Этот протокол описывает, как готовить и выполнять электрофорез с захватом жидкой фракции с гелевым покрытием (CN-GELFrEE), нативный метод разделения нековалентных биомолекулярных сборок и белков из гетерогенных образцов, совместимый с различными методами анализа белков ниже по потоку.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
CN-GELFrEE - Clear Native гель-элюированный жидкая фракция Entrapment электрофорез
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Белковые комплексы выполняют множество важных клеточных функций. Выяснение их нековалентных взаимодействий и динамики имеет первостепенное значение для понимания роли комплексов в биологических системах. В то время как прямая характеристика биомолекулярными узлов приобретает все большее значение в последние годы, отечественные методы фракционирования, которые совместимы с ниже по течению методов анализа, в том числе масс-спектрометрии, которые необходимы для дальнейшего расширения этих исследований. Тем не менее, поле не хватает высокой пропускной способности, широкий ассортимент, высокое восстановления метод разделения для нативного белка сборок. Здесь мы приводим четкую нативный гель-элюированный жидкая фракция экстрагирующее электрофорез (CN-GELFrEE), который является новым модальность разделения для нековалентных белковых агрегатов. эффективность разделения CN-GELFrEE была продемонстрирована ректификационных комплексов, извлеченных из сердца мыши. Фракции собирали в течение 2 ч и отображаются дискретные полосы в диапазоне от ~ 30 до 500 кДа. мошенникнаблюдалась последовательны модель увеличения ширины полосы молекулярного веса, каждый в пределах ~ 100 кДа. Кроме того, последующее переанализ родных фракций с помощью SDS-PAGE показал молекулярной массы сдвигает в соответствии с денатурации белковых комплексов. Поэтому, CN-GELFrEE было доказано, чтобы предложить возможность выполнять с высоким разрешением и высокой восстановления родные разделений на белковых комплексов из большого диапазона молекулярной массы, обеспечивая фракции, которые совместимы с белком анализа вниз по течению.
Введение
Большинство биологических процессов , происходящих в клетке , как полагают, осуществляется с помощью белковых агрегатов , а не единичных белков 1. Следовательно, для того , чтобы выяснить специфическую биологическую роль субъединицы белка в клетке, необходимо понимать его структурные взаимодействия с другими белками или лигандов в комплексах 2. Тем не менее, изучение белков изначально, поддерживая их нековалентных взаимодействий и активность, остается сложной. Одним из недостатков нативных изучения белков является подходящим нативный метод разделения, который совместим с различными методами вниз по течению анализа белков. Поэтому в последнее время интерес к методам разделения , способные характеризовать нековалентных сборки биомолекул резко возросла 3.
методы разделения белков крайне важны для биохимии, биофизики и различных других исследований. Современные отечественные методы разделения имеют intrinsiC недостатки, которые снижают совместимость с ниже по течению анализов, таких как низкое разрешение, низкая пропускная способность, потери осадков, а также требование больших количеств исходного образца. Аффинной очистки Tandem обычно используется для исследования взаимодействия белка, но оно должно проводиться отдельно для каждого белка - мишени, в результате чего ее несовместимой с анализом высокой пропускной способностью 4. Хроматографи с исключением размеров 5, избирательное осаждение с ионом аффинной хроматографии 5 и градиенте плотности разделения 6 все предусмотрели нативные разделений, но по своей сути являются методы с низким разрешением и требуют высоких начальных количеств образцов.
В качестве альтернативы, гель на основе методики, такие как голубой Native (BN) и Clear Native (CN) PAGE (либо 1-D или 2-D), отображать разделение с высоким разрешением. Кроме того, контрастирующие с упомянуто другие методы, как родные СТР разделений поддерживают растворимость и нативную конформацию широкого гАнж макромолекулы видов, в том числе гидрофобных белков. Эта возможность дополнительно расширяет охват протеома достигнутый этими методами 7,8 и достигается за счет различной химии между CN и BN-PAGE. CN-PAGE обычно полагается на мягкие заряженные моющие средства в качестве молекул-носителей, заменяя Кумасси синего красителя в BN-PAGE. BN-PAGE, хотя связано с более высоким разрешением, имеет подводные камни , такие как снижение ферментативной активности в разделенных белков 8 и образованием молекулы Кумасси аддукта, причем последний значительно ущемляет вниз по течению масс - спектрального анализа 9. Оба эти методы, однако, традиционно ассоциируется с низким уровнем восстановления и узкого охвата протеома из - за окрашивания и ограничений экстракции геля 7.
