Методическая статья

DamID-след: Генома Отображение белок-ДНК взаимодействий с высокой пропускной секвенирования аденина-метилированных фрагментов ДНК

DOI:

10.3791/53620

⸱

27 января 2016 г.

 ,  , 
1Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы здесь, в описания анализа путем сочетания идентификации ДНК аденин метилтрансферазы (DamID) для высокой пропускной последовательности (DamID-след). Этот усовершенствованный способ обеспечивает более высокое разрешение и широкий динамический диапазон и позволяет анализировать DamID-SEQ данные в сочетании с другими данными секвенирования с высокой пропускной способностью, таких как чип-SEQ, РНК-SEQ и т.д.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ идентификации ДНК-аденинметилтрансферазы (DamID) является мощным методом обнаружения белок-ДНК-взаимодействий как локально, так и по всему геному. Это альтернативный подход к иммунопреципитации хроматина (ChIP). Экспрессированный гибридный белок, состоящий из представляющего интерес белка и ДНК-аденинметилтрансферазы E. coli, может метилировать адениновое основание в мотивах GATC вблизи сайтов белок-ДНК-взаимодействий. Затем метилированные аденин-метилированными фрагментами ДНК можно целенаправленно амплифицировать и обнаружить. Оригинальный анализ DamID обнаруживает геномные местоположения метилированных фрагментов ДНК путем гибридизации с ДНК-микрочипами, что ограничено доступностью микрочипов и плотностью заранее определенных зондов. В этой статье мы подробно описываем протокол интеграции высокопроизводительного секвенирования ДНК в DamID (DamID-seq). Большое количество коротких прочтений, генерируемых с помощью DamID-seq, позволяет обнаруживать и локализовать белок-ДНК-взаимодействия по всему геному с высокой точностью и чувствительностью. Мы использовали анализ DamID-seq для изучения взаимодействий геном-ядерная пластинка (NL) в клетках млекопитающих и заметили, что DamID-seq обеспечивает высокое разрешение и широкий динамический диапазон при обнаружении взаимодействий геном-NL. Подход DamID-seq позволяет исследовать ассоциации NL в структурах генов и сравнивать карты взаимодействия геном-NL с другими функциональными геномными данными, такими как ChIP-seq и RNA-seq.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ДНК метилтрансферазы идентификация аденин (DamID) 1,2 является метод обнаружения взаимодействий белок-ДНК в естественных условиях и является альтернативным подходом к иммунопреципитации хроматина (чип) 3. Он использует относительно небольшое количество клеток и не требует химической сшивки белка с ДНК или очень специфических антител. Последнее особенно полезно, когда целевой белок слабо или косвенно связаны с ДНК. DamID успешно используется для отображения сайты связывания различных белков, включая ядерное белков оболочки 4-10, хроматина белков, ассоциированных с 11-13, хроматина изменения ферменты 14, транскрипционных факторов и сопутствующих факторов и РНК-интерференции 15-18 механизмов 19. Метод применим в различных организмов, включая S. Cerevisiae 13, С. pombe 7, С. Элеганс 9,17, Д. MELANOGASTER 5,11,18,20, А. THALIANA 21,22, а также мыши и человека клеточных линий 6,8,10,23,24.

Разработка анализа DamID была основана на специфической детекции аденина-метилированных фрагментов ДНК в эукариотических клетках, которые не имеют эндогенной аденин метилирование 2. Выраженный слитый белок, состоящий из ДНК-связывающего белка, представляющего интерес и Е. палочка ДНК аденин метилтрансферазы (плотины), может метилировать аденин базу в последовательности GATC, которые находятся в пространственной близости (наиболее значительно в течение 1 кб и до примерно 5 кб) сайтов связывания белка в геноме 2. Модифицированные ДНК-фрагменты могут быть специфично амплифицируют и гибридизуют с микрочипов для выявления геномных сайтов связывания белка, представляющего интерес 1,25,26. Это оригинальный способ DamID был ограничен наличием микрочипов и плотности заданных зондов. Поэтому мы интегрировали высокой пропускной последовательности вчтобы DamID 10 и обозначены метод как DamID-SEQ. Большое количество краткосрочных читает полученные от DamID-SEQ позволяет точную локализацию взаимодействий белок-ДНК генома. Мы обнаружили, что DamID-след обеспечил более высокое разрешение и более широкий динамический диапазон, чем DamID по микрочипов для изучения генома ядерной пластинки (NL) ассоциации 10. Это усовершенствованный метод позволяет зондирования NL ассоциации в пределах гена структур 10 и облегчает сравнение с другими данными секвенирования высокой пропускной способностью, таких как чип-SEQ и РНК-SEQ.

