Методическая статья
Мы здесь, в описания анализа путем сочетания идентификации ДНК аденин метилтрансферазы (DamID) для высокой пропускной последовательности (DamID-след). Этот усовершенствованный способ обеспечивает более высокое разрешение и широкий динамический диапазон и позволяет анализировать DamID-SEQ данные в сочетании с другими данными секвенирования с высокой пропускной способностью, таких как чип-SEQ, РНК-SEQ и т.д.
Анализ идентификации ДНК-аденинметилтрансферазы (DamID) является мощным методом обнаружения белок-ДНК-взаимодействий как локально, так и по всему геному. Это альтернативный подход к иммунопреципитации хроматина (ChIP). Экспрессированный гибридный белок, состоящий из представляющего интерес белка и ДНК-аденинметилтрансферазы E. coli, может метилировать адениновое основание в мотивах GATC вблизи сайтов белок-ДНК-взаимодействий. Затем метилированные аденин-метилированными фрагментами ДНК можно целенаправленно амплифицировать и обнаружить. Оригинальный анализ DamID обнаруживает геномные местоположения метилированных фрагментов ДНК путем гибридизации с ДНК-микрочипами, что ограничено доступностью микрочипов и плотностью заранее определенных зондов. В этой статье мы подробно описываем протокол интеграции высокопроизводительного секвенирования ДНК в DamID (DamID-seq). Большое количество коротких прочтений, генерируемых с помощью DamID-seq, позволяет обнаруживать и локализовать белок-ДНК-взаимодействия по всему геному с высокой точностью и чувствительностью. Мы использовали анализ DamID-seq для изучения взаимодействий геном-ядерная пластинка (NL) в клетках млекопитающих и заметили, что DamID-seq обеспечивает высокое разрешение и широкий динамический диапазон при обнаружении взаимодействий геном-NL. Подход DamID-seq позволяет исследовать ассоциации NL в структурах генов и сравнивать карты взаимодействия геном-NL с другими функциональными геномными данными, такими как ChIP-seq и RNA-seq.
ДНК метилтрансферазы идентификация аденин (DamID) 1,2 является метод обнаружения взаимодействий белок-ДНК в естественных условиях и является альтернативным подходом к иммунопреципитации хроматина (чип) 3. Он использует относительно небольшое количество клеток и не требует химической сшивки белка с ДНК или очень специфических антител. Последнее особенно полезно, когда целевой белок слабо или косвенно связаны с ДНК. DamID успешно используется для отображения сайты связывания различных белков, включая ядерное белков оболочки 4-10, хроматина белков, ассоциированных с 11-13, хроматина изменения ферменты 14....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
1. Генерация и экспрессия слитых белков и бесплатно Dam белков
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Гибридный белок Dam-V5-LmnB1 была проверена быть совместно локализованы с эндогенного белка по иммунофлуоресцентного Ламин B (рис 1).
Успешное ПЦР-амплификации из аденина-метилированных фрагментов ДНК является ключевым шагом для DamID-SEQ. Экспериментальные образцы должны усиливать мазок 0,2 - 2 Кб, отрицательных контролей (без DpnI, без лигазы или без ПЦР шаблона) должно привести к не-или-менее ясно усиления .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Вопрос о том, сохраняют ли белки, меченные Dam, функции эндогенных белков, должен быть изучен до проведения эксперимента с DamID-seq. Субклеточную локализацию Dam-меченых белков ядерной оболочки всегда следует определять и сравнивать с таковой эндогенных белков. Для изучения факторов транскрипции предлагается изучить, может ли белок Dam-fusion спасти функции эндогенного белка в регуляции экспрессии генов. Этот функциональный тест может быть проведен на организмах, в которых доступны нокаут-мутанты эндогенных ДНК-связываю.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторам нечего раскрывать.