Для изучения денатурированных белков, существует несколько методов, которые поддерживают растворимость макромолекулы при выполнении высокого разрешения фракционирования с регенерацией с высоким содержанием белка, и которые совместимы с Diverse методы анализа белков после разделения. Гель-элюированный жидкая фракция Защемление Электрофорез (GELFrEE) является одним из методов фракционирования, которые соответствуют всем этим характеристикам. Этот метод широко применяется в высоких пропускной исследованиях сверху вниз протеомики, указывая, что он быстр и универсален. В GELFrEE, белки денатурируют и отделены друг от друга на основе молекулярной массы через трубчатую гелевую матрицу, пористость которых может изменяться в зависимости от требований образца и от желаемых результатов фракционирования. Фракции элюировали в жидкой фазе, тем самым уменьшая ограничения восстановления, связанные с SDS-PAGE при сохранении высокого разрешения. Фракция аликвоты затем могут быть проанализированы с помощью 1-D PAGE для выбора полосы пропускания молекулярной массы 11. Существует высокий спрос на преимущества, связанные с GELFrEE в родных методами разделения. Описанный здесь метод Clear Родные GELFrEE (CN-GELFrEE), является уроженцем адаптация GELFrEE. Для того, чтобы быть совместимым с широкойяpectrum макромолекул в нативном состоянии, этот метод основан не только на мягкой химии CN-PAGE, но и на разделении пористости градиента, что уменьшает осаждение белков, устраняя резкий переход между пористостью , присутствующих в прерывистых гелевых системах 9. При применении к фракционирования белковых комплексов, выделенных из сердца мыши, элюированные фракции отображается высокое извлечение и разделение с высоким разрешением в широком диапазоне молекулярных масс был получен. Далее, полученные фракции совместимы с большинством вниз по течению биохимические и биофизические белковый анализ.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: Это видео протокол основан на соответствующей публикации 9. Конкретные реагенты, материалы и оборудование, необходимое для выполнения всех шагов, описанных в данном протоколе, перечислены в разделе материалов. Рецепты и информация для подготовки всех необходимых решений детализированы в таблице 1.
1. Заливка градиента Гели для труб
- Сборка литейной системы
- С помощью пламени обогревом лезвия бритвы или скальпель, вырезать 20 мл серологической пипеткой вдоль ортогональной секции 10 см от верхней части наконечника раздаточного. Убедитесь в том, что поверхность среза гладкая. Держите нижнюю часть (с наконечником) и удалите верхнюю часть. Зажмите нижнюю часть пипетки по вертикали (конический наконечник лицевой стороной вниз) к опорной стойке.
ВНИМАНИЕ: Не касайтесь металла с подогревом лезвия, используйте соответствующие ручки или плоскогубцев, чтобы избежать ожогов. - Вырезать 3 см гибкой трубки и подключить его к разрезанной пипетку, растягивая его надозирующий наконечник. Подключите клапан управления потоком на другом конце трубки.
- Ссылка на нижнюю часть клапана для раздаточного наконечника градиентного смесителя, используя кусок трубы. Держите клапан открытым.
- Установите градиент миксера в верхней части магнитной мешалкой. Поместите магнитные стержни внутри смесительной камеры.
- Расположите дозирующий наконечник градиента смесителя на 5-10 см выше, чем в верхней части пипетки части, чтобы дать возможность гель переливаться под действием силы тяжести.
- Проверьте систему на наличие утечек с деионизированной водой. Если никаких утечек не обнаружено, высушить систему путем продувки воздуха внутри него, прежде чем продолжить.
- Накройте верхнюю часть пипетки прокладка с двумя или более слоями ленты. Прокол отверстие через слои ленты в центре круглое отверстие. Убедитесь в том, что пункции является достаточно большим для стеклянной трубки, чтобы пройти через плотно.
- Вставьте стеклянную трубку, в которой гель будет наложено, через проколотый отверстие, растягивая ленту таким образом стекло плотно прилегает. яnsert стеклянной трубки таким образом, чтобы нижняя часть трубы составляет 2 мм над поверхностью дна пипеткой.