DamID-след протокол, описанный здесь был первоначально разработан для отображения генома Л. объединений 10. Мы создали гибридный белок по привязывая мыши или человека Ламин B1 Е. палочка ДНК аденин метилтрансферазы и проходят протокол в 3T3 эмбриональных фибробластов мыши, мыши C2C12 миобластов 10 и IMR90 плода фибробласты легких человека (данные не опубликованы). В этом протоколе, мы начинаем с сonstructing векторы и выражая Дам-привязанных слитые белки от лентивирусного инфекции в клетках млекопитающих 24. Далее, мы опишем подробные протоколы усиления аденин-метилированных фрагментов ДНК и подготовке секвенирования библиотек, которые должны быть применимы в других организмах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Генерация и экспрессия слитых белков и бесплатно Dam белков

  1. Клон интерес белок в вектор DamID.
    1. Amplify кДНК белка интереса (POI) с нужной высокой точностью ДНК-полимеразы и соответствующих праймеров в соответствии с протоколом производителя. Экспериментально определить оптимальные условия амплификации для обеспечения надлежащего усиления вставок.
    2. Запуск в агарозном геле и очищают амплифицированной кДНК POI с помощью набора для экстракции геля в соответствии с протоколом производителя.
    3. Клон кДНК POI в вектор pDONR201 использованием BP Clonase II в соответствии с протоколом производителя.
    4. Клонирование кДНК POI из донорской вектора в вектор назначения pLGW-RFC1-V5-EcoDam или pLGW-EcoDam-V5-RFC1 назначения вектора 27, используя LR Clonase II в соответствии с протоколом производителя, в зависимости от желаемого направления слияния POI к N- или гое С-конец Е. палочка ДНК аденин метилтрансферазы (EcoDam) 27.
    5. Проверка с помощью секвенирования, что клонированной кДНК имеет правильную последовательность и формы в рамке гибридного EcoDam.
  2. Создание лентивирусные запасов.
    1. Создание лентивирусные запасов, выражающие Дам-V5-POI и V5-Дам (от вектора pLGW-V5-EcoDam 27) с помощью лентивирусные системы экспрессии. Используйте вперед процедуру трансфекции в соответствии с протоколом производителя.
      1. Используйте 293T клетки и липофекцию генерировать лентивирусные запасов в соответствии с протоколом производителя для трансфекции.
      2. Включают стадию 0,45 мкм PVDF фильтр.
  3. Инфицировать клетки с лентивирус.
    1. За день до инфекции (день 0), проходят прилипшие клетки культивировали в соответствующей ростовой среде для этого типа клеток в культуре ткани пластины 6-луночного с использованием той же питательной среды без антибиотиков додостижения 50% слияния в день инфекции. Место клеток в 37 ° С инкубатор.
    2. В день инфицирования (день 1), снимите 2 криопробирки обоих Дам-V5-ТОИ и V5-Дам лентивирусных супернатантах от -80 ° C морозильника и место в 37 ° С водяной бане, чтобы таять.
      1. Удалить питательной среды от клеток и заменить 0,5 мл свежей питательной среды без антибиотиков.
      2. Добавить 1 мл талой лентивирус в каждую лунку (2 скважины с V5-Дам и 2 скважины с Дам-V5-POI). Добавить 1 мл питательной среды без антибиотиков на оставшиеся 2 скважин-это будет служить в качестве отрицательного контроля. Осторожно встряхните 6-луночного планшета для смешивания и поместить обратно в 37 ° C инкубатора O / N.
    3. На следующий день после заражения (день 2), снимите вирусных суспензий из клеток и заменить 2 мл питательной среды без антибиотиков. Место клетки обратно в 37 ° C инкубаторе в течение 48 часов.
  4. Изолировать GDNA.
    1. Аспирируйте СМИ из каждой лунки и деTach клетки, используя 250 мкл 0,05% трипсина-EDTA. Инкубируют при 37 ° С в течение 2 мин.
    2. Вымойте клеток с пластинки с 1 мл питательной среды и пипетки клеток из каждой лунки в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Гранул клетки центрифугированием при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    3. Промыть осажденные клетки с 500 мкл PBS и центрифугировать при 200 х г в течение 2 мин при комнатной температуре.
    4. Ресуспендируют гранулированных клеток в 200 мкл PBS.
    5. Изолировать GDNA по крови и тканей комплект в соответствии с протоколом производителя. Элюировать гДНК в 200 мкл буфера AE и определить концентрацию путем измерения оптической плотности 260 с помощью спектрофотометра.
      Примечание: GDNA из неинфицированных или инфицированных клеток макет может быть выделен в качестве отрицательных контролей. Осадок GDNA более высоких концентраций для длительного хранения.
      1. Добавить 3 объемов 100% этанола и 0,1 объема 3 м ацетата натрия (рН 5,5), и перемешивают переворачиванием трубок 4-6 раз.
      2. Хранить при -20 ° CO / N.
      3. Центрифуга на 16000 хг в течение 15 мин при 4 ° С.
      4. Осторожно удалите супернатант. Промыть гранул с 70% (объем / объем) этанола и центрифугируют при 16000 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
      5. Осторожно снимите этанола и позволяют гранулы высохнуть на воздухе в течение 3 мин при комнатной температуре.
      6. Растворить в GDNA T 10 E 0,1 (рН 7,5) до примерно 1 мкг / мкл. Бассейн гДНК от каждого экспериментального образца или отрицательного контроля и измерения концентрации. Хранить при -20 ° C.

