Методическая статья

Выделение и характеристика Mouse антрального ооцитов на основе организации хроматина ядрышка

DOI:

10.3791/53616

⸱

7 января 2016 г.

 , 
1Research Center for Regenerative Medicine, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, 2Department of Biology and Biotechnology "L. Spallanzani", University of Pavia

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы приводим протокол для характеристики мыши антральных ооцитов, основанных на ядрышек организации.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает простой и быстрый метод выделения и характеристики антральных ооцитов мыши GV (Germinal Vesicle) как способных (SN, Surrounded Nucleolus) или неспособных (NSN, Not Surrounded Coreolus) развиваться до стадии бластоцисты после созревания in vitro (IVM) и экстракорпорального оплодотворения (IVF). Он использует Hoeschst33342 (или любой другой интеркалирующий краситель ДНК), способный связываться с гетерохроматином ядрышка, показывающим кольцо в SN-ооцитах или нет, как в NSN-ооцитах. Это самый простой и быстрый способ сортировки обоих антральных ооцитов, которые в конечном итоге могут быть использованы для процедур IVM или ЭКО.

Вкратце, протокол состоит из следующих этапов: инъекция гормона для стимуляции роста фолликулов; выделение ооцитов на стадии GV из антрального отдела путем прокола яичника стерильной иглой; подготовка тонких стеклянных пипеток для пипетирования ооцитов во рту; сортировка ооцитов с помощью Hoechst33342, приготовленного в наджизненной концентрации; ЭКО, ЭКО или любой другой молекулярный/клеточный анализ.

К сожалению, до сих пор мало доказательств для сортировки ооцитов SN и NSN с использованием менее инвазивных методов. Если и как только они будут идентифицированы, они потенциально могут быть применены к вспомогательным репродуктивным технологиям человека, хотя и с некоторыми аспектами, которые должны быть изменены. На сегодняшний день этот метод имеет потенциальные последствия для резкого увеличения числа успешных процедур КБПБ и ЭКО как у исчезающих видов, так и у видов, представляющих экономический интерес.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Антральных полностью выращенные ооциты (GV, зародышевый пузырек), выделенные из антрального отделения яичника обычно используются для различных целей, таких как, например, изучение молекулярных и клеточных механизмов за созревание в пробирке до стадии II Метафаза.

Несмотря на их красивый внешний вид наиболее антральных ооцитов, но не все, могут завершить мейоза и достичь стадии бластоцисты; В самом деле, во многих видов млекопитающих, включая человека 1,2, примерно 30% из них задержать их развитие на этапе 2-клеточной, если происходит оплодотворение 3-5. На сегодняшний день, несколько параметров используются для различения между ооцитов, способных выдержать эмбрионального развития от тех, кто не сделать.

Например, Cresyl синий окрашивание (BCB) является допустимым методом для сортировки ооциты на основе активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, хотя-полезность этого метода сортировки, связанные с BCB + или BCB- окрашиванияпо-прежнему зависит 6-8 лаборатория.

Другой хорошо признанным методом заключается в их организации хроматина: если окрашивали либо интеркалирующих ДНК красителей (как Hoechst33342), 70% из антральных ооцитов показать кольцо красителя-положительных вокруг ядрышка и называются окружении ядрышка (SN), а оставшиеся 30% показать более пятнистых позитивные сигналы и называются не окружены Ядрышка (NSN) 3-5. Недавно мы показали, что отсутствие цитоплазматических решеток 9 (CPLS, важных мест хранения матерински полученных мРНК и рибосом в обоих ооцитов млекопитающих и эмбрионов) 10 и вниз регулирование MATER (важно для формирования CPLS 11), вместе с наличием липидов капли в цитоплазме их 9,12, могут быть и другие причины, связанные с невозможностью ооцитов NSN, чтобы продолжить за пределы стадии 2-клеток.

К сожалению, мало методы могут быть применены для сортировки антрального SN и NSN ооцитов и,по этой причине, развитие менее инвазивных методов (без ядерного окрашивания, процедуры фиксации или манипуляции с рот пипетками) может стать очень важно повысить ставки как эмбрионального развития человека и животных.

В этой статье мы подробно простой и быстрый протокол, используемый для выделения объявления сортировки SN и NSN антральных ооцитов из самок мышей и оно адресовано всем заинтересованным ученым в изучении женской гаметы, созревание яйцеклетки и развития зародыша.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол ведется в соответствии с руководящими принципами европейской (ЕС 63/2010) и итальянских (26/2014) законов, защищающих животных, используемых для научных исследований. Шейки дислокации эвтаназия используется для изоляции яичников и осуществляется экспертом и обучение лиц, перечисленных в утвержденном протоколе, охватывающий это исследование.