- Проверьте, чтобы увидеть, если стеклянная трубка удерживается и централизовано и не касаясь пипеткой стены, как только система подготовлена. Теперь система готова для литья.
- С помощью пламени обогревом лезвия бритвы или скальпель, вырезать 20 мл серологической пипеткой вдоль ортогональной секции 10 см от верхней части наконечника раздаточного. Убедитесь в том, что поверхность среза гладкая. Держите нижнюю часть (с наконечником) и удалите верхнюю часть. Зажмите нижнюю часть пипетки по вертикали (конический наконечник лицевой стороной вниз) к опорной стойке.
- Гель литья
- Подготовить гель буфера, APS и решения кумасси (растворы 1-3, таблица 1).
- Приготовьте 12% T (раствор 4, таблица 1) и 1% T (решение 5, таблица 1) , разделяющий гель решения. Добавляют 10 мкл раствора Кумасси в 12% растворе Т разделительный гель. Добавить APS и TEMED в обоих растворах непосредственно перед заливкой в градиентной смесителе.
ВНИМАНИЕ: полиакриламид сильно нейротоксическое и перчатки должны носить. - Убедитесь, что дозирующий клапан градиентного смеситель закрыт. Добавьте 12% T, разделяющую гель раствора в смесительную камеру, самой дальней от наконечника раздаточного. Откройте клапан между обеими камерами, и пусть я теку решениеNto следующую камеру.
- Закройте клапан и пипетки вывих 12% -ный раствор T разделительный гель назад к предыдущей камере. Это сделано, чтобы избежать воздушных пузырей между камерами.
- Добавляют 1% T, разделяющую гель раствора в смесительную камеру, ближайшей к кончику раздаточной. Включите магнитную мешалку.
- Размыкается в обоих градиентных смесительными клапанами, в то же время, чтобы позволить разделительные растворы гель для смешивания и течь в пипетку и стеклянную трубку.
- После того, как разделительные гелевые растворы в градиенте смесителем истощаются, расцепить трубки из смесителя и пары его в шприц объемом 10 мл. Убедитесь, что конец трубы остается выше уровня жидкости в пипетку до тех пор, пока шприц надежно закреплен.
- Используйте шприц, чтобы аккуратно вставьте оставшиеся отделяющую раствора геля из трубки в пипетку и стеклянную трубку. Закройте клапан пипетки, прежде чем разрешить пузырьки воздуха в него.
- Аккуратно добавить слой около 0,25 мл насыщенного водой butanoл (раствор 6, таблица 1) на верхней части раствора геля внутри стеклянной трубки , чтобы запечатать реакции полимеризации с кислородом в воздухе и выравниваться верхний мениск.
- Очистите разливочный аппарат немедленно деионизованной водой (не используйте моющие средства).
- Подождите в течение ночи для полной полимеризации геля при комнатной температуре.
- Отсоединение гель туба из устройства и хранения
- На следующий день, осторожно снимите ленту с верхней части устройства.
- Отсоедините клапан от трубки под пипеткой. Отпустите пипетку из зажимов и выполните шаги 1.3.3. и 1.3.4. над раковиной.
- Пара 10 мл шприц, наполненный деионизированной водой с гибкой трубкой. Нажмите воду через трубку в пипетку, медленно сдвигая полимеризованный гель из пипетки.
- Держа пипетку горизонтально и осторожно закрепить гелем выскальзывание открытого конца.
- Отрежьте избыток полиакриламида ниже и Ароунд стеклянную трубку с помощью лезвия бритвы. Убедитесь, чтобы создать гладкую конец на гель внутри трубки, сделав его заподлицо с концом стеклянной трубки.
- Разлить оставшуюся бутанола из верхней части геля и установите пробки геля в незакрытом 15 мл центрифужную пробирку. Смешайте 0,5 мл геля буфера (раствор 1, таблица 1) с 4,5 мл сверхчистой воды и добавляют приблизительно 2 мл раствора для обоих элементов на верхней стороне (внутри стеклянной трубки) и нижней стороной (в центрифужной пробирке) гелевой трубки.
- Накройте всю верхнюю сторону центрифуге трубки, в том числе отверстие стеклянной трубки, с парафином, чтобы предотвратить испарение буфера. Гели можно хранить при температуре 4 ° С в течение приблизительно 2 недель.