Мы благодарим доктора Баса ван Стинселя за предоставление векторов экспрессии млекопитающих DamID. Мы благодарим Йельский центр анализа генома и Ядро геномики Йельского центра стволовых клеток за советы по подготовке библиотек NGS и внедрению высокопроизводительного секвенирования ДНК. Эта работа была поддержана финансированием стартапа от Йельской школы медицины, грантом на развитие ученых от Американской кардиологической ассоциации (12SDG11630031) и грантом от Connecticut Innovations, Inc. (13-SCA-YALE-15).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| ViraPower Лентивирусные системы экспрессии | Life Technologies | K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20 и K371-20 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11791-020 | |
| DNeasy Blood & Набор салфеток (250) | QIAGEN | 69506 или 69504 | |
| Gateway pDONR 201 | Life Technologies | 11798-014 | |
| 293T клетки | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| Trypsin-EDTA (0,05%), фенол красный | Life Technologies | 25300-054 | |
| DMEM, высокий уровень глюкозы, пируват | Life Technologies | 11995-065 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Sigma | F4135 | |
| Трис | марка не критична | ||
| ЭДТА | марка не критична | ||
| 200 Proof EtOH | марка не критична | ||
| Изопропанол | марка не критична | ||
| Ацетат | марка не критична | ||
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | поставляется с буферными |
| адаптерами DamID "AdRt" и "AdRb" | Интегрированные DNA Technologies | последовательности, доступные в арт. 24; без фосфорилирования 5' или 3' конца для предотвращения самолигирования. | |
| T4 DNA Ligase | Roche Life Science | 10481220001 | с буфером |
| DpnII | New England Biolabs | R0543 | с буфером |
| DamID PCR праймер "AdR_PCR" | Интегрированные DNA Technologies | последовательности доступны в ref. 24 | |
| Набор растворов дезоксинуклеотидов (dNTP) | England Biolabs | N0446 | по 100 мМ каждый из dATP, dCTP, dGTP и dTTP |
| Преимущество 2 Полимеразная смесь | Clontech | 639201 | в комплекте с буфером |
| 1Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787018 | 1.0 &; g/µ l |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 или 28106 | |
| MinElute PCR Purification Kit | QIAGEN | 28004 или 28006 | для объема элюирования менее 30 & микро; l |
| Бусины SPRI / Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63880 | обеспечивают дополнительное перемешивание и больше времени элюирования, если менее 40 & микро; l элюирующий буфер |
| Буфер EB | QIAGEN | 19086 | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348 | поставляется с буфером |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203 | |
| DNA Polymerase I, большой (Klenow) фрагмент | New England Biolabs | M0210 | |
| T4 Полинулеотидкиназа | New England Biolabs | M0201 | |
| Фрагмент Кленоу (3' → 5' exo-) | New England Biolabs | M0212 | поставляется с адаптерами для |
| секвенирования | Интегрированные последовательности DNA Technologies | доступны в ref. 28 | |
| Набор для быстрого лигирования | New England Biolabs | M2200 | используется в 3.4.3; поставляется с буфером для реакции быстрого лигирования и |
| праймером для секвенирования ДНК-лигазы Quick T4 1 и 2 последовательностями | интегрированных технологий ДНК, | доступными в арт. 28 | |
| KAPA HiFi PCR Kit | Kapa Biosystems | KK2101 или KK2102 | поставляются с KAPA HiFi ДНК-полимераза, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer и 10 мМ смеси dNTP |
| агарозы | Sigma Aldrich | A4679 | |
| бромида | этидияSigma Aldrich | E1510-10ML | 10 мг/мл |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 или 28706 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725121 или 1725122 | |
| Спектрофотометр | марки не критично | ||
| 0,45 μ m PVDF Фильтр | марка не критична | ||
| 25 мл Seringe | марка не критична | ||
| 10 см Тарелки для тканевых культур марка | не критична | ||
| 6-луночные тарелки | марка не критична | ||
| S1000 Термоамплификатор | Bio-Rad Laboratories | ||
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | для марки | |
| вихревого смесителя | не критично | ||
| Нагреватель сухого блока или термомиксер | марки не критично | ||
| Марка микроцентрифуги | не критична | ||
| Система гель-электрофореза с питанием | марки не критична | ||
| Магнитная подставка | для очистки ДНК с помощью шариков SPRI; должны вмещать пробирки объемом 1,5-2 мл; бренд не критичный | ||
| УФ транслюминатор | бренд не критичный | ||
| E-гель электрофорез система Life | Technologies | G6400, G6500, G6512ST |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение