Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Синтез наночастиц золота Интегрированный фотография проблематики липосом и измерении их микропузырьков кавитации при импульсном лазерном возбуждении

7.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53619

⸱

24 февраля 2016 г.

 ,  ,  , 
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University, 2Division of Physics, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University, 3NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine, Nanyang Technological University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает простой способ подготовки к золотой наночастицы интегрированной фотоальбомы проблематику липосом с коммерчески доступных материалов. Она также показывает, как измерить микропузырьков процесс кавитации синтезированных липосом при лечении импульсным лазером.

Аннотация

Фоточувствительные наночастицы (НЧ) привлекли значительное внимание из-за их потенциала в обеспечении пространственного, временного и дозового контроля над высвобождением лекарственного средства. Тем не менее, большинство соответствующих технологий все еще находятся в процессе разработки и не могут быть приобретены клиниками. В данной статье мы описываем легкое изготовление этих фоточувствительных НЧ с коммерчески доступными золотыми НЧ и термочувствительными липосомами. Кальцеин используется в качестве модельного препарата для оценки эффективности инкапсуляции и кинетического профиля высвобождения при тепловой/световой стимуляции. Наконец, мы показываем, что это фото-триггерное высвобождение происходит из-за разрушения мембраны, вызванного микропузырьковой кавитацией, которую можно измерить с помощью гидрофона.

Введение

Возможность вызвать высвобождение лекарства с помощью внешних стимулов является привлекательным способом для доставки лекарств в пространственно-, temporal- и лекарственных управлением мод с максимальным специфичности и минимальными побочными эффектами. Среди широкого спектра экзогенных раздражителей проблематику систем (света, магнитное поле, ультразвук, СВЧ-излучение), легкие инициируется платформы являются привлекательными из-за их не-инвазивности, простота и адаптивности в клиниках. 1 Обширные исследования в последнее десятилетие предоставил ряд технологий платформы, такие как в ближней инфракрасной области освещенности ответственного золота (Au) наноклетки покрыты смарт полимеров, 2 фото-лабильным, полимерные наночастицы (NPS), конъюгированные с наркотиками, 3 и самоорганизующихся porphysome nanovesicles. 4 Однако эти технологии все еще находятся на доклинических стадиях развития, и требуют четкого понимания и оптимизации параметров, участвующих в процессе инициирования и продолжениепрокатки высвобождение лекарственного средства.

Один из самых простых и легкодоступных способов получения такой системы состоит в интеграции Au NPS с термически чувствительных липосом 5,6, оба из которых широко доступны на рынке и широко исследованных в доклинических и клинических испытаний даже. Несмотря на ограничение активации глубокие ткани из Au наночастиц при их плазмонного волны, по сравнению с ближней инфракрасной активированные наноструктур Au (например, наноклетки), эта система по-прежнему имеет большие перспективы при использовании в малых животных или для местной доставки в организме человека. 7 Есть некоторые ранние усилия в объединение Au NPS с липосомами для светлой срабатывает выпуска. 8-11 Хотя большинство из них сосредоточиться на новизне материалов, проблемы доступности и масштабируемости необходимо решать. Кроме того, отчеты о механизмах высвобождения, использующих эти наноносителей все еще ограничены.

В данном случае изготовление фото-отзывчивымлипосомы, одновременно с грузом наркотиков и гидрофильных Au наночастиц была описана. Кальцеин используется в качестве модельного соединения для оценки эффективности инкапсуляции и профиль высвобождения системы. Кроме того, в этой системе, свет, поглощенный Au наночастиц рассеивает в окружающую микросреду в виде тепла, что приводит к увеличению локальной температуры. Воздушные микропузырьки образуются в процессе лазерного нагрева и вызвать механическое разрушение липосом (рисунок 1). Механизм микропузырьков кавитации подтверждается измерениями гидрофонов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка

  1. Чистые 100 мл с круглым дном колбы с использованием царской водки (1 часть концентрированной азотной кислоты (HNO 3), и 3 частей концентрированной соляной кислоты (HCl)) и мыть колбы дистиллированной водой. Автоклав колб и высушить их в печи с горячим воздухом при температуре 100 ° С в течение 15 мин. Оберните и не хранить стерильные колбы до использования.
  2. Стерилизовать ручной набор мини-экструдер с использованием 70% этанола.
  3. Включите роторном испарителе и установить температуру горячей водяной бане и градирни при 37 ° С и 4 ° С соответственно.
  4. Подготовьте 60 мм кальцеиновыми маточного раствора путем растворения 374 мг кальцеина в 10 мл 0,1 мМ фосфатным буферным раствором (PBS) (рН 7,4). Доводят рН до 7,4 с помощью 1 М раствора гидроксида натрия (NaOH).