2. Усиление аденин-метилированных фрагментов ДНК

  1. Дайджест гДНК с DpnI, что только сокращает аденин-метилированных GATCs.
    1. Настройка реакции на льду с 2,5 мкг гДНК, 1 мкл 10х буфера, 0,5 мкл DpnI (20 ед / мкл) и залить H 2 O до полного объема 10 мкл. Для каждого образца GDNA, подготовить три реакции - один без DpnI ("нет DpnI" заменить ДПНИ 0,5 мкл H 2 O) и двух жIth DpnI ("с DpnI").
    2. Дайджест O / N при 37 ° С и инактивируют ДПНИ при 80 ° С в течение 20 мин.
  2. Перевязывать DamID адаптеров.
    1. Подготовка DamID адаптеров.
      1. Ресуспендируют каждый из двух олигонуклеотидов DamID адаптера 24 в H 2 O до конечной концентрации 100 мкМ.
      2. Комбинат равные объемы двух DamID адаптер олиго, перемешать и поместить в плотно закрытой трубе. Уплотнение трубки парапленкой, сидеть в стойке и места в химический стакан, наполненный водой при 90 ° С. Хранить уровень воды ниже крышки трубки (чтобы избежать попадания воды в трубку), но над поверхностью олиго смеси.
      3. Дайте воде остыть до комнатной температуры, так что отжиг адаптеры медленно.
      4. Алиготе Отожженном адаптеры (50 мкм) и хранить при температуре -20 ° C.
    2. Настройка реакции на льду. В каждую пробирку с 2.1.2, добавить 6,2 мкл H 2 O, 2 мкл 10х буфера для лигирования, 0,8 мкл 50 мкМ DamID объявлениеaptors (размороженные на льду) и 1 мкл ДНК-лигазы Т4 (5 ед / мкл). Общий объем составляет 20 мкл. В одном из двух "с ДПНИ" трубок, замените лигазы с 1 мкл H 2 O ("нет лигазы") Обратите внимание, что каждый образец имеет две гДНК отрицательных контролей -. "Нет ДПНИ» и «нет» лигазы.
    3. Лигировать O / N при 16 ° С и инактивируют лигазы при 65 ° С в течение 10 мин.
  3. Дайджест ДНК с DpnII уничтожить фрагменты, содержащие неметилированные GATCs.
    1. Настройка реакции на льду. В каждую пробирку с 2.2.3, добавить 24 мкл H 2 O, 5 мкл 10х буфера DpnII и 1 мкл DpnII (10 ед / мкл). Общий объем составляет 50 мкл.
    2. Дайджест при 37 ° С в течение 2-3 ч и инактивации DpnII при 65 ° С в течение 20 мин.
  4. Amplify аденин-метилированных фрагментов ДНК.
    1. Настройка реакции на льду с 5 мкл DpnII переварить из 2.3.2, 5 мкмл 10x ПЦР буфер, 12,5 мкл 5 мкМ DamID ПЦР-праймер 24, 4 мкл 10 мМ дНТФ перемешать, 1 мкл 50x полимеразной смеси и 22,5 мкл H 2 O. Общий объем составляет 50 мкл.
    2. Запуск ПЦР следующим образом: 68 ° C в течение 10 мин; 94 ° С в течение 1 мин, 65 ° С в течение 5 мин, 68 ° С в течение 15 мин; 4 циклов при 94 ° С в течение 1 мин, 65 ° C в течение 1 мин, 68 ° С в течение 10 мин; 17 циклов при 94 ° С в течение 1 мин, 65 ° С в течение 1 мин, 68 ° С в течение 2 мин.
    3. Анализ 5 продуктов мкл ПЦР из каждой реакции на 1% агарозном геле. ПЦР-продукты должны появиться в мазке в диапазоне от 0,2 до 2 кб (рис 2). "Нет DpnI" и "нет" лигазы управления должны иметь не менее или явно усиления.
    4. Если результат от шага 2.4.3 удовлетворительное, повторить шаги 2.4.1-2.4.3 с двумя или тремя реакций экспериментального образца и одной реакции для каждой из двух отрицательных контролей.
    5. Бассейн и очистки продуктов ПЦР из того жеЭкспериментальный образец с использованием комплектов очистки ПЦР или твердой фазе Реверсивный иммобилизация (SPRI) бусы в соответствии с протоколом производителя. Не очистить "нет ДПНИ" или "Нет" лигазы управления. Элюции ДНК с буферной EB.
    6. Измерение концентрации очищенной ДНК путем измерения оптической плотности 260, используя спектрофотометр, который должен быть около 0,1 мкг / мкл или выше. Собрать минимум 10 мкг ДНК для каждого образца. При использовании ПЦР наборы для очистки, очистить каждый 50 мкл ПЦР-продуктов с одной колонкой, элюируют в 30 мкл буфера EB и бассейн элюатов.
  5. Дайджест ДНК с DpnII, чтобы предотвратить DamID ПЦР-праймеров от того секвенировали.
    1. Настройка реакции на льду с 5 мкг очищенной ДНК из 2.4.6, 5 мкл 10х буфера DpnII, 1 мкл DpnII (10 ед / мкл) и залить H 2 O до полного объема 50 мкл. Приготовьте два или три реакции для каждого образца.
    2. Дайджест при 37 ° С в течение 2-3 чи инактивируют DpnII при 65 ° С в течение 20 мин.
    3. Бассейн и очистить дайджестов из того же образца с комплектов очистки ПЦР или бисером SPRI в соответствии с протоколом производителя. Элюции ДНК с буферной EB.
    4. Измерение концентрации очищенной ДНК, которое должно быть около 0,06 мкг / мкл или выше. Собрать минимум 6 мкг ДНК для каждого образца. При использовании ПЦР наборы для очистки, очистить каждый 50 мкл переварить с одной колонкой, элюируют в 30 мкл буфера EB и бассейн элюатов.