1. Животные

  1. Поддержание взрослый 3- до 6-недельных самок мышей в комнате с регулируемой температурой и влажностью (с фазами 12L: 12D и кормили вволю).
  2. Вводите мышей внутрибрюшинно 2,5 МЕ Беременные кобылы сыворотке гонадотропина (PMSG), чтобы стимулировать рост фолликулов, имитируя эффект фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Изолировать яичники для антральных ооцитов сбора 48 часов позже. Эвтаназии женский мышь ранее введенный с ГСЖК, в соответствии с вашими институциональных принципов.
  3. Быстро удалить яичники из полости тела и поместить их в чашку Петри продолжениеAining M2 среду для последующего выделения ооцитов (раздел 3).
    1. Сделать надрез на коже покрывающей брюшную стенку с последующим разрез в брюшной полости с помощью ножниц рассечение стерильные. Откройте разрез, чтобы обнажить живот, двигаться кишки на одной стороне с использованием стерильных пинцетов и локализовать маточные трубы, образуя V-образную форму, начиная от мочевого пузыря.
    2. Соблюдайте яичники, расположенные ниже почек. Удерживайте каждую трубку стерильной пинцета и сделать небольшой надрез в нижней части яичников, чтобы освободить их. Передача обоих яичников в нижней части чашку Петри, содержащую предварительно уравновешенную среду.

2. Гормон Подготовка

  1. Развести PMSG (доступный в различных концентрациях фондовых) с стерильного раствора изотонический солевой раствор, чтобы получить рабочую концентрацию 2,5 МЕ гормона в 0,1 мл в течение соответствующего объема впрыска.
    Примечание: Гормон растворы должны быть аликвоты в 0,5 мл пробирки и хранили при -20 ° С до дня применения. Не держите разводненной аликвоты дольше, чем три месяца при -20 ° C. После оттаивания, если выполняются последовательные инъекции, хранить аликвоты гормонов решений при +4 ° С и использовать их в течение 4 дней.

3. Антраль Ооциты Изоляция

Для правильной изоляции ооцитов:

  1. Равновесие M2 среду 13 (М2) в 5% CO 2 и 37 ° C в течение не менее 1 часа перед началом процедуры выделения ооцитов. Приготовьте два чашки Петри (35 мм х 10 мм), в одной из 1 мл м2 для яичников прокалывания и второй с мелких капель (20 мкл) М2, покрытого минеральным маслом (~ 1,5 мл) для передачи ооцитов после выделения из яичников (см 3,4-3,6). Держите обе чашки Петри в термостате при 5% CO 2 и 37 ° С до готовности, которые будут использоваться.
  2. Используйте стереомикроскопа во время процедуры изоляции ооцитов.
  3. Подготовка тонких стеклянных пипеток рот, чтобы собрать ооциты стретчHing стекла пипетки Пастера хранится в горизонтальном (удерживая концы пипетки с обеих рук), по вертикальной пламени, выходящего из горелкой Бунзена (рисунок 1).
    1. После того, как стекло начинает плавиться, принимать пипетки из пламени и выполнять быстрое движение вытягивания, чтобы получить желаемый пипетки. Плотно сократить избыточное стекло близко к узкой точки пипетки с ногтями, чтобы отрегулировать длину и диаметр внутренней капилляра. Убедитесь, что тонкая капиллярная имеет внутренний диаметр ~ 100 мкм, несколько большую, чем диаметр ооцита (~ 80 мкм).
    2. Для рот пипеткой, подключите один конец трубки аспиратора в выдвинутом пипетки с помощью соответствующего наконечник и поместите другой конец в рот, закрепив его с зубами.
  4. Сбор яичников с использованием стерильных пинцетов и хранение их на дне для культивирования клеток Петри (35 мм х 10 мм). Покрытие их с 1 мл М2, предварительно уравновешенную при 37 ° Си 5% СО 2 (рисунок 2).
  5. Осторожно проколоть антральных фолликулов яичников с помощью стерильного шприца инсулина иглы, чтобы освободить антральных ооцитов в М2 (рис 3).
  6. Осторожно рот пипеткой ооциты через узкий пипетки Пастера, чтобы удалить фолликулярных клеток и любую другую возможную мусора тканей (фиг.4А) и затем разрешать их в нижней части мелких капель (20 мкл) М2, покрытых минеральным маслом, подходящей для культивирования эмбрионов (ранее подготовлен; 4В).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы удалить все кучевые клетки, прикрепленные к пеллюцида ооцитов непрерывным отбором через несколько различных и капель М2. Выполните этот шаг как можно быстрее, чтобы избежать изменения в рН среды.

