Этот протокол описывает, как готовить и выполнять электрофорез с захватом жидкой фракции с гелевым покрытием (CN-GELFrEE), нативный метод разделения нековалентных биомолекулярных сборок и белков из гетерогенных образцов, совместимый с различными методами анализа белков ниже по потоку.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
CN-GELFrEE - Clear Native гель-элюированный жидкая фракция Entrapment электрофорез
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Белковые комплексы выполняют множество важных клеточных функций. Выяснение их нековалентных взаимодействий и динамики имеет первостепенное значение для понимания роли комплексов в биологических системах. В то время как прямая характеристика биомолекулярными узлов приобретает все большее значение в последние годы, отечественные методы фракционирования, которые совместимы с ниже по течению методов анализа, в том числе масс-спектрометрии, которые необходимы для дальнейшего расширения этих исследований. Тем не менее, поле не хватает высокой пропускной способности, широкий ассортимент, высокое восстановления метод разделения для нативного белка сборок. Здесь мы приводим четкую нативный гель-элюированный жидкая фракция экстрагирующее электрофорез (CN-GELFrEE), который является новым модальность разделения для нековалентных белковых агрегатов. эффективность разделения CN-GELFrEE была продемонстрирована ректификационных комплексов, извлеченных из сердца мыши. Фракции собирали в течение 2 ч и отображаются дискретные полосы в диапазоне от ~ 30 до 500 кДа. мошенникнаблюдалась последовательны модель увеличения ширины полосы молекулярного веса, каждый в пределах ~ 100 кДа. Кроме того, последующее переанализ родных фракций с помощью SDS-PAGE показал молекулярной массы сдвигает в соответствии с денатурации белковых комплексов. Поэтому, CN-GELFrEE было доказано, чтобы предложить возможность выполнять с высоким разрешением и высокой восстановления родные разделений на белковых комплексов из большого диапазона молекулярной массы, обеспечивая фракции, которые совместимы с белком анализа вниз по течению.
Введение
Большинство биологических процессов , происходящих в клетке , как полагают, осуществляется с помощью белковых агрегатов , а не единичных белков 1. Следовательно, для того , чтобы выяснить специфическую биологическую роль субъединицы белка в клетке, необходимо понимать его структурные взаимодействия с другими белками или лигандов в комплексах 2. Тем не менее, изучение белков изначально, поддерживая их нековалентных взаимодействий и активность, остается сложной. Одним из недостатков нативных изучения белков является подходящим нативный метод разделения, который совместим с различными методами вниз по течению анализа белков. Поэтому в последнее вре....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: Это видео протокол основан на соответствующей публикации 9. Конкретные реагенты, материалы и оборудование, необходимое для выполнения всех шагов, описанных в данном протоколе, перечислены в разделе материалов. Рецепты и информация для подготовки всех необходимых решений детализированы в таблице 1.