3. Библиотека Подготовка к высокопроизводительного секвенирования

  1. ДНК-фрагмент
    1. Экспериментально определить подходящее время пищеварения для каждого нового партии двухцепочечной ДНК Fragmentase. Как активность фермента может уменьшаться с течением времени, повторите тест перед выполнением нового эксперимента. Чтобы сохранить ДНК 2.5.4 для фактического фрагментации, используйте очищенные продукты ПЦР метил из 2.4.6 или дополнительной ДНК из предыдущего experimeНТС в этом шаге.
      1. Установите мастер-микс с 6 мкг ДНК, 12 мкл 10х буфера Fragmentase и залейте H 2 O до общего объема 114 мкл в.
      2. Вихрь фондовый флакон Fragmentase в течение 3 сек, 6 мкл добавить в мастер-смеси и вихрь мастер смеси в течение 3 сек. Общий объем составляет 120 мкл.
      3. Аликвоты 20 мкл мастер смеси в каждую из 5 новых труб. Инкубируйте все 6 пробирки при 37 ° С в течение от 5 до 55 мин при приращения 10 мин. Добавьте 5 мкл 0,5 М ЭДТА для остановки реакции.
      4. Анализ 12,5 мкл переварить (0,5 мкг ДНК) каждой реакции, а также 0,5 мкг ДНК на непереваренные в агарозном геле (рис 3). Определить минимальное время (Т), необходимое 0.2kb переваривать большинство мазка до примерно 0,2 кб. Выберите 6 Время длительности между 5 мин и Т 0.2kb (в том числе 5 мин и Т 0.2kb) с равными шагом для реальной фрагментации.
    2. Настройка фактических Фрагменатации, как описано в 3.1.1.1-3.1.1.3. Выдержите реакции при 37 ° С в течение времени продолжительности, определенных в 3.1.1.4.
    3. Бассейн 6 реакции и очистить дайджестов с комплектов очистки ПЦР или бисером SPRI в соответствии с протоколом производителя. Элюции ДНК в 51 мкл буфера EB. Конечный элюат ~ 50 мкл.
  2. Ремонт концы фрагментированной ДНК
    1. Настройка реакции на льду с элюата из 3.1.3, 25 мкл H 2 O, 10 мкл 10х Т4 ДНК-лигазы буфера с 10 мМ АТФ, 4 мкл 10 мМ дНТФ смеси, 5 мкл ДНК-полимеразы Т4 (3 U / мкл) , 1 мкл Кленова ДНК-полимеразы (5 ед / мкл), и 5 мкл киназы Т4 полинуклеотид. Общий объем составляет 100 мкл. Хорошо перемешать с пипеткой. Избегайте пены и пузырьков.
    2. Инкубируют при 20 ° С в течение 30 мин.
    3. Очищают ДНК с комплектов очистки ПЦР или бисером SPRI в соответствии с протоколом производителя. Элюции ДНК в 33 мкл буфера EB. Окончательный элюата ~ 32 & #181; л.
  3. Добавить "А" свесы
    1. Настройка реакции на льду с элюата из 3.2.3, 5 мкл 10х буфера Кленова, 10 мкл 1 мМ дНТФ, и 3 мкл Кленова (3 '→ 5' экзо-) (5 ед / мкл). Общий объем составляет 50 мкл. Хорошо перемешать с пипеткой. Избегайте пены и пузырьков.
    2. Инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин.
    3. Очищают ДНК с комплектов очистки ПЦР или бисером SPRI в соответствии с протоколом производителя. Элюции ДНК в 22 мкл буфера EB. Окончательный элюата ~ 21 мкл.
  4. Перевязывать секвенирования адаптеры
    1. Подготовка секвенирования адаптеры 28.
      1. Ресуспендируют каждый адаптер олиго до концентрации 100 мкМ в 10 мМ Трис-Cl (рН 7,8), 0,1 мМ ЭДТА (рН 8,0) и 50 мМ NaCl.
      2. Смешайте равные объемы универсального адаптера 28 и индексированной адаптер 28.
      3. Отжиг адаптеры в термоциклере со следующимиПрограмма: 95 ° С в течение 2 мин; 140 циклов в течение 30 сек, начиная с 95 ° C и снижение на 0,5 ° C в каждом цикле; выдержка при температуре 4 ° С.
      4. Алиготе адаптеры и хранить при -20 ° C.
