Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Данио рерио в качестве модели для оценки тератогенных потенциал Нитрит

9.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53615

⸱

16 февраля 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University of Pennsylvania

В этой статье

Краткое содержание

Воздействие тератогенами может вызвать врожденные дефекты. Рерио являются полезными для определения тератогенного потенциала химических веществ. Мы показали полезность данио, подвергая эмбрионов различных уровнях нитрита, а также в разное время экспозиции. Покажем, что нитрит может быть токсичным и вызвать серьезные пороки развития.

Аннотация

Высокие уровни нитрата в окружающей среде могут привести к врожденных дефектов или выкидыша у человека. Предположительно, это связано с конверсии нитрата в нитрит кишечной и слюнных бактерий. Тем не менее, в других исследованиях млекопитающих, высокий уровень нитритов не вызвать врожденные дефекты, хотя они могут привести к ухудшению репродуктивной. Таким образом, тератогенный потенциал нитрита не ясно. Было бы полезно иметь позвоночных модельную систему легко оценить тератогенное действие нитрита или любого другого химиката, представляющего интерес. Здесь мы продемонстрировать полезность данио (Danio rerio) для скрининга соединений на токсичность и эмбриональных дефектов. Эмбрионы рыбок данио оплодотворены внешне и имеют быстрое развитие, что делает их хорошей моделью для тератогенных исследований. Покажем, что увеличение времени экспозиции до нитрита отрицательно сказывается на выживаемости. Повышение концентрации нитрита также отрицательно сказывается на выживаемости, в то время как нитрат нет. Для эмбрионов тхат выжить нитрита экспозицию, различные дефекты могут возникать, в том числе перикард и желточного мешка отек, плавать noninflation мочевого пузыря, и черепно-лицевых пороков. Наши результаты показывают, что данио является удобной системой для изучения тератогенного потенциала нитрита. Этот подход может быть легко адаптирована для тестирования других химических веществ для их воздействия на ранней позвоночных развития.

Введение

Тератогенеза это процесс, который разрушает нормальное развитие эмбриона или плода, вызывая постоянные структурные и функциональные аномалии, задержку роста, или выкидыш в тяжелых случаях 1. Это может быть вызвано определенных природных веществ (тератогенами), которые препятствуют эмбрионального развития несколькими способами 2. В период внутриутробного развития человека, общая тератогены таких как радиация, инфекционные агенты, токсичные металлы и органических химических веществ, как сообщалось, вызывают дефекты в epicanthic складок (кожной складки в верхней крышке глаза) и клинодактилия (изогнутый палец или) через морфогенетических ошибок 1.

Понимание молекулярного механизма тератогенеза является первым шагом на пути к разработке лечения и профилактики. Несколько позвоночных модели, такие как Африканский когтистые лягушки (Xenopus Laevis) и данио (Danio rerio) были использованы для определения молекулярных путей, пострадавших от teratogens. Предыдущие исследования использовали данио в качестве модели для эпидемиологии, токсикологии и тератогенеза 3-7. Scholz и др. считается данио как «золотой стандарт» для оценки воздействия на окружающую токсичности. Это связано, в частности, к прозрачности данио эмбриона, что позволяет исследователям визуализировать дефект с развитием, как это происходит 8. Примерно 70% человеческих генов имеют ортологи у рыбок данио, делая данио желаемый модель позвоночных для изучения человеческие пороки 9.

Некоторые эпидемиологические исследования показали, что нитраты и нитриты, обычно присутствующие в сельскохозяйственных продуктах и воде, которые связаны с врожденными дефектами или самопроизвольных абортов 10,11, в то время как другие исследования не поддерживают эту ассоциацию 12. Нитраты (NO 3 -) и нитрит (NO 2 -) естественным образом присутствуют в почве и воде. Они являются источником азота для растений и являются частью пitrogen цикл 13. Такие продукты, как зеленые бобы, морковь, кабачки, шпинат, и свеклы из хозяйств, которые используют удобрения с высоким содержанием нитратов значительно увеличены уровни нитратов и нитритов 7. Молоко от коров, которых кормили продуктов с высоким содержанием нитратов и рыб в высокой нитрата воды (в основном из стока почвы 30) может привести к людям, потребляющих большое количество нитратов и нитритов 14. Нитраты и нитриты, также широко используется при консервировании пищи, что резко увеличивает количество попадает в организм человека 12.