2. Подготовка проб
- Взвесить два сердца мыши и рубите их в чашку Петри с помощью лезвия бритвы.
- Добавьте обработанную ткань в ступке и добавить достаточное количество жидкого азота для покрытия образца. Распылить ткань с пестиком, добавляя большежидкий азот, когда она испаряется.
- После того , как ткань тщательно измельчают, дайте испариться азота и добавляют 1 мл буфера для лизиса (раствор 7, таблица 1) при 4 ° С на каждые 100 мг ткани. Переместить раствор в центрифужную пробирку.
- Центрифуга при 2000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Осторожно собрать надосадочную жидкость в новую пробирку и отбросить осадок. Количественно концентрации белка в надосадочной жидкости с использованием метода с применением бицинхониновой кислоты 12, или в качестве предпочтительного. Примечание: Коренной Клеточные лизаты или субклеточных фракций, могут быть получены в качестве предпочтительных. CN-GELFrEE совместим с различными носителями различных препаратов образцов.
- Приготовьте раствор солюбилизации буфера и загрузки раствора (растворов 8 и 9, таблица 1).
- Если образец представляет собой гранулы, ресуспендируют его в 50-150 мкл буфера солюбилизации. Хранить пробы на льду в течение 15 мин.
- Буфер обмена ресуспензированной образец или клеточного лизата с solubilizatионный буфер с использованием 30 кДа-MWCO ультра центробежный фильтр.
- Центрифуга образец белка при 4 ° С и 10000 мкг в течение 5-10 мин, или пока не удерживается объемная доля снижается до примерно 20 мкл. Выбросьте проточные.
- Добавить 400 мкл буфера для солюбилизации нераспределенной фракции и перемешать с помощью пипетки. Центрифуга при 4 ° С и 10000 мкг в течение 5-10 мин или пока удерживается фракция до объема приблизительно 20 мкл. Выбросьте проточные.
- Повторите шаг 2,9 еще два раза.
- Развести отфильтрованный образец (приблизительно 20 мкл) в 100 мкл буфера для солюбилизации.
- Добавьте 20 мкл раствора нагрузки к образцу.
3. CN-GELFrEE устройства
- Для выполнения CN-GELFrEE фракционирование, изготовления деталей устройства со ссылкой на механический цех. Изготовление деталей устройства в тефлоном. Пожалуйста , обратитесь на рисунке 1 всю информацию , необходимую для изготовления деталей и тO Таблица 2 для числа необходимых деталей для одного устройства.
Соображения безопасности: Надеть соответствующие средства индивидуальной защиты. Следует соблюдать осторожность вокруг высоковольтных источников питания, и все узлы должны быть правильно установлены. Не прикасайтесь к устройству или любой смежной мокрую зону, когда напряжение на и поддерживать окружающую скамейка область сухой во время электрофореза. Кроме того, блок питания должен быть полностью выключен при работе с устройством и / или сбор фракций. - Готовят буфер анодный и катодный буфер (растворов 10-11, таблица 1) , и держать их при 4 ° С или на льду.
- Установить верхний конец трубки геля (конец без геля) через спейсер, уплотнительное кольцо и второй распорки, в моде "сэндвич".
- Добавьте буферную камеру (катод) после того, как второй распорки, проходят винты полностью через боковые отверстия, добавить и затянуть гайки с обеих сторон. Убедитесь в том, что верхний конец Glass трубка закреплена перед верхней апертуре буферной камеры, а не непосредственно под ним или мимо него.
- Установить нижний конец трубки геля через спейсер, уплотнительное кольцо, накопительную камеру, и второй распорки.
- Добавьте буферную камеру (анод) после того, как второй распорки, проходят винты полностью через боковые отверстия, добавить и затянуть гайки с обеих сторон. Убедитесь, что нижний конец трубки Гель фиксируют мимо верхней апертуры буферной камеры, близко, но не касаясь задней стенки.
- Установите устройство CN-GELFrEE вертикально с катодный буферную камеру вверх, используя опорную стойку с зажимами.
- Добавить анодный буфер к аноду буферной камеры (внизу) и катодный буфер к катоду буферной камеры (вверху). Хранить все буферы при температуре 4 ° С.
