Эта рукопись описывает дуплексный цифровой анализ ПЦР , который может использоваться для одновременного количественного определения Enterococcus SPP. И HF183 генетические маркеры , как показатели общего и человеческого ассоциированного фекального загрязнения в рекреационных водах.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Дуплексной связи с цифровой ПЦР-анализ для одновременного Количественное определение
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эта рукопись описывает дуплексный цифровой ПЦР (EntHF183 ДПСП) для одновременного количественного определения Enterococcus SPP. И человека фекально-ассоциированной HF183 маркером. EntHF183 дуплекс ДПСП (называемый также EntHF183 ДПСП на этом) анализе используют одни и те же последовательности праймеров и зондов в качестве своих опубликованных индивидуальных количественной ПЦР (КПЦР) экземплярах. Точно так же, те же фильтрации воды и экстракции ДНК процедуры, выполняемые до кПЦР следуют до запуска ДПСП. Тем не менее, дуплекс ДПСП анализ имеет ряд преимуществ по сравнению с КПЦР анализов. Наиболее важно то, что анализ ДПСП устраняет необходимость запуска стандартной кривой, и, следовательно, связанный с ним смещение и изменчивость, путем прямой количественной оценки своих целей. Кроме того, в то время как дуплексной (т.е. одновременное количественное) Enterococcus и HF183 в кПЦР часто приводит к сильному занижению менее обильной мишени в образце, ДПСП обеспечивает последовательное количественное определение обеих целей, подогретьее количественно по отдельности или одновременно в той же самой реакции. Анализ ДПСП также способен переносить концентрации ингибитора ПЦР, которые один-два порядка выше, чем терпимо кПЦР. Эти преимущества делают анализ EntHF183 ДПСП особенно привлекательным, поскольку он одновременно обеспечивает точную и воспроизводимую информацию как общего и человеческого ассоциированных фекального загрязнения окружающей среды в водах без необходимости запуска двух отдельных анализов КПЦР. Несмотря на свои преимущества по сравнению с кПЦР, верхний предел количественного анализа анализа ДПСП с имеющихся в настоящее время приборов примерно на четыре порядка ниже, чем достижимо кПЦР. Следовательно, разбавление необходим для измерения высоких концентраций организмов-мишеней, таких как те, которые обычно наблюдаются следующие канализационные разливы.
Введение
Количественные ПЦР (КПЦР) методы широко используются для рекреационного мониторинга качества воды и микробных отслеживания приложений источник, потому что они быстрее, более гибкими и специфичным по сравнению с традиционными методами культивирования на основе. Следовательно, КПЦР рекомендуется для достижения быстрых результатов мониторинга воды для общих фекальных показателей , таких как Enterococcus SPP. В пересмотренных USEPA критериев качества воды в рекреационных целях 1. Многие анализы КПЦР также были разработаны и утверждены для выявления источников фекального загрязнения окружающей среды в водах 2. Среди них HF183 маркер анализы ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Анализ смеси Приготовление
- Сделать концентрации 100 мкмоль / л запаса для всех праймеров в классе воды молекулярной и зондов в ТЕ рН 8 буфере [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3].
Примечание: Зонды для двух целей флуоресцентно помечены различными флуорофоров 7 , как указано в списке материалов / оборудования. - Подготовка мастер смеси путем смешивания, на реакцию и планировалось, 12 мкл цифровой ПЦР смеси (2x запас, см Перечень материалов / оборудования), 0,216 мкл каждого прямого и обратного праймера, 0,06 мкл каждый флуоресцентный зонд, и 5,016 мкл нуклеазы свободной воды (ко....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Хороший пробег EntHF183 дуплекс ДПСП должно приводить к относительно большое количество принятых капель (приблизительно 10,000-17,000) и относительно большой разницы (около 5000) между значениями флуоресценции для отрицательных и положительных капель 7. Необычно низкое количество капель, вероятно, указывает на проблемы в процессе генерации капель, а отсечка 10000 капель предлагается на основе эмпирических данных из системы капельной ДПСП используемой в данной.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Есть несколько важных шагов в протоколе. Во-первых, смешивание пробирного смесей может быть затруднено, так как основной смеси, включающей более вязкая, чем обычные мастер-смесей КПЦР. Простой вортексе может привести к недостаточному перемешиванию, которое, в свою очередь, приводит к неравномерному распределению ДНК-матриц в анализе смесей, а затем в капельках. Техника смешения по-пипеткой описано в протоколе должны быть соблюдены, чтобы обеспечить точную ДПСП количественной оценки. Во-вторых, важно, чтобы убедиться, ка.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
У авторов нет благодарностей.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Микропробирки с низким связыванием | Costar | 3207 | Для хранения реагентов, образцов/производства мастер-смесей |
| Нуклеазная вода | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 буфер | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | Для начальной мастер-смеси и инокуляции образцов |
| Алюминиевая герметизирующая пленка | BioRad | 359-0133 | Для герметизации образца пластины |
| Генератор капель | BioRad | 186-3002 | |
| Масло для генерации капель | BioRad | 186-3005 | |
| Картридж | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Держатель картриджа | BioRad | 186-3051 | |
| Прокладка | BioRad | 186-3009 | |
| 20 μ l наконечники для пипеток | Rainin | GP-L10F | Для танстинга образца/мастер-микса в картидж |
| 200 μ l наконечники для пипеток | Rainin | GP-L200F | Для переноса капель на конечную пластину Twin.Tec |
| Пластина Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | Для термоциклирования и чтения окончательных капель |
| Термоциклическая фольга | BioRad | 181-4040 | Для герметизации пластины Twin.Tec перед термоциклированием |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 и C1000 | Нужен только термоамплификатор, никакой оптики |
| QX100 Считыватель капель | BioRad | 186-3001 | |
| Считыватель капель Масло | BioRad | 186-3004 | |
| Капля PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | т.е. цифровой ПЦР-микс в программном |
| обеспечении QuantaSoft (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | Для просмотра, анализа и экспорта данных ddPCR |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Альтернативный поставщик может быть использован |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATT | Альтернативный поставщик может быть использован |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Можно использовать альтернативного поставщика, но флорофором должен быть FAM |
| HF183 Forward Primer ( HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATCCG | Альтернативный поставщик может быть использован |
| HF183 Обратный праймер (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGT | Альтернативный поставщик может быть использован |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] | Альтернативный поставщик может быть использован, но флорофор должен быть HEX (если используется VIC, то должна быть выбрана соответствующая матричная компенсация. |
| Положительный контроль | Смесь геномной ДНК E. faecalis и стандартной плазмиды HF183 (заказана у IDT). Подробные методы культивирования E. faecalis и последовательности упорядоченной плазмиды HF183 см. в Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Коммерчески доступные стандарты ДНК Enterococcus (ATCC 29212Q-FZ) также могут быть использованы в положительном контроле вместо подготовленной в лаборатории геномной ДНК E. faecalis. |
Ссылки
- Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/ (2012).
- Boehm, A. B., et al. Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study. Water Res.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