Оптимальные уровни нитратов и нитритов играть фундаментальную роль в физиологических процессах, таких как сосудистой гомеостаза и функции, нейротрансмиссии и иммунологических механизмов защиты хозяина 13-15. Тем не менее, воздействие высоких уровней нитратов и нитритов может привести к неблагоприятным последствиям, особенно у младенцев и детей 16. Заглатывании нитрат далее превращают в нитрит в ротовой полости микрофлорой и в гое желудочно-кишечного тракта кишечной микрофлоры 17.

Нитрат ставит младенцев в высоком риске развития синдрома синего младенца путем окисления гемоглобина в метгемоглобин, ухудшая гемоглобин из его переносить кислород способность 18. Это приводит к синему цвету кожи, который простирается до периферических тканях в более тяжелых случаях. Ингибированная оксигенации тканей приводит к другим симптомам, наиболее сильно приводит к коме и смерти 19,20. Подобные симптомы наблюдаются у младенцев и взрослых при более высоких концентрациях нитрата 21. Повышенные уровни метгемоглобина у взрослых из-за нитрита отравление приводит к цианоз, головная боль, расстройства дыхания 31 и смерть, если не лечить из-за осложнений, связанных с жизненно тканевой гипоксии 32,33.

Нитрат попадает на более высоких уровнях также может привести к различным осложнениям. детского диабета, рецидивирующий понос, и рецидивирующие инфекции дыхательных путейу детей были связаны с высокой нитрата впускного 11,17,22. Хроническое воздействие на высокий уровень нитрата связано с мочеиспусканием и селезенки кровоизлияния. Острое воздействие высоких доз нитратов с может привести к широкому спектру заболеваний, как боль в животе, мышечной слабости, крови в стуле и моче, обмороки и смерти 11. Пренатальное воздействие нитрата при высоких уровнях была связана с нервной трубки и опорно-двигательного дефекта 11.

Недавний отчет показал, что лечение эмбрионов данио с нитритом привело к желточного мешка отек, черепно-лицевых и осевые пороки, и плавать noninflation мочевого пузыря 5. В данном исследовании мы демонстрируем способ лечения эмбрионов данио с нитратов и нитритов, чтобы определить их тератогенным потенциалом. Эмбрионы подвергали воздействию нитрита при различных концентрациях и различных промежутков времени. Этанол использовали в качестве положительного контроля, поскольку она является установленным тератогенным 23. Оур метод показал, что оба высокие концентрации и длительное время экспозиции до нитрита были вредны для выживания и повлекли за собой различные фенотипы, начиная от легкой (отек) и тяжелых (брутто пороков развития). Таким образом, данио является полезной моделью для непосредственного изучения потенциальных тератогенных эффектов нитратов и нитритов на эмбрионах дополнить эпидемиологические исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Процедуры, описанные в данном протоколе были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных от университета Индианы Пенсильвании.

1. Урожай Эмбрионы

  1. Поддержание данио на 28,5 ° С, рН 7, проводимость между 500-1500 мкСм и цикл свет / темнота 14 ч света и 10 ч темноты 24. Используйте штаммов дикого типа, такие как ТУ, AB или ТУ / AB гибрида. Различные штаммы могут по-разному реагировать химической обработке 25.
  2. Настройка рыбу для спаривания ночь перед уборкой яиц, добавив системы рыб в брачный бак. Добавить самец и самка рыбы в бак и разделить два рыбу с делителем. Каждая пара рыба будет производить широкий спектр 50-300 яиц. Чтобы обеспечить наличие достаточного яйца будут производиться, настроить 30 пар рыб. Как правило, около 50% рыбных пар по простому спаривания возраста (6-9 месяцев) будет производить яйца, в результате чего до 200 яиц за пару и максимум до 3000 яйца для этого эксперимента.
  3. На следующее утро после того, как включается свет, удалить разделитель инициировать спаривание. Проверьте сопрягаемые танки для яиц каждые 15 мин.
  4. После того, как рыба откладывает яйца, урожай все эмбрионы, используя ситечко и объединить их в один большой контейнер с E3 буфера (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl 2, 0,33 мМ MgSO 4). В 1,5 часов после оплодотворения, удалить и уничтожить неоплодотворенные яйца с пластиковой пипеткой передачи под микроскопом рассекает. Неоплодотворенных яиц являются непрозрачными в то время оплодотворенные яйца являются прозрачными 34.
  5. Передача 50 эмбрионов в 100 х 15 мм стекла чашку Петри, содержащую 50 мл E3 буфер для каждого условия обработки. В общей сложности 33 блюд необходимы для 11 условий обработки и 3 повторах.