- Удалите пузырьки воздуха из стеклянной трубки, осторожно коснувшись стеклянную трубку и проверить систему на наличие утечек.
- Убедитесь, что платиновые электроды находятся в контакте с буферами в камерах и что обаКонцы гель трубки погружают в буфер в каждой камере.
- Подключите шнуры питания от источника питания к соответствующим однополюсных вилок: отрицательный на катоде буферной камере (вверху) и положительной на аноде буферной камеры (внизу).
- Загрузить образец с использованием наконечника гель нагрузки на верхнюю поверхность геля, внутри трубки геля.
- Выполнить гель на 1 постоянной W, чтобы избежать перегрева, пока передний красный краситель не находится в нижней части трубки геля.
ВНИМАНИЕ: Выключите питание, прежде чем продолжить. - Откажитесь анодных и катодных буферы.
- Untighten гайки от буферной камеры анодной и демонтировать нижнюю распорку и камеру, поддерживая разделителей и уплотнительное кольцо. Поместите нижний конец трубки гель на внутреннюю поверхность камеры для сбора, перед верхней апертуры, а не в прошлом или непосредственно под ним. Нажмите на прокладку и уплотнительное кольцо близко к камере для сбора.
- Отрежьте кусок целлюлозы диализной мембраны и увлажняет ее immerging в анодной буфере. Накройте арerture между камерой сбора и нижней распорки с помощью диализной мембраны.
- Соберите анод буферную камеру после второго распорки, добавлять и затянуть винты и болты.
- Положите устройство горизонтально над ведерке со льдом. Добавить свежие анодных и катодных буферы буферных камер и проверить систему на наличие утечек.
- Добавьте 150 мкл буфера анода в накопительную камеру. Снова подключите кабели питания к соответствующим однополюсных вилок.
- Включите питание на 3 мА постоянного тока. Фронт краситель должен затем начать вымывается в буфер в накопительной камере.
- Когда передний весь краситель вымывается, выключите питание и собрать первую фракцию (0 мин), переводя ее в низкобелковой связывание трубки микроцентрифужных.
- Пополняйте накопительную камеру с 150 мкл буфера анода. Держите все собранные фракции на льду.
- Сбор фракций после следующих интервалов времени из коллекцииПервая фракция: 2 мин, 4 мин, 6 мин, 8 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин, 25 мин, 30 мин, 45 мин и 60 мин. Не приходится время, пока питание отключено. Не забудьте отключить питание перед сбором фракций и для пополнения накопительной камеры 150 мкл буфера между анодной образцов. Включите питание снова после сбора, чтобы начать элюирование следующую фракцию.
- Разливают анодную и катодную буферы и добавлять новые решения в буферных камер через 60 мин. Сбор фракций через 90 мин и 120 мин.
- Изменение анодных и катодных буферы каждый час.
- Запуск четкий родной или синий родную страницу с фракциями и окрашивает его в качестве предпочтительной. Следуйте инструкциям производителя или предпочтительного протокола.
- Запуск восстанавливающего SDS-PAGE и окрашивают его в качестве предпочтительной. Следуйте инструкциям производителя или предпочтительного протокола.
- Зачистить GELFrEE фракций и представить родной масс-спектрометрии анализа, как описано прeviously 9.
Рисунок 1:. CN-GELFrEE устройство (A) GELFrEE устройство частей чертежи и (Б) фотография изготовленных деталей; (C) , CN-GELFrEE схема сборки устройства: (1) буферная камера, (2) распорка, (3) уплотнительное кольцо (4) гель туба, (5) камера для сбора, и (6) диализную мембрану.
Таблица 1: Таблица решений.