2. Синтез липосом

  1. Удалить липиды (1,2-Dipalmitoyl- SN глицеро-3-фосфохолин (ДПФХ), 1-пальмитоил-2-гидрокси-SN глицеро-3-phosphochoЛиния (MPPC) и 1, 2-distearoyl- SN глицеро-3-phosphoethanol-аминов N - [карбокси (полиэтиленгликоль) -2000] (соль аммония) (DSPE-PEG2000)) из морозильника (-20 ° С) и оттаивать их до комнатной температуры.
  2. Взвешивание 15,9 мг ДПФХ, 1,3 мг MPPC и 2,8 мг DSPE-PEG2000. Растворите их вместе в 2 мл хлороформа.
  3. Передача раствора хлороформа к стерильной круглодонной колбе и испарения растворителя с использованием роторного испарителя при пониженном давлении, чтобы сформировать тонкую, сухую липидный слой.
  4. Гидрат липидный слой при 45 ° С с 2 мл водного раствора в течение 30 мин, содержащей 1,95 мл 60 мМ кальцеиновыми полученного на стадии 1.4, и 50 мкл Au NPS (3,36 × 10 16 частиц / мл).
  5. Предварительно нагреть нагревательный блок до 45 ° С. Поместите фильтр поликарбонатную мембрану 200 нм между фильтрующим опор и собрать множество мини-экструдера. Проверьте потенциальную утечку с дистиллированной водой.
  6. Заполните один из шприцов 1 мл раствора липосом с шага 2.4 и extruде образца пропусканием раствора к шприцу на другом конце сборки мини-экструдере. Повторите 11 раз.
  7. Запуск синтезированные липосом через колонку обессоливания PD-10 для удаления свободных Au NPS, липиды и кальцеина помощью PBS в качестве элюента соответствии с протоколом производителя.
  8. Хранить образцы в стерильные пробирки при температуре 4 ° С и используют в течение 2 дней.

3. Кальцеин Освобождение от липосом с Кондиционер

  1. Рассчитать липидный молярность раствора путем сложения molarities ДПФХ, MPPC и ДСФЭ-PEG2000 в шаге 2.2. Развести липосома маточного раствора до 5 мм концентрации липидов с использованием 0,1 мМ PBS буфера (рН 7,4). Передача образцов в центрифужную пробирку (2 мл).
  2. Поместите пробирку в горячую водяную баню, и повышать температуру постепенно от 25 до 70 ° C. Повышение температуры со скоростью 1 ° С / мин здесь.
  3. Собирают аликвот (10 мкл) при различных температурных точек (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 и 70 ° С).
  4. Добавить 10 мкл 2% Triton X-100 до 2 мл аликвоты раствора липосомальной переварить липосом в течение 10 мин при комнатной температуре и для достижения полного освобождения кальцеина.
  5. Передача 200 мкл раствора липосомальной в каждую лунку в 96-луночный микропланшет и измеряют интенсивность флуоресценции собранных образцов с использованием ридера флуоресценции микропланшетов. Возбуждения и излучения длин волн кальцеина являются 480 и 515 нм соответственно.
  6. Принимая интенсивность флуоресценции Тритон Х-100, обработанных образцов за 100% выпуска, вычислить процент высвобожденного кальцеина в каждый момент времени, используя формулу:
    figure-protocol-1
    Ft является интенсивность флуоресценции раствора в данной точке времени. F я и F х нормированные начальные и конечные интенсивности флуоресценции раствора соответственно.