2. Лечение Эмбрионы

  1. Провести процедуры в 2 ч после оплодотворения (ФВЧ) 35. Выдержите / эмбрионов личинок на 28,5 ° С и изучить личинок при 120 часов после оплодотворения. Выполните на лугул три повторности каждого состояния обработки для статистического анализа.
  2. За 3 чашки Петри (каждый из которых содержит 50 эмбрионов) в 2 часов после оплодотворения, удалить буфер E3 с передаточной пипетки и добавить 50 мл 300 мМ этанола, разбавленного в буфере E3. Накройте чашки Петри с парафильмом минимизировать испарение спирта.
    1. Продолжить подвергая эмбрионов к этанолу в течение 22 ч. Затем удаления этанола с передачей пипетки. Добавьте 50 мл буфера E3 и вихрем блюду несколько раз промыть этанола. Удалить этот буфер E3 с передачи пипетки и повторите стадии промывки еще 2 раза.
  3. За 3 чашки Петри (каждый из которых содержит 50 эмбрионов) в 2 часов после оплодотворения, удалить буфер E3 с передаточной пипетки и добавить 50 мл новый буфер E3.
  4. За 9 чашках Петри (каждый из которых содержит 50 эмбрионов) в 2 часов после оплодотворения, удалить буфер E3 с передаточной пипетки и добавить 50 мл 1000 мг / л нитрита натрия, растворенного в буфере E3. Подтвердите концентрацию раствора нитрита складе заранее, используямодификация диазотирования (US EPA Метод 354.1) спектрофотометрический метод 28.
    1. Продолжить подвергая 3 блюда на 46 ч, 3 кухни на 70 часов и 3 блюда на 94 ч. Заменить раствора нитрита с свежеприготовленный раствор нитрита ежедневно.
    2. После каждого времени экспозиции, удалить нитрит с пересадкой пипеткой. Добавьте 50 мл буфера E3 и вихрем блюду несколько раз промыть нитрит. Удалить этот буфер E3 с передачи пипетки и повторите стадии промывки еще 2 раза.
  5. За 3 чашки Петри (каждый из которых содержит 50 эмбрионов) в 2 часов после оплодотворения, удалить буфер E3 с передаточной пипетки и добавить 50 мл 200 мг / л нитрита натрия. Повторите это 400, 600, 800, и 1000 мг / л нитрита натрия.
    1. Продолжить подвергая эмбрионов до нитрита 70 ч. Заменить раствора нитрита с свежеприготовленный раствор нитрита ежедневно.
    2. По истечении времени экспозиции, удалить нитрит с пересадкой пипеткой. Добавьте 50 мл буфера E3 и вихрем блюдо несколькораз промыть нитрит. Удалить этот буфер E3 с передачи пипетки и повторите стадии промывки еще 2 раза.
  6. За 3 чашки Петри (каждый из которых содержит 50 эмбрионов) в 2 часов после оплодотворения, удалить буфер E3 с передаточной пипетки и добавить 50 мл 1000 мг / л нитрата натрия, растворенного в буфере E3. Подтвердите концентрацию раствора нитрата складе заранее, используя модификацию сокращения кадмия (US EPA Метод 353.3) методом спектрофотометрического 28.
    1. Продолжить подвергая эмбрионов до нитрата 70 ч. Заменить раствор нитрата с свежеприготовленный раствор нитрата ежедневно.
    2. По истечении времени экспозиции, удалить нитраты с пересадкой пипеткой. Добавьте 50 мл буфера E3 и вихрем блюду несколько раз промыть нитрат. Удалить этот буфер E3 с передачи пипетки и повторите стадии промывки еще 2 раза.
  7. Во время каждого дня экспозиции, подсчитать количество мертвой эмбриона / личинок с помощью стереомикроскопа. Признаки смертивключают в себя отсутствие сердцебиения и кровообращение, или отсутствие подвижности после 1 мин наблюдения. Удалить погибших эмбрионов / личинки с передачи пипетки, чтобы уменьшить загрязнение буфера E3.
  8. При проведении экспериментов заканчивается на 120 часов после оплодотворения, эвтаназии личинок.
    1. Удалить буфер E3 с пересадкой пипеткой. Затем добавить 50 мл 0,2% МС-222 (буферном до рН 7) и ждать в течение 10 мин.
    2. Снимите MS-222 с передачи пипетки. Добавьте 50 мл Е3 буфера и водоворот, чтобы смыть MS-222.
    3. Удалить буфер E3 с передаточной пипетки и добавить 20 мл 4% параформальдегида (PFA) для фиксации личинки. Вихревой блюдо несколько раз. Используйте передачи пипетки для передачи личинок в стеклянный флакон вместе с достаточным количеством PFA, чтобы заполнить флакон. Хранить флаконов в холодильнике в течение ночи (O / N).
  9. Сфотографируйте фиксированной личинок с помощью стереоскоп с помощью цифрового фотоаппарата. Используйте 30X увеличение, ISO 200, и 200 мс время экспозиции. Сориентируйте личинок так, что передний к лефутов и спинной является верхней части области.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Воздействие до 300 мм этанола в течение 22 ч не влияло на выживаемость (данные не показаны), что согласуется с предыдущими сообщениями 5,23,26. Ожидается, что это, как этанол является известным тератогенным и служил в качестве положительного контроля. Наблюдаемые фенотипы включены перикарда отек, плавать noninflation мочевого пузыря (рис 1), черепно-лицевые дефекты и задержка развития (данные не показаны).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод, описанный здесь демонстрирует полезность данио в оценке тератогенного потенциала нитритов и нитратов. По сравнению с другими позвоночных, данио имеют свои преимущества, которые включают высокую плодовитость, наружное оплодотворение, оптическую прозрачность, и быстрое развитие. Доступные мутанты, которые лишены пигментации (например, Casper данио 36) также способствовать повышению видимости внутренних органов. Это также легко генерировать трансгенные данио с репортерных генов для облегчения анализа живо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