Таблица 2: Таблица деталей устройства GELFrEE.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
200 мкг белков, экстрагированных из криогенным сердца земля мыши фракционировали изначально на 14 фракций по 150 мкл каждая, с использованием метода CN-GELFrEE в 1-12% туба Т гель. Аликвоту 10 мкл каждой фракции был подвергнут анализу на геле слябов CN-PAGE и окрашивали серебром. Четкое изображение фракционирования и разрешения , полученного с CN-GELFrEE фракционирования показано на рисунке 2А. Фракции собирали в течение двух часов, и анализ геля показывает последователь...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
CN-GELFrEE происходит от родной ясно (CN) СТР буферной системы , которая использует смесь анионных и нейтральных моющих средств в качестве молекул - носителей 9 для молекулярной массы на основе фракционирования белков через матрицу геля. Применение CN-GELFrEE к родному экстракта белка мыши сердца генерируется низкие фракции сложности с дискретными полосой пропускания при сохранении нековалентных взаимодействий биомолекул сборок. Сравнение фракций между CN-PAGE и восстановителей для SDS-PAGE гелей показал сляб...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Кек фонд WM любезно предоставили финансирование для этой работы. Этот материал основан на работе, поддержанной исследовательского гранта FAPERJ 100,039 / 2014 от правительства Рио-де-Жанейро - Бразилия для RDM, науки без границ науки +88888,075416 / 2013-00 от координации по улучшению высшего образования персонала, при правительстве из Бразилии, HSS, Национальный научный фонд стипендий Магистратура исследований в рамках стипендий номером 2014171659 для ОСС, и исследовательский грант CNPq 202011 / 2012-7 от правительства Бразилии для LHFDVPCH является получателем химии северо-западного университета жизненных процессов института Постдокторское Присуждение стипендий.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Реагенты | |||
| 30% раствор акриламида/биса, 37,5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | Этот раствор нейротоксичен. |
| 6-аминогексановая кислота (ε-аминокапроновая кислота) | Sigma-Aldrich | A2504 | Это химическое вещество является раздражителем. |
| Персульфат аммония (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | Это химическое вещество является легковоспламеняющимся, токсичным и коррозионным. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | Это химическое вещество является раздражителем. |
| Этиленгликоль тетрауксусная кислота (EGTA) | FLUKA | 3777 | Это химическое вещество токсично. |
| Этилендиамин тетрауксусная кислота (ЭДТА) | Fisher Scientific | BP120 | Это химическое вещество токсично. |
| Глицерин | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| имидазол | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Жидкий азот | Любой поставщик | н/д | Хранение жидкого азота в контейнерах<бр/> предназначенных для низкотемпературных жидкостей <бр/> |
| Мышиное сердце | Биорекультивация ООО | МСЭ-ХАРТ | |
| н-бутанол | Фишер Сайентификал | 71-36-3 | Это химическое вещество легковоспламеняющееся и токсичное. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Коктейль ингибитора протеазы | Thermo Fisher Scientific | 78430 | Это химическое вещество токсично. |
| Дезоксихолат натрия | Sigma-Aldrich | 30970 | Это химическое вещество является раздражающим веществом. |
| Сахароза | JTBaker | 4097 | |
| тетраметилэтилендиамин (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | Это химическое легковоспламеняющееся и раздражающее вещество. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Оборудование | |||
| Градиентный смеситель | Hoefer | SG15 | |
| Магнитный смеситель | Любой поставщик | н/д | |
| Магнитные стержни | Любой поставщик | н/д | Достаточно маленький, чтобы поместиться внутри камер смесителя gradiet. |
| Источник питания | Bio-Rad | 164-5056 | Напряжение до 1 500 В |
| Охлаждаемая центрифуга | Eppendorf | 022622552 | До 15 000 г |
| <сильный>Материалы | |||
| 15 мл Коническая трубка | Любой поставщик | н/д | |
| Ультрацентробежный фильтр 30 кДа-MWCO | Миллипоры | UFC503096 | |
| Гибкие трубки | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Длина около 1 м |
| Ведро для льда | Любой поставщик | н/д | |
| Жидкостный/воздушный металлический или пластиковый клапан. (например клапан рычага управления потоком воздуха/воды в аквариуме) | Любой поставщик | н/д | Аквариумные клапаны совместимы. |
| Ступка и пестик | Любой поставщик | н/д | |
| Родная СТРАНИЦА 3-12% Т слэб гель | Инвитроген | BN1003 | |
| Парапленка | Бемис | PM-996 | |
| чашка | Петри Фишер Научный | 08-757-13 | |
| Белок низкосвязывающийся тюбик 1,5 ml | Eppendorf | 022431081 | |
| Бритвенное лезвие | IDL Tools | TE05-091C | |
| Трубка для диализа регенерированной целлюлозы 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE слэб гель для любого kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Серологические пипетки (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Шприц (10 мл) | Любой поставщик | н/д |
Ссылки
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
- Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).
- Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26 (4), 327-334 (2002).
- Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