    2. Настройка реакции на льду с элюата из 3.3.3, 25 мкл 2x буфера для лигирования, 1,5 мкл 50 мкМ ренатурированных секвенирования адаптеры (талой на льду) из 3.4.1.4 и 2.5 мкл ДНК-лигазы Т4. Хорошо перемешать с пипеткой. Избегайте пены и пузырьков. Если мультиплекс секвенирования желательно, использовать другой индексированный адаптер для каждого образца.
    3. Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
    4. Очищают ДНК с комплектов очистки ПЦР или бисером SPRI в соответствии с протоколом производителя. Элюции ДНК в 24 мкл буфера EB. Окончательный элюата ~ 23 мкл.
  5. Преобразование Y-образный адаптеры двухцепочечной ДНК, чтобы позволить точно определить размеры фрагмент ДНК 28
    1. Настройка реакции на льду с элюата из 3.4.4, 12.5 мкл H 2 O, 1 мкл 25 мкм грунтовки 1 28, 1 мкл 25 мкм грунтовки 2 28, 1,5 мкл 10 мМ дНТФ, 10 мкл 5х буфера ПЦР и 1 мкл ДНК-полимеразы (1 ед ​​/ мкл).
    2. Запуск ПЦР следующим образом: 95 ° C в течение 3 мин; 5 циклов 98 ° С в течение 15 сек, 63 ° C в течение 30 сек, 72 ° С в течение 30 сек; 72 ° С в течение 1 мин; 4 ° С на удержание.
    3. Очищают ДНК с комплектов очистки ПЦР или бисером SPRI в соответствии с протоколом производителя. Элюции ДНК в 11 мкл буфера EB. Окончательный элюата ~ 10 мкл.
  6. Размер выберите библиотеку
    1. Приготовьте 2% агарозный гель с 1x TAE буфер. Добавить бромистый этидий (Внимание!) До конечной концентрации 500 нг / мл, когда расплавленный агарозном TAE-охлаждения раствора, чтобы избежать вдыхания бромистым этидием. Убедитесь, что есть достаточно полосы для всех образцов ДНК, лестницы и пустых полос.
    2. Добавить 8 мкл 6x загрузки красителя элюата из 3.5.3.
    3. Подготовка ДНК лестнице путем смешивания 1 кб плюс ДНК лестнице (1,0 мкг / мкл), 6x загрузки красителя и H 2 O в соотношении 1: 1: 4.
    4. Нагрузка 6 мкл ДНК лестнице, образцы из 3.6.2 и еще 6 мкл ДНК лестницу, каждый в отдельном ряду и, по крайней мере одной пустой полосе от соседних образцов / лестниц.
    5. Запустите гель при 120 V в течение 60 мин.
    6. Просмотр гель на УФ-просвечивания (свести к минимуму время экспозиции УФ). Носите защитные очки и маску. Убедитесь, что по крайней мере один из лестниц ДНК хорошо работать с соответствующим интервалом (достаточно для вырезания 3 ломтика гель) между 300 б.п. и 400 б.п. полос. Узкий интервал увеличивает трудности в вырезая несколько фрагментов гель, в то время как широкий интервал увеличивает объем подакцизных ломтиками гель.
    7. Используйте новую скальпель или лезвие для каждой полосы. Акцизный три тонкие ломтики гель между 300 и 400 б.п. от каждой полосе (рис 4) и поместите их в каждый микроцентрифужных трубки. Держите объем каждого геля свшей цене возможного (<100 мкл).
    8. Измерьте объем каждого куска геля (1 мкл гель весит приблизительно 1 мг), добавляют 6x объемы QG буфера и инкубируют при 50 ° С.
    9. Vortex смеси КГ-гель через 2-3 мин, пока гель не кусочек полностью не растворится. Добавить 2x объемы гель изопропанола и перемешать.
    10. От этого шага, следовать протоколу от добычи гель комплектов. Элюции ДНК в 51 мкл буфера EB. Конечный элюат ~ 50 мкл.
  7. Пополните секвенирования адаптер изменены фрагментов ДНК
    1. Оптимизировать количество циклов ПЦР 29.
      1. Настройка реакции на льду с 1 мкл элюата из 3.6.10, 1 мкл 25 мкМ праймера 1 28, 1 мкл 25 мкМ праймера 2 28, 7 мкл H 2 O и 10 мкл SYBR Green Supermix. Общий объем составляет 20 мкл.
