). флуоресценции изображений с широким полем зрения представительной например клетки дрозофилы S2, выражающей EG5-mCherry ( слева) и GFP-α-тубулина (справа). 1 мкМ STLC был добавлен в 2 мин, а формы шпиндель монопольный течение 10 мин после добавления ингибитора. Изображения были получены каждые 1 мин и играл в размере 10 кадров в секунду. Масштаб бар = 5 мкм.

figure-results-4
Справочная Фильм 2. (щелкните правой кнопкой мыши, чтобы скачать). Флуоресценции Широкопольный изображений представительного например клетки дрозофилы S2, выражающей EG5-mCherry (слева) и GFP-альфа-тубулина (справа). Медиа содержащие 1 мкм STLC удаляли ипромыть в 5 мин. Биполярного реформы шпинделя в пределах 1 часа удаления ингибитора. Изображения были получены каждые 1 мин и играл в размере 10 кадров в секунду. Масштаб бар = 5 мкм.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация коррекции ошибок является ценным методика исследования этапы в этом важном и сложном процессе клеточного. Чтобы сделать это, ошибочные вложения генерируется с использованием обратимыми ингибиторами, и исправление ошибок наблюдается при вымывания препарата. Этот анализ был первоначально разработан с использованием ткани млекопитающего культуры клеток 5. Однако наличие большого числа кинетохорами во многих модельных типов клеток млекопитающих представляет собой вызов в наблюдении отдельных событий коррекции ошибок. Дрозофилы S2 клетки обладают, как мало, как 4 пары кинетохорами, что делает их более предпочтительным клеточную линию для наблюдения коррекции ошибок. Однако основным недостатком является то, что многие ингибиторы неэффективны в Drosophila S2 клетках. Таким образом, способность генерировать гуманизированного клеточную линию клетки Drosophila S2, экспрессирующих человеческий кинезин-5 представляет собой ценный инструмент для изучения коррекции ошибок.

Хотя дрозофилы S2 клетки могут бытьлучше клеточной линии для изучения коррекции ошибок, несколько шагов, участвующих в получении клеточной линии и сбить существенные гены создает некоторые проблемы в этой технике. Например, эффективность трансфекции может быть достаточно низким. Если менее 20% клеток выражают EG5-mCherry, трансфекции следует повторить, как процесс отбора будет длиться дольше. Кроме того, процент клеток, экспрессирующих обе флуоресцентные белки могут уменьшаться с течением времени. Эту проблему можно решить путем разделения клеток в присутствии бластицидин S HCl и гигромицина, чтобы выбрать для клеток, экспрессирующих EG5-mCherry и GFP-альфа-тубулина, соответственно. Важно также отметить, что дрозофилы S2 клетки имеют ортологи на многие белки человека и, Поэтому, важно, чтобы оптимизировать нокдауна условия для эндогенных белков. Оптимальные условия могут варьироваться нокдаун в размере дцРНК и продолжительности лечения. Учитывая появление и быстрое улучшение CRISPR-Cas9 TECHNOLOGIES 15-17, генерация клеточной линии Drosophila с геном Klp61F заменен человека EG5 представляет мощную альтернативу, которая бы преодолеть ограничения трансфекции и бросовой подхода. Наша работа показывает, что муха к человеку замены гена должны быть жизнеспособным вариантом в этом случае, хотя необходимые реагенты, чтобы сделать это в дрозофилы S2 клеток в настоящее время разрабатываются.

Эта процедура не ограничивается EG5, но могут быть применены для изучения функции других белков, представляющих интерес. При использовании ингибиторов, которые ранее были установлены, чтобы быть неэффективным в дрозофилы S2 клеток, этот протокол может быть изменен, чтобы изучить прямое действие ингибиторов в живых клетках без озабоченности мимо ворот эффектов. Клеточная линия, полученные с использованием этого протокола, также могут быть использованы в высокопроизводительного скрининга анализа для идентификации потенциальных лекарств, направленные белки, участвующие в коррекции ошибок.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Патрицию Уодсворт за дар от кинезин-5 конструкции. Эта работа была поддержана грантом NIH в (5 R01 GM107026) для TJM и научно-исследовательский грант № 5-FY13-205 от марта Dimes фонд в TJM, а также поддержки со стороны Чарльза Х. Гуд Foundation, Inc., Бостон, Массачусетс. чтобы TJM

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Эффективный реагент для трансфекцииQiagen301425
Klp61F кДНКDrosophila Genomic Resource Center13690Название гена LD15641
Schneider' s MediaInvitrogen21720-024
Фетальная бычья сыворотка, сертифицированнаяInvitrogen10082-147Термоинактивированная, происхождение из США
Сульфат меди (II) (CuSO4)SigmaC8027-500G500  mM стоковый
S-тритил-L-цистеинSigma164739-5G1  Сток mM в DMSO
Blasticidin HClInvitrogenR210015  мг/мл в 1x PBS
Гигромицин BИнвитроген10687010
T7 Система производства крупномасштабной РНКPromegaP1320Приблизительная концентрация дцРНК в каждой реакции составляет около 5-15  &микро; g/µ l
Klp61F RNAi F праймерInvitrogenTAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA
Klp61F RNAi R праймерInvitrogenTAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC
PCR набор для очисткиMo Bio Laboratories, Inc1250
Concanavalin ASigmaC52750.5  мг/мл раствора путем растворения в 1x PBS.
Сыворотка отварная ослицаJackson ImmunoResearch Labs017-000-1215% исходный раствор в 1х буфере PHEM, раствор довести до кипения. Хранится в 4  °C.
Монтажные материалы20  mM Tris pH 8,0,  0,5% <эм>н-пропилгаллат, 90% глицерина. Хранится в 4  °C.
1x BRB-8080 мМ ТРУБКИ pH 6,9; 1  mM EGTA; 1 мМ MgCl2
Белый источник светаLumencor Inc
ET EGFP Filter CubeChroma 49002
DSRed Filter CubeChroma49005
анти-NDC80 антитела Изготовлено на заказ лабораторией Maresca
DM1α (анти-&альфа;-тубулин)SigmaT6199
анти-CID-антителоAbCamab10887

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheeseman, I. M., Desai, A. Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 33-46 (2008).
  2. Maresca, T. J., Salmon, E. D. Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal. J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).
  3. Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146, 568-581 (2011).
  4. Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors. Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).
  5. Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division. Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).
  6. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
  7. Learman, S. S., et al. NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site. Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).
  8. Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms. J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).
  9. Maliga, Z., Mitchison, T. J. Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol. BMC Chem Biol. 6, 2(2006).
  10. Goshima, G., Vale, R. D. The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line. J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).
  11. Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. Development of a Drosophila cell-based error correction assay. Front Oncol. 3, 187(2013).
  12. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
  13. Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos. Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).
  14. Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells. Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).
  15. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  16. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
  17. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat Methods. 10, 957-963 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Drosophila S25KLP61FEg5 mCherrySTLC

Похожие статьи