VK финансировался за счет грантов от Департамента биологии IUP и Школы последипломного обучения и исследований (Graduate Student Professional Development). CQD и TWS были поддержаны Школой последипломного образования и исследований IUP (Faculty Publication Costs/Incidental Research Expenses). Мы также благодарим сотрудников лаборатории в Дипе за поддержание объекта по выращиванию рыбок данио.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DREL/2010 приборHach26700-03
ЭтанолSigma-AldrichE7023
KIMAX стекло Чашка ПетриVWR89001-244
MS-222Sigma-AldrichE10521
НитраВер 5 Нитратный реактивHach14034-46
НитриВер 3 Нитритный реактивHach14065-99
ПарапленкаFisher Scientific3-374-10
ПараформальдегидSigma-Aldrich158127
S6E стереомикроскопLeica10446294
Нитрат натрияFisher ScientificS343
Нитрит натрияFisher ScientificS347
Перенос пипетокЛаборатория Продажа продукцииL320072
стеклянных флаконахFisher Scientific03-338B

Ссылки

  1. Gilbert-Barness, E. Teratogenic causes of malformations. Ann Clin Lab Sci. 40 (2), 99-114 (2010).
  2. Brent, R. L. The cause and prevention of human birth defects: What have we learned in the past 50 years. Con Anom. 41 (1), 3-21 (2001).
  3. Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E. Zebrafish: an in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
  4. Pamanji, R., et al. Toxicity effects of profenofos on embryonic and larval development of zebrafish (Danio rerio). Environ Toxicol Pharmacol. 39 (2), 887-897 (2015).
  5. Simmons, A. E., Karimi, I., Talwar, M., Simmons, T. W. Effects of nitrite on development of embryos and early larval stages of the zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9 (4), 200-206 (2012).
  6. Mantecca, P., et al. Toxicity Evaluation of a New Zn-Doped CuO Nanocomposite With Highly Effective Antibacterial Properties. Toxicol Sci. , (2015).
  7. Jensen, F. B. Nitric oxide formation from nitrite in zebrafish. J Exp Biol. 210, 3387-3394 (2007).
  8. Scholz, S., et al. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment--applications beyond acute toxicity testing). Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).
  9. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  10. CDC. Spontaneous abortions possibly related to ingestion of nitrate-contaminated well water--LaGrange County, Indiana, 1991-1994. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 45 (26), 569-572 (1996).
  11. Brender, J. D., et al. Prenatal nitrate intake from drinking water and selected birth defects in offspring of participants in the national birth defects prevention study. Environ Health Perspect. 121 (9), 1083-1089 (2013).
  12. Huber, J. C., et al. Maternal dietary intake of nitrates, nitrites and nitrosamines and selected birth defects in offspring: a case-control study. Nutr J. 12, 34(2013).
  13. Phillips, W. E. Naturally occurring nitrate and nitrite in foods in relation to infant methaemoglobinaemia. Food Cosmet Toxicol. 9 (2), 219-228 (1971).
  14. Moncada, S., Palmer, R. M., Higgs, E. A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev. 43 (2), 109-142 (1991).
  15. Gladwin, M. T., Crawford, J. H., Patel, R. P. The biochemistry of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin: role in blood flow regulation. Free Radic Biol Med. 36 (6), 707-717 (2004).
  16. Gupta, S. K., et al. Recurrent acute respiratory tract infections in areas with high nitrate concentrations in drinking water. Environ Health Perspect. 108 (4), 363-366 (2000).