      2. Запуск КПЦР следующим образом: 95 ° C в течение 3 мин; 20 циклов 95 ° С в течение 30 секунд, 63 ° C в течение 30 сек, 72 ° С в течение 30 сек, пластины чтения.
      3. Анализ данных с помощью программного обеспечения КПЦР анализа и определения количественного цикла (CQ) или порогового цикла (CT) для каждого образца с использованием протокола производителя. Продолжить с образцами, которые Cq / КТ ≤ 14. Используйте максимальное Сч (ОВ) 0 минус 1 (с округлением до ближайшего целого числа), как конечное число ПЦР цикла (N ПЦР).
      4. Регулировка количества ДНК-матриц, так что разные образцы будут усилены приблизительно равных количествах после запуска одинаковое количество циклов ПЦР. Использование шаблона 8 мкл для образца с самой высокой Cq (Cq 0), и рассчитать объем шаблона других образцов по следующей формуле:
        Том I = 8 х 1,8 Сч я -cq 0
    2. Настройка ПЦР реакции на льду с объемами шаблонов, рассчитанных по 3.7.1.4: 1 мкл 25 мкМ праймера 1 28, 1 мкл 25 мкМ праймера 2 28 1.5мкл 10 мМ дНТФ, 10 мкл 5х буфера, 1 мкл ДНК-полимеразы (1 ед ​​/ мкл) и залить H 2 O до полного объема 50 мкл.
    3. Запуск ПЦР следующим образом: 95 ° C в течение 45 сек; N циклов ПЦР (определяется в 3.7.1.3) из 98 ° С в течение 15 сек, 63 ° C в течение 30 сек, 72 ° С в течение 30 сек; 72 ° С в течение 1 мин; 4 ° С на удержание.
    4. Анализ 5 продуктов ПЦР мкл в 2% агарозном геле (5А). Ясное "сингл" группа указывает, что амплифицированные фрагменты ДНК в пределах узкого диапазона длины и, что библиотека ДНК может быть предметом дальнейшего анализа.
    5. Повторите одна реакция для выбранных образцов и объединить усиленные библиотеки ДНК из того же образца.
    6. Очищают выбранных библиотек ДНК для секвенирования.
      1. Если грунт / адаптер димеры не видны в 3.7.4, очистить библиотеки ДНК с комплектов очистки ПЦР или бисером SPRI в соответствии с протоколом производителя. Элюции ДНК в 21 мкл буфера EB.Окончательный элюата ~ 20 мкл. Если последовательность объект пользователя имеет конкретные инструкции о буфере элюции, в конечном объеме, и т.д., подготовить образцы соответственно.
      2. Если грунт / адаптер димеры четко видны в 3.7.4, очистить библиотеки следующим образом.
        1. Нагрузка ДНК из 3.7.5 и лестница ДНК в 2% агарозном геле сборного. Образцы могут быть очищены, как описано в 3.7.6.1, чтобы уменьшить громкость или могут быть загружены в нескольких скважинах. Поместите агарозный гель в соответствующем энергосистемы. Разрешить гель для запуска в течение 15 мин.
        2. При помощи соответствующего просвечивания, вырезали нужный диапазон с чистой скальпелем / бритва для каждого образца и поместить гель срез в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
        3. Выделения ДНК с помощью гель-экстракции комплекты в соответствии с протоколом производителя с двух модификаций: инкубируют буфера QG-гель смеси в смесителе термо-при 37 ° С и 1000 оборотов в минуту в течение 30 мин, и добавить 2x объемы гель изопропанола.
  8. Отправить очищенные ДНК-библиотек к секвенирования объекта. Выполняйте все рекомендации фонда.
    Примечание: Анализ качества по Bioanalyzer (фиг.5В) должны быть выполнены перед секвенированием с целью определения точного диапазон размеров и концентрации ДНК-библиотеки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гибридный белок Dam-V5-LmnB1 была проверена быть совместно локализованы с эндогенного белка по иммунофлуоресцентного Ламин B (рис 1).

