Использование Tomoauto: протокол для высокой пропускной автоматизированной Cryo-электронной томографии

Summary

Мы представляем протокол о том, как использовать высокой пропускной крио-электронной томографии для определения высокого разрешения в точке, структур молекулярных машин. Протокол позволяет большие объемы данных, подлежащих обработке, избегает общих узких мест и сокращает время простоя ресурсов, позволяя пользователю сосредоточиться на важных биологических вопросов.

Abstract

Криоэлектронная томография (Cryo-ET) — это мощный метод трехмерной (3D) визуализации для визуализации макромолекулярных комплексов в их естественном контексте на молекулярном уровне. Метод включает в себя первоначальное сохранение образца в его исходном состоянии путем быстрого замораживания образца в стекловидном льду, затем сбор серии микрофотографий под разными углами при большом увеличении и, наконец, вычислительную реконструкцию трехмерной карты плотности. Замороженный гидратированный образец чрезвычайно чувствителен к электронному пучку, поэтому микрофотографии собираются при очень низких дозах электронов, чтобы ограничить радиационное повреждение. В результате необработанная криотомограмма имеет очень низкое соотношение сигнал/шум, характеризующееся зашумленным изображением. Для лучшей визуализации интересующих объектов используется обычный анализ изображений и усреднение субтомограмм, при котором субтомограммы объекта извлекаются из исходной томограммы, выравниваются и усредняются для улучшения контраста и разрешения. Большие наборы данных наклонных рядов необходимы для понимания и разрешения комплексов при различных состояниях, условиях или мутациях, а также для получения достаточно большой коллекции субтомограмм для усреднения и классификации. Сбор и обработка этих данных может стать серьезным препятствием для дальнейшего анализа. В данной статье мы описываем протокол крио-ЭТ с высокой пропускной способностью, основанный на управляемом компьютером криоэлектронном микроскопе 300 кВ, камере с устройством прямого детектирования (DDD) и высокоэффективной полуавтоматической библиотеке программного обеспечения для конвейерной обработки изображений tomoauto собственной разработки. Этот протокол был эффективно использован для визуализации интактной системы секреции типа III (T3SS) в миниклетках Shigella flexneri. Он может быть применим к любому проекту, подходящему для крио-ЭТ.

Introduction

Тип III секреции системы (T3SS) являются важнейшими факторами, определяющими вирулентность для многих грамотрицательных микроорганизмов. Injectisome, также известный как иглы комплекса, является центральным T3SS машина требуется для прямого транслокации эффекторных белков из бактерий в эукариотических клетках-хозяевах ^{1, 2.} Injectisome включает внеклеточный иглу, базальный тело, и цитоплазматический комплекс также известен как сортировочного комплекса ^3. Предыдущие исследования выяснены 3-D структуры очищенных injectisomes из Salmonella и Shigella, наряду с атомными структурами крупных базальных белков в организме ^{4, 5.}

Protocol

1. Подготовка Minicell

1. Для того, чтобы S. Флекснера минипосылки, преобразования 1 мкл плазмиды pBS58, которые конструктивно выражает гены деление кишечная палочка клеток ftsQ, ftsA и FtsZ от низкого копии спектиномицин устойчивостью плазмиды в 5 мкл Электрокомпетентные стрептомицинустойчивых серотип 5а (M90T-Sm) клеток путем электропорации 2,5 кВ в течение 5 мс в 1 мм кювет.
2. Храните образцы Minicell при -80 ° С в 15% глицерине в 1,5 мл микропробирок. Криогенной Готовое, очистить приблизительно 5 мкл клеток от unthawed микропробирок с помощью пипетки и суспендирования клеток в 4 мл трипсином соевый бульон с спек....

Results

Образцы минипосылок S. Флекснера были собраны и обработаны, как показано на схематическом рисунке 1, используя следующие tomoauto трубопровода, изображенной на рисунке 2. Tilt-серии были собраны с помощью SerialEM ^10, что позволяет с высокой пропускной приобретения наклона серии в точках, обозначенных пользователем на картах монтаж низким увеличением (рисунок 3). Микрофотографии был.......

Discussion

Метод высокой пропускной описано здесь позволило нам обрабатывать 1,917 крио наклона рядов и производят более 4500 суб-томограммы неповрежденной S. Флекснера injectisome ^19. Собранные данные привели к подробной характеристике в месте injectisome, в том числе цитоплазматических сортировочный комплекс. Метод также используется для визуализации нескольких мутантных клеток с определенной делецией предполагаемых белковых компонентов, что позволило выяснить состав сортировки платформе inj.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Глицерин	Sigma-Aldrich	G9012
Tyrptic Соевый бульон	Sigma-Aldrich	22092
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S0692
Электропоратор	Bio-rad	165-2100
1 мм Кювета	BTX	45-0124
1,5 мл Криогенная трубка	Thermoscientific	5000-1020
Микроцентрифужная пробирка 1,5 мл	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey Carbon Grids	Quantifoil (Electron Microscopy Sciences)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
Устройство для тлеющего разряда	Собственная		коммерческая альтернатива Доступный
вакуумный эксикатор	Sigma-Aldrich	Z119016	Используется в собственном устройстве для разрядки свечения
Высокочастотный генератор	электротехнической продукции	БД-10А	используется в собственных тлеющих разрядных устройствах. ВНИМАНИЕ: Это устройство генерирует высокое напряжение.
Центрифужные
щипцы	Dumont (Электронная микроскопия)	72705-D	Style 5 Антимагнитный
коллиодальный золотой	Aurion		BSA 10 нм
фильтровальная бумага	ватман		# 2
этан	Matheson Tri-Gas	UN1035
Азот	Matheson Tri-Gas	UN1977
Плунжерное устройство	Собственная		коммерческая альтернатива
Криогенная сетка Накопитель	Электронная микроскопия Sciences	71166-30
Просвечивающий электронный микроскоп	FEI		Tecnai Polara F30 (300 КэВ)
Устройство прямого обнаружения Камера	Gatan		K2 Summit
Acquisiton Программное обеспечение	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Альтернативы: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography
Beam-induced Motion Correction Software	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html требуется программное
обеспечение	для выравнивания >2 ГБ графического процессора Nvidia серии Tilt-Series.Альтернативы IMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD: XMIPP, программное
обеспечение для автоматического моделирования реперных маркеров	IMOD		: RAPTOR (включено в IMOD0 (используется в tomoauto)
Программное обеспечение для определения CTF	IMOD		: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Можно использовать в tomoauto)
Программное обеспечение для реконструкции серии	Tilt tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Альтернативы: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es
Программное обеспечение для автоматизированной обработки Protomo Tilt-Series	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
Программное обеспечение для сбора частиц	i3		http://www.electrontomography.org Альтернативы: IMOD
Программное обеспечение для усреднения субобъемов	i3		Альтернативы: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch, PyTom http://pytom.org