1. Заливка градиента Гели для труб
- Сборка литейной системы
- С помощью пламени обогревом лезвия бритвы или скальпель, вырезать 20 мл серологической пипеткой вдоль ортогональной секции 10 см от верхней части наконечника раздаточного. Убедитесь в том, что поверхность среза гладкая. Держите ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
200 мкг белков, экстрагированных из криогенным сердца земля мыши фракционировали изначально на 14 фракций по 150 мкл каждая, с использованием метода CN-GELFrEE в 1-12% туба Т гель. Аликвоту 10 мкл каждой фракции был подвергнут анализу на геле слябов CN-PAGE и окрашивали серебром. Четкое изображение фракционирования и разрешения , полученного с CN-GELFrEE фракционирования показано на рисунке 2А. Фракции собирали в течение двух часов, и анализ геля показывает последователь.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
CN-GELFrEE происходит от родной ясно (CN) СТР буферной системы , которая использует смесь анионных и нейтральных моющих средств в качестве молекул - носителей 9 для молекулярной массы на основе фракционирования белков через матрицу геля. Применение CN-GELFrEE к родному экстракта белка мыши сердца генерируется низкие фракции сложности с дискретными полосой пропускания при сохранении нековалентных взаимодействий биомолекул сборок. Сравнение фракций между CN-PAGE и восстановителей для SDS-PAGE гелей показал сляб.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Кек фонд WM любезно предоставили финансирование для этой работы. Этот материал основан на работе, поддержанной исследовательского гранта FAPERJ 100,039 / 2014 от правительства Рио-де-Жанейро - Бразилия для RDM, науки без границ науки +88888,075416 / 2013-00 от координации по улучшению высшего образования персонала, при правительстве из Бразилии, HSS, Национальный научный фонд стипендий Магистратура исследований в рамках стипендий номером 2014171659 для ОСС, и исследовательский грант CNPq 202011 / 2012-7 от правительства Бразилии для LHFDVPCH является получателем химии северо-западного университета жизненных процессов института Постдокторское Присуждение стипендий.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Реагенты | |||
| 30% раствор акриламида/биса, 37,5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | Этот раствор нейротоксичен. |
| 6-аминогексановая кислота (ε-аминокапроновая кислота) | Sigma-Aldrich | A2504 | Это химическое вещество является раздражителем. |
| Персульфат аммония (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | Это химическое вещество является легковоспламеняющимся, токсичным и коррозионным. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | Это химическое вещество является раздражителем. |
| Этиленгликоль тетрауксусная кислота (EGTA) | FLUKA | 3777 | Это химическое вещество токсично. |
| Этилендиамин тетрауксусная кислота (ЭДТА) | Fisher Scientific | BP120 | Это химическое вещество токсично. |
| Глицерин | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| имидазол | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Жидкий азот | Любой поставщик | н/д | Хранение жидкого азота в контейнерах<бр/> предназначенных для низкотемпературных жидкостей <бр/> |
| Мышиное сердце | Биорекультивация ООО | МСЭ-ХАРТ | |
| н-бутанол | Фишер Сайентификал | 71-36-3 | Это химическое вещество легковоспламеняющееся и токсичное. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Коктейль ингибитора протеазы | Thermo Fisher Scientific | 78430 | Это химическое вещество токсично. |
| Дезоксихолат натрия | Sigma-Aldrich | 30970 | Это химическое вещество является раздражающим веществом. |
| Сахароза | JTBaker | 4097 | |
| тетраметилэтилендиамин (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | Это химическое легковоспламеняющееся и раздражающее вещество. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Оборудование | |||
| Градиентный смеситель | Hoefer | SG15 | |
| Магнитный смеситель | Любой поставщик | н/д | |
| Магнитные стержни | Любой поставщик | н/д | Достаточно маленький, чтобы поместиться внутри камер смесителя gradiet. |
| Источник питания | Bio-Rad | 164-5056 | Напряжение до 1 500 В |
| Охлаждаемая центрифуга | Eppendorf | 022622552 | До 15 000 г |
| <сильный>Материалы | |||
| 15 мл Коническая трубка | Любой поставщик | н/д | |
| Ультрацентробежный фильтр 30 кДа-MWCO | Миллипоры | UFC503096 | |
| Гибкие трубки | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Длина около 1 м |
| Ведро для льда | Любой поставщик | н/д | |
| Жидкостный/воздушный металлический или пластиковый клапан. (например клапан рычага управления потоком воздуха/воды в аквариуме) | Любой поставщик | н/д | Аквариумные клапаны совместимы. |
| Ступка и пестик | Любой поставщик | н/д | |
| Родная СТРАНИЦА 3-12% Т слэб гель | Инвитроген | BN1003 | |
| Парапленка | Бемис | PM-996 | |
| чашка | Петри Фишер Научный | 08-757-13 | |
| Белок низкосвязывающийся тюбик 1,5 ml | Eppendorf | 022431081 | |
| Бритвенное лезвие | IDL Tools | TE05-091C | |
| Трубка для диализа регенерированной целлюлозы 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE слэб гель для любого kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Серологические пипетки (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Шприц (10 мл) | Любой поставщик | н/д |
Ссылки
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. <....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