Успешное ПЦР-амплификации из аденина-метилированных фрагментов ДНК является ключевым шагом для DamID-SEQ. Экспериментальные образцы должны усиливать мазок 0,2 - 2 Кб, отрицательных контролей (без DpnI, без лигазы или без ПЦР шаблона) должно привести к не-или-менее ясно усиления ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вопрос о том, сохраняют ли белки, меченные Dam, функции эндогенных белков, должен быть изучен до проведения эксперимента с DamID-seq. Субклеточную локализацию Dam-меченых белков ядерной оболочки всегда следует определять и сравнивать с таковой эндогенных белков. Для изучения факторов транскрипции предлагается изучить, может ли белок Dam-fusion спасти функции эндогенного белка в регуляции экспрессии генов. Этот функциональный тест может быть проведен на организмах, в которых доступны нокаут-мутанты эндогенных ДНК-связываю...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Баса ван Стинселя за предоставление векторов экспрессии млекопитающих DamID. Мы благодарим Йельский центр анализа генома и Ядро геномики Йельского центра стволовых клеток за советы по подготовке библиотек NGS и внедрению высокопроизводительного секвенирования ДНК. Эта работа была поддержана финансированием стартапа от Йельской школы медицины, грантом на развитие ученых от Американской кардиологической ассоциации (12SDG11630031) и грантом от Connecticut Innovations, Inc. (13-SCA-YALE-15).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ViraPower Лентивирусные системы экспрессииLife TechnologiesK4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20 и K371-20
Gateway BP Clonase II Enzyme MixLife Technologies11789-020
Gateway LR Clonase II Enzyme MixLife Technologies11791-020
DNeasy Blood & Набор салфеток (250)QIAGEN69506 или 69504   
Gateway pDONR 201Life Technologies11798-014
293T клеткиAmerican Type Culture CollectionCRL-11268
Trypsin-EDTA (0,05%), фенол красныйLife Technologies25300-054
DMEM, высокий уровень глюкозы, пируватLife Technologies11995-065
Фетальная бычья сывороткаSigmaF4135
Трисмарка не критична
ЭДТАмарка не критична
200 Proof EtOHмарка не критична
Изопропанолмарка не критична
Ацетатмарка не критична
DpnINew England BiolabsR0176поставляется с буферными
адаптерами DamID "AdRt" и "AdRb"Интегрированные DNA Technologiesпоследовательности, доступные в арт. 24; без фосфорилирования 5' или 3' конца для предотвращения самолигирования.
T4 DNA LigaseRoche Life Science10481220001с буфером
DpnIINew England BiolabsR0543с буфером
DamID PCR праймер "AdR_PCR"Интегрированные DNA Technologiesпоследовательности доступны в ref. 24
Набор растворов дезоксинуклеотидов (dNTP)England BiolabsN0446по 100 мМ каждый из dATP, dCTP, dGTP и dTTP
Преимущество 2  Полимеразная смесьClontech639201в комплекте с буфером
1Kb Plus DNA LadderLife Technologies107870181.0 &; g/µ l
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28104 или 28106
MinElute PCR Purification KitQIAGEN28004 или 28006для объема элюирования менее 30 & микро; l
Бусины SPRI / Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63880обеспечивают дополнительное перемешивание и больше времени элюирования, если менее 40 & микро; l элюирующий буфер
Буфер EBQIAGEN19086
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BiolabsM0348поставляется с буфером
T4 DNA Ligase Reaction BufferNew England BiolabsB0202
T4 DNA PolymeraseNew England BiolabsM0203
DNA Polymerase I, большой (Klenow) фрагментNew England BiolabsM0210
T4 ПолинулеотидкиназаNew England BiolabsM0201
Фрагмент Кленоу (3' → 5' exo-)New England BiolabsM0212поставляется с адаптерами для
секвенированияИнтегрированные последовательности DNA Technologiesдоступны в ref. 28
Набор для быстрого лигированияNew England BiolabsM2200используется в 3.4.3; поставляется с буфером для реакции быстрого лигирования и
праймером для секвенирования ДНК-лигазы Quick T4 1 и 2 последовательностямиинтегрированных технологий ДНК,доступными в арт. 28
KAPA HiFi PCR KitKapa BiosystemsKK2101 или KK2102поставляются с KAPA HiFi ДНК-полимераза, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer и 10 мМ смеси dNTP
агарозыSigma AldrichA4679
бромидаэтидияSigma AldrichE1510-10ML10 мг/мл
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN28704 или 28706
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725121 или 1725122
Спектрофотометрмарки не критично
0,45 μ m PVDF Фильтрмарка не критична
25 мл Seringeмарка не критична
10 см Тарелки для тканевых культур маркане критична
6-луночные тарелкимарка не критична
S1000 ТермоамплификаторBio-Rad Laboratories
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad Laboratoriesдля марки
вихревого смесителяне критично
Нагреватель сухого блока или термомиксермарки не критично
Марка микроцентрифугине критична
Система гель-электрофореза с питаниеммарки не критична
Магнитная подставкадля очистки ДНК с помощью шариков SPRI; должны вмещать пробирки объемом 1,5-2 мл; бренд не критичный
УФ транслюминаторбренд не критичный
E-гель электрофорез система LifeTechnologiesG6400, G6500, G6512ST
натрия New используется буфера для тканевых культур для кПЦР