4. Антраль Ооциты Окрашивание Hoechst33342

ПРИМЕЧАНИЕ: антрального ооциты можно выделить SN (Окруженный ядрышка), NSN (не окружен ядрышко) илив любой другой форме промежуточного, на основе их организации хроматина после окрашивания прижизненной концентрации Hoechst33342 (или любой другой маркеров, специфических для баз в) 14. В самом деле, ооциты SN показывают Hoechst-положительный кольцо вокруг ядрышек, а не НСН, следовательно, его имя.

Для правильной окрашивания ооцитов:

  1. Передача ооцитов с использованием рот пипеткой в ​​капли Hoechst33342 (20 мкл) разводили в М2 в прижизненной концентрации 50 нг / мкл в течение 10 мин в темноте.
  2. После инкубации с Hoechst33342, передавать каждый отдельный ооцит с рот пипеткой в ​​нижней части мелких капель (5 мкл) М2, покрытых минеральным маслом, для сортировки основан на организации хроматина (SN или НСН). Используйте любой флуоресцентный микроскоп, оснащенный фильтром Hoechst33342 (длина волны излучения 486 нм), чтобы визуализировать конфигурацию хроматина ооцитов.
    Примечание: В зависимости от типа используемого флуоресцентного микроскопа, ят может стать обязательным для использования со стеклянным дном чашки Петри для получения изображения. Конфокальная микроскопии Olympus Fluoview Fv10i, оснащена держателем образцов для 35 мм блюдо требует только стекло снизу блюда на приобретение изображений, с толщиной 0,17 стандартного мм и в диапазоне от 0,13 до 0,21 мм приемлемых.
  3. Excite ооциты не более чем на 5-10 сек, вероятно, достаточно времени, чтобы визуализировать наличие или отсутствие кольца вокруг ядрышка (рис 5).
  4. После сортировки, культура антральный SN и NSN ооцитов в М2 в 5% СО 2 и 37 ° C, чтобы вызвать созревание в пробирке или держать их в соответствующих буферов для молекулярных или клеточных анализов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующие фотографии показывают метод, используемый для выделения ооцитов антральных из яичников мышей, начиная от подготовки к пипетки сортировки ооцитов »с помощью Hoechst33342. Этот метод достаточно прост и может быть выполнена в любой лаборатории, оборудованной СО 2 инкубаторе, стереомикроскопа и флуоресцентный микроскоп оснащен правильной фильтр для наблюдения за Hoechst33342 Рисунок 1 показывает начальный этап подготовки пипетки:. В качестве стекла начин...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает метод, используемый, чтобы изолировать и классифицировать мыши антральных GV ооцитов. Там нет особых важных шагов, чтобы подчеркнуть, с несколькими исключениями. Во-первых: эта процедура должна быть выполнена как можно быстрее, чтобы: а) поддерживать жизнеспособность ооцитов и б) избежать изменения рН в среде, используемой. Во-вторых, ооциты должны быть кратко возбужден (5-10 сек), чтобы Hoechst33342, чтобы избежать повреждения хроматина и последующей гибели ооцитов, особенно если IVM и IVF следу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.M. и C.A.R. выражают признательность за финансовую поддержку Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M и C.A.R. благодарят Марианну Лонго за помощь в подготовке изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PMSGSigmaG4527
EmbrioMax M2MilliporeMR-015-PD
Hoechst33342Thermo Scientific62249
Минеральное маслоSigmaM8410
Чашка для клеточных культур 35ммx10ммCorning430165
&микро-чашка 35мм, высокое стеклянное дноIbidi81158
Пипетка Пастер БоросиликатCorning7095D-9
Аспираторные трубки в сборе для калиброванных микростолбовых пипетокSigmaA5177

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
  2. Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).
  3. Mattson, B. A., Albertini, D. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase. Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).
  4. Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics. Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).
  5. Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organisation during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).
  6. Wu, Y. G., et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model. Cell Res. 17, 722-731 (2007).
  7. Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP). Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).
  8. Labrecque, R., Sirard, M. A. The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges. Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).
  9. Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte. Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).
  10. Yurttas, P., et al. Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo. Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).
  11. Li, L., Baibakov, B., Dean, J. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).
  12. Ami, D., et al. FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence. Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).
  13. Fulton, B. P., Whittingam, D. G. Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium. Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).
  14. Luttmer, S. J., Longo, F. J. Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide). Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).
  15. Monti, M., Redi, C. A. The biopolitics of frozen embryos. Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Hoechst 33342in vitroin vitro

Похожие статьи