  17. Kross, B. C., Ayebo, A. D., Fuortes, L. J. Methemoglobinemia: nitrate toxicity in rural America. Am Fam Physician. 46 (1), 183-188 (1992).
  18. Greer, F. R., Shannon, M. Infant methemoglobinemia: the role of dietary nitrate in food and water. Pediatrics. 116 (3), 784-786 (2005).
  19. Sanchez-Echaniz, J., Benito-Fernandez, J., Mintegui-Raso, S. Methemoglobinemia and consumption of vegetables in infants. Pediatrics. 107 (5), 1024-1028 (2001).
  20. Reregistration Eligibility Decision: Inorganic Nitrate/Nitrite (Sodium and Potassium Nitrates). , U.S. Environmental Protection Agency. Available from: http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/old_reds/4052red.pdf (1991).
  21. Virtanen, S. M., et al. Nitrate and nitrite intake and the risk for type 1 diabetes in Finnish children. Childhood Diabetes in Finland Study Group. Diabet Med. 11 (7), 656-662 (1994).
  22. Case Studies in Environmental Medicine: Nitrate/Nitrite Toxicity. , U.S. Agency for Toxic Substances and Diseases Registry. Available from: http://www.atsdr.cdc.gov/HEC/CSEM/nitrate/docs/nitrate_nitrite.pdf (2001).
  23. Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 769-781 (2004).
  24. Westerfield, M. The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, University of Oregon Press. (2007).
  25. Loucks, E., Carvan, M. J. Strain-dependent effects of developmental ethanol exposure in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 745-755 (2004).
  26. Bilotta, J., Barnett, J. A., Hancock, L., Saszik, S. Ethanol exposure alters zebrafish development: a novel model of fetal alcohol syndrome. Neurotoxicol Teratol. 26 (2), 737-743 (2004).
  27. Li, J., Jia, W., Zhao, Q. Excessive nitrite affects zebrafish valvulogenesis through yielding too much NO signaling. PLoS One. 9 (3), e92728(2014).
  28. Methods for chemical analysis of water and wastes. , United States Environmental Protection Agency. Cincinnati, OH. Environmental Monitoring and Support Laboratory, Office of Research and Development (1983).
  29. Loucks, E., Ahlgren, S. Assessing teratogenic changes in a zebrafish model of fetal alcohol exposure. J Vis Exp. (61), (2012).
  30. Addiscott, T. M. Fertilizers and nitrate leaching. Agricultural Chemicals and the Environment, Issues in Environmental Science and Technology. , book 5 1-26 (1996).
  31. Su, Y. F., Lu, L. H., Hsu, T. H., Chang, S. L., Lin, R. T. Successful treatment of methemoglobinemia in an elderly couple with severe cyanosis: two case reports. Journal of Medical Case Reports. 6 (290), (2012).
  32. Harvey, M., Cave, G., Chanwai, G. Fatal methaemoglobinaemia induced by self-poisoning with sodium nitrite. Emergency Medicine Australasia. 22, 463-465 (2010).
  33. Nishiguchi, M., Nushida, H., Okudaira, N., Nishio, H. An autopsy case of fatal methemoglobinemia due to ingestion of sodium. Forensic Research. 6, (2015).
  34. Avdesh, A., Chen, M., Martin-Iverson, M. T., Mondal, A., Ong, D., Rainey-Smith, S., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), (2012).
  35. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  36. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  37. Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Эмбрионы zebrafishтератогенные эффектывоздействие нитритовнитрит натриятоксикология развитиявыживаемость эмбрионовперикардиальный отекплавательный пузырькраниофациальные мальформациибуфер E3
Данио рерио в качестве модели для оценки тератогенных потенциал Нитрит
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.