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase. Nat Genet. 27, 304-308 (2001).
  2. van Steensel, B., Henikoff, S. Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase. Nat Biotechnol. 18, 424-428 (2000).
  3. Fu, A. Q., Adryan, B. Scoring overlapping and adjacent signals from genome-wide ChIP and DamID assays. Mol Biosyst. 5, 1429-1438 (2009).
  4. Guelen, L. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions. Nature. 453, 948-951 (2008).
  5. Kalverda, B., Pickersgill, H., Shloma, V. V., Fornerod, M. Nucleoporins directly stimulate expression of developmental and cell-cycle genes inside the nucleoplasm. Cell. 140, 360-371 (2010).
  6. Kubben, N. Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions. Chromosoma. 121, 447-464 (2012).
  7. Steglich, B., Filion, G. J., van Steensel, B., Ekwall, K. The inner nuclear membrane proteins Man1 and Ima1 link to two different types of chromatin at the nuclear periphery in S. pombe. Nucleus. 3, 77-87 (2012).
  8. Harr, J. C. Directed targeting of chromatin to the nuclear lamina is mediated by chromatin state and A-type lamins. J Cell Biol. 208, 33-52 (2015).
  9. Gonzalez-Aguilera, C. Genome-wide analysis links emerin to neuromuscular junction activity in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 15, R21(2014).
  10. Wu, F., Yao, J. Spatial compartmentalization at the nuclear periphery characterized by genome-wide mapping. BMC Genomics. 14, 591(2013).
  11. Filion, G. J. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
  12. Vogel, M. J. Human heterochromatin proteins form large domains containing KRAB-ZNF genes. Genome Res. 16, 1493-1504 (2006).
  13. Venkatasubrahmanyam, S., Hwang, W. W., Meneghini, M. D., Tong, A. H., Madhani, H. D. Genome-wide, as opposed to local, antisilencing is mediated redundantly by the euchromatic factors Set1 and H2A.Z. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16609-16614 (2007).
  14. Shimbo, T. MBD3 localizes at promoters, gene bodies and enhancers of active genes. PLoS Genet. 9, e1004028(2013).
  15. Orian, A. Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network. Genes Dev. 17, 1101-1114 (2003).
  16. Artegiani, B. Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis. EMBO J. , (2014).
  17. Schuster, E. DamID in C. elegans reveals longevity-associated targets of DAF-16/FoxO. Mol Syst Biol. 6, 399(2010).
  18. Bianchi-Frias, D. Hairy transcriptional repression targets and cofactor recruitment in Drosophila. PLoS Biol. 2, e178(2004).
  19. Woolcock, K. J., Gaidatzis, D., Punga, T., Buhler, M. Dicer associates with chromatin to repress genome activity in Schizosaccharomyces pombe. Nat Struct Mol Biol. 18, 94-99 (2011).
  20. Luo, S. D., Shi, G. W., Baker, B. S. Direct targets of the D. melanogaster DSXF protein and the evolution of sexual development. Development. 138, 2761-2771 (2011).
  21. Germann, S., Gaudin, V. Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method. Methods Mol Biol. 754, 307-321 (2011).
  22. Zhang, X. The Arabidopsis LHP1 protein colocalizes with histone H3 Lys27 trimethylation. Nat Struct Mol Biol. 14, 869-871 (2007).
  23. Orian, A. Chromatin profiling, DamID and the emerging landscape of gene expression. Curr Opin Genet Dev. 16, 157-164 (2006).
  24. Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat Protoc. 2, 1467-1478 (2007).
  25. Greil, F., Moorman, C., van Steensel, B. DamID: mapping of in vivo protein-genome interactions using tethered DNA adenine methyltransferase. Methods Enzymol. 410, 342-359 (2006).
  26. de Wit, E., Greil, F., van Steensel, B. Genome-wide HP1 binding in Drosophila: developmental plasticity and genomic targeting signals. Genome Res. 15, 1265-1273 (2005).
  27. DamID mammalian vectors. , Available from: http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm (2015).
  28. Illumina TruSeq adaptors & PCR primers. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/ (2015).
  29. Optimization of PCR cycles for NGS. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/ (2015).
  30. Bernstein, B. E. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28, 1045-1048 (2010).
  31. Encode Project Consortium. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS Biol. 9, e1001046(2011).
  32. Asp, P. Genome-wide remodeling of the epigenetic landscape during myogenic differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E149-E158 (2011).
  33. Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nat Cell Biol. 16, 919-927 (2014).
  34. Avital, G., Hashimshony, T., Yanai, I. Seeing is believing: new methods for in situ single-cell transcriptomics. Genome Biol. 15, 110(2014).
  35. Navin, N. E. Cancer genomics: one cell at a time. Genome Biol. 15, 452(2014).
  36. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: advances and future challenges. Nucleic Acids Res. 42, 8845-8860 (2014).
  37. Nagano, T. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  38. Kind, J. Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions. Cell. 153, 178-192 (2013).
  39. Southall, T. D. Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells. Dev Cell. 26, 101-112 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Bioanalyzer

Похожие статьи