4. Кальцеин Reарендовать у липосом с импульсным лазером

  1. Передача 100 мкл раствора липосом в кварцевую кювету и поместите его в держатель кювет. Используйте импульсный Nd: YAG лазер с длительностью импульса 6 нс при 532 нм в качестве источника света. Используйте следующую параметров лазера - Частота повторения: 1 Гц; Плотность Лазерная энергия: 1 мДж / см 2; Диаметр луча: 0,5 мм.
  2. Руководство коллимированный лазерный луч через кювету таким образом, что свет проходит через раствор липосом и собирать аликвот после различных импульсов.
  3. Добавить 10 мкл 2% Triton X-100 до 2 мл аликвоты раствора липосомальной переварить липосом в течение 10 мин при комнатной температуре и для достижения полного освобождения кальцеина.
  4. Учитывая кальцеина чувствителен к свету и может быть беленой течение лазерного эксперимента, предварительно измерить отбеливающий эффект импульсного лазера на кальцеиновой раствора для нормализации данных от выпуска липосом.
    1. В частности, выставить кальцеина решение (60 мм) до импульсного лазерного Wiй частоте 1 Гц в течение различного количества импульсов (0, 25, 50 и 100). Измерить интенсивность флуоресценции кальцеиновыми с возбуждения и излучения длиной волны 480 и 515 нм соответственно, до и после лазерного воздействия.
    2. Рассчитать количество отбеливания (интенсивность флуоресценции кальцеина перед интенсивности лазерного воздействия / флуоресценции кальцеина после определенного числа импульсов). Используйте этот фактор для нормализации значений, полученных из образцов липосом путем умножения интенсивности флуоресценции липосом с коэффициентом.
  5. Измерить интенсивность флуоресценции отобранной пробы с помощью устройства чтения флуоресценции микропланшетов при возбуждения и излучения длин волн при 480 и 515 нм соответственно.
  6. Принимая интенсивность флуоресценции Тритон Х-100, обработанных образцов за 100% выпуска, вычислить процент высвобожденного кальцеина на каждом номера импульса, используя формулу:
    figure-protocol-2
    Ft является интенсивность флуоресценции раствора при заданном числе импульсов после нормализации. F я и F х нормированные начальные и конечные интенсивности флуоресценции раствора соответственно.

5. Измерение импульсов давления

  1. Поместите 100 мкл образца на предметное стекло и установить фокус лазера на образец.
  2. Погрузитесь иглы гидрофон (диаметр 1 мм и 450 чувствительность нВ / Па) в растворе.
    Внимание: Гидрофон не должен быть освещен светом лазера, чтобы избежать повреждения.
  3. Облучать образец с импульсным лазером с различным числом импульсов (0-100) и энергии импульса (20-160 мкДж / импульс).
  4. Запись сигналов давления использовании цифрового осциллографа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Липосомы получали при помощи обычного способа тонкая гидратации пленки с DPPC, MPPC и ДСФЭ-PEG2000 в молярном соотношении 86: 10: 4 или 7,95: 0,65:. 1,39 мг / мл 12 Размер Au наночастиц является критическим для определения свет нагреть эффективность преобразования в ходе следующего эксперимента возбуждения лазера. Меньший размер Au наночастиц, тем выше эффективность трансдукции. Были выбраны 13 Так 5 нм Au наночастицы, наименьшее образцы от поставщика для инкапсуляц...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Тонкий гидратации пленки является обычным методом для получения липосом. Органические растворители (хлороформ в данном случае) впервые были использованы для растворения липидов, а затем удаляют на роторном испарителе при 37 ° С для генерирования липидный тонкую пленку на колбу. Это липидную пленку гидратируют водным раствором, содержащим 60 мм кальцеин и 5 нм Au NPS. Во время процесса гидратации, поддерживая температуру около 50 ° С, и колбу постоянном перемешивании при вращении колбы. Ключ в этом шаге является выбор те...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов не объявлены.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Tier-1 академический исследовательские фонды по Министерство образования Сингапура (RG 64/12 к CX) и NTU-Northwestern Института Наномедицины.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DPPC)Avanti Polar Lipids (Алабама, США)850355Pпорошок, хранить при -20 °°; C
1-пальмитоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфохолин (MPPC)Avanti Polar Lipids (Алабама, США)855675Pпорошок, хранить при -20 °°; C
1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтанол-амин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (соль аммония) (DSPE-PEG2000)Avanti Polar Lipids (Алабама, США)880120Pпорошок, хранить при -20 °°; C
Наночастицы золотаSigma Aldrich752568-100mL5  нм частицы, стабилизированные при 0,1&nb.л; mM
PBS КальцеинSigma AldrichC0875-10G60  мМ, pH 7,4 (скорректировано с использованием NaOH)
фосфатный буферный физиологический раствор (PBS)Sigma AldrichP54930,1 mM, pH 7,4
Двойная дистиллированная водаMillipore Milli-DI система
Triton X100   Sigma, Life SciencesX-100Для разрушения липосом для расчета общей инкапсуляции
Rotavapor   Buchi (Швейцария)R 210Используется для приготовления липосизма
Нагревательная баняBuchi (Швейцария)B 491Используется для приготовления липосизма
Вакуумный контроллер   Buchi (Швейцария)V-850Используется для приготовления липоссме
Вакуумный насосBuchi (Швейцария)V-700Используется для приготовления липоссме
Рециркуляционная ванна с регулятором температурыPolyscienceИспользуется для приготовления липоссме
Мини-экструдер в сборе с нагревательным блоком Avanti Polar Lipids (Алабама, США)610000Используется для экструзии липосом
Шприцы, 1,000 μ lAvanti Polar Lipids (Алабама, США)610017Используется для экструзии липосом
Поликарбонатная фильтрующая мембрана, 200  nmWhatmann800281Используется для экструзии липосом
Filter SupportAvanti Polar Lipids (Алабама, США)610014Используется для экструзии липосом
PD 10 Обессоливание кулумнов, Sephadex G-25 mediumGE Healthcare, Life sciences17-0851-01Используется для очистки липосом
Центрифуга   Лабораторные центрифуги Sigma3K30Используются для концентрирования липосомального раствора 
РоторSigma19777-HИспользуется для концентрирования липосомального раствора 
Зетазер   Nano ZS MalvernИспользуется для определения размера липосом и зетапотенциала
УФ-видимого спектрофотометраShimadzuUV-2450Используется для измерения поглощения образцов
Флуоресцентный спектрофлуориметр   Молекулярные приборыSpectraMax M5используются для измерения флуоресцентного излучения образцов
Nd:YAG лазеромNewWave Research532 нм; Максимальная мощность: 17  Мдж; Ширина: 406  nsec; Используется для облучения образца
гидрофон HNR ONDAHNR-1000диаметром 1 мм и чувствительностью 450 нВ/Па, Правильный диапазон рабочих частот: 0,25-10  МГц; Калибровка: 50  мВ/бар; Используется для измерения акустических сигналов
цифровой осциллоскопLECORY - Wave Runner 64Xi-AЧастота: 600 МГц; Максимальная частота дискретизации: 10  Гвыб/сек (при двух каналах); Используется для записи измеренных акустических сигналов
очистки воды

Ссылки

  1. McCoy, C. P., et al. Triggered drug delivery from biomaterials. Expert Opin. Drug Deliv. 7 (5), 605-616 (2010).
  2. Yavuz, M. S., et al. Gold nanocages covered by smart polymers for controlled release with near-infrared light. Nat. Mater. 8 (12), 935-939 (2009).
  3. Gohy, J. F., Zhao, Y. Photo-responsive block copolymer micelles: design and behavior. Chem. Soc. Rev. 42 (17), 7117-7129 (2013).
  4. Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat. Mater. 10 (4), 324-332 (2011).
  5. Needham, D., Dewhirst, M. W. The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors. Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (3), 285-305 (2001).
  6. Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. Nanoscale drug delivery and hyperthermia: the materials design and preclinical and clinical testing of low temperature-sensitive liposomes used in combination with mild hyperthermia in the treatment of local cancer. Open Nanomed. J. 3, 38-64 (2011).
  7. Sykes, E. A., Dai, Q., Tsoi, K. M., Hwang, D. M., Chan, W. C. Nanoparticle exposure in animals can be visualized in the skin and analysed via skin biopsy. Nat. Commun. 5, 3796(2014).
  8. Paasonen, L., et al. Gold nanoparticles enable selective light-induced contents release from liposomes. J. Control. Release. 122 (1), 86-93 (2007).
  9. Wu, G., et al. Remotely Triggered Liposome Release by Near-Infrared Light Absorption via Hollow Gold Nanoshells. J. Am. Chem. Soc. 130 (26), 8175-8177 (2008).
  10. Leung, S. J., Kachur, X. M., Bobnick, M. C., Romanowski, M. Wavelength-Selective Light-Induced Release from Plasmon Resonant Liposomes. Adv. Funct. Mater. 21 (6), 1113-1121 (2011).
  11. Volodkin, D. V., Skirtach, A. G., Möhwald, H. Near-IR Remote Release from Assemblies of Liposomes and Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (10), 1807-1809 (2009).
  12. Mills, J. K., Needham, D. Lysolipid incorporation in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membranes enhances the ion permeability and drug release rates at the membrane phase transition. Biochim. Biophys. Acta. 1716 (2), 77-96 (2005).
  13. Jiang, K., Smith, D. A., Pinchuk, A. O. Size-dependent Photothermal Conversion Efficiencies of Plasmonically Heated Gold Nanoparticles. J. Phys. Chem. C. 117 (51), 27073-27080 (2013).
  14. Chongsiriwatana, N., Barron, A. Comparing bacterial membrane interaction of antimicrobial peptides and their mimics. Antimicrobial Peptides. Giuliani, A., Rinaldi, A. C. 618, Humana Press. 171-182 (2010).
  15. Egerev, S., et al. Acoustic signals generated by laser-irradiated metal nanoparticles. Appl. Opt. 48 (7), C38-C45 (2009).
  16. González, M. G., Liu, X., Niessner, R., Haisch, C. Strong size-dependent photoacoustic effect on gold nanoparticles by laser-induced nanobubbles. Appl. Phys. Lett. 96, 174104(2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Синтез наночастиц золота Интегрированный фотография проблематики липосом и измерении их микропузырьков кавитации при импульсном лазерном возбуждении
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.