Методическая статья

Выделение Лейкоциты проникают из кожи мыши, используя ферментативные дайджест и Gradient Разделение

DOI:

10.3791/53638

⸱

25 января 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Macalester College, 2Department of Medicine, Division of Rheumatic and Autoimmune Diseases, Center for Immunology, University of Minnesota

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает ферментативное переваривание кожи мыши в богатой питательными веществами среде с последующим градиентным разделением для выделения лейкоцитов. Полученные таким образом элементы могут быть использованы для различных последующих применений. Это эффективная, экономичная и улучшенная альтернатива машинам для диссоциации тканей и более жестким протоколам переваривания тканей на основе трипсина и диспазы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Диссоциация кожи мыши на суспензию одной клетки имеет важное значение для последующего клеточного анализа, такого как характеристика инфильтрирующих иммунных клеток в моделях воспаления кожи грызунов. Здесь мы описываем протокол переваривания кожи мыши в богатом питательными веществами растворе коллагеназы D с последующим разделением гемопоэтических клеток с использованием прерывистого градиента плотности. Полученные таким образом клетки могут быть использованы для исследований in vitro, переноса in vivo и других последующих клеточных и молекулярных анализов, включая проточную цитометрию. Этот протокол является эффективной и экономичной альтернативой дорогостоящим механическим диссоциаторам, специализированным разделительным колонкам и более жестким методам расщепления на основе трипсина и диспазы, которые могут поставить под угрозу клеточную жизнеспособность или плотность поверхностных белков, имеющих значение для фенотипической характеристики или клеточной функции. Как показано в наших репрезентативных данных, этот протокол позволял получать высокожизнеспособные клетки, содержал специфические подмножества иммунных клеток и не оказывал влияния на целостность белков-маркеров общей поверхности, используемых в проточном цитометрическом анализе.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кожные начиная от контактного дерматита, экземы, псориаз, целлюлит, грибковых инфекций и абсцессов к раку кожи немеланомных оказались среди 50 самых распространенных заболеваний во всем мире, и четвертый ведущий мировой причиной несмертельных болезней в 2010 году 1. Соответственно, исследование молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе различных патологий кожи является необходимым и активной областью исследований. Моделях грызунов были чрезвычайно полезны в понимании воспалительных заболеваний кожи, таких как атопический дерматит, псориаз 2 3, или золотистого стафилококка инфекции 4. Недорогие и эффективные, простые и протоколы для ферментативного переваривания ткани кожи мыши может предоставить препараты клеток, которые могут быть использованы для различных последующих применений, чтобы лучше понять патофизиологию заболеваний кожи. Здесь, простым и экономичным описан способ ферментативного гидролизата кожу мышиткани и выделение кожи лейкоцитов, что проникающих могут быть использованы для культивирования клеток, в естественных приемных передачи, анализа проточной цитометрии и сортировки или исследования экспрессии генов. Общая цель этой процедуры заключается в подготовке единой клеточной суспензии кожи инфильтрирующие лейкоцитов с высокой жизнеспособностью клеток при минимальных затратах, как правило, связанные с наборами реагентов на заказ и механических dissociators.

Существующие методы кожной ткани диссоциации 5-7 может привести к низкой жизнеспособности клеток и поверхностных маркеров целостности, или требовать пользовательские наборы ферментов и дорогие ткани диссоциации машины 8-11. В то время как переваривание мыши уха ткани кожи является достаточно распространенным 12-13, переваривая очень ороговевшей ткани кожи (например, с фланга) может привести к подготовке клеток зараженных с большим количеством неклеточным мусора. В недавнем исследовании, Заид и его коллеги усваивается мыши фланговый кожу в течение 90 мин в 2,5 мг / мл диспаза, Folloво главе с 45 мин в 3 мг / мл коллагеназы 7. В другом исследовании, эти исследователи использовали несколько инкубации с комбинированным переваривания 2,5 ч, в том числе использование трипсина / EDTA, коллагеназы III и диспаза 5. Применение трипсина не рекомендуется для ферментативного расщепления кожи, а лечение с помощью трипсина от разных производителей, как было показано заметно влияет на целостность белков клеточной поверхности на клетках млекопитающих 14-15. Кроме того, диспаза может иметь значительное влияние на пролиферативные способностей CD4 и CD8α Т-клеток и влияет на поверхности изобилие, по крайней мере 20 молекул, в том числе маркеров общего Т активации клеток, таких как CD62L 16. Другие протоколы используют RPMI 1640 в среде пищеварения 6. Тем не менее, наличие Mg 2+ и Ca 2+ в среде RPMI может вызвать агрегацию клеток обширные 17.

Идеальный протокол для ткани диссоциации должны стремиться к высокой жизнеспособности клеток, низкаяУровни агрегации клеток и минимальным повреждением клеточной поверхности белки. Высокое качество подготовки лимфатических узлов стромальных клеток были выполнены с протоколами, которые используют короткие инкубации фермента, Ca 2+ и Mg 2+ свободные средства массовой информации, и избежать трипсина и диспазу 18. Тем не менее, протоколы этого типа не были созданы для диссоциации всей кожи мыши.

Вот протокол описан отделить, изолировать и обогатить кожу проникают лейкоциты-от аллергена оспаривается мыши фланга кожи. Вкратце, вырезали кожу предварительно инкубировали в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS) с 10% фетальной бычьей сыворотки в течение 1 часа, чтобы смягчить ткань для пищеварения и удаления избытка кожи или мертвую жировую ткань. Это сопровождается 30 мин ферментативного расщепления шага с 0,7 мг / мл коллагеназы Д. коллагеназы D имеет минимальное воздействие на плотность маркеров клеточной поверхности и не оказывает влияния на пролиферацию Т-клеток в пробирке 16,18, что делает егохорошо подходит для применений, связанных с характеристику поверхностных белков. После ферментативного расщепления, разрывная центрифугирования в градиенте плотности используют для удаления эпителиальных клеток и мусора от одного суспензии клеток и обогащения кроветворных клеток. Важно отметить, что эта процедура позволяет избежать дорогих колонок на основе реагентов разделения магнитного клеток и тканей диссоциации машины 8-11, и может быть выполнена с оборудованием и материалов, находящихся в основной биомедицинской исследовательской лаборатории. Вот этот протокол был использован для выделения лейкоцитов с фланга кожи оспариваемые три раза гаптена оксазолона (Ox) в ранее сенсибилизированных ND4 швейцарских мышей (взято из 19). Клетки анализировали с помощью многопараметрического проточной цитометрии. Эта методика дала клеточной суспензии с минимальной мусора и> 95% жизнеспособности изолированных лимфоцитов, которые были проанализированы с помощью многопараметрического проточной цитометрии для измерения инфильтрацию Т-лимфоцитов и нейтрофилов в пострадавших SKв.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: 8-12 неделе летняя женщина ND4 Swiss Webster мышей, условно размещены в свободном доступе пищи и воды, были использованы для этих исследований экспериментальный протокол используется (B13S1) был утвержден IACUC Macalester колледжа..

1. Сенсибилизация и вызов с оксазолоном

  1. День 0
    1. Подготовка анестезии камеру добавлением 3 мл изофлуран к абсорбирующим полотенца, размещенных под сеткой в ​​нижней части 4 л с крышкой стеклянную банку. Для самок мышей ND4 используемой здесь, время в камере 30-60 сек, пока объект не будет надлежащим образом под наркозом; оптимизировать обезболивающий администрацию за штамм мыши используется.
    2. Бритье спине каждого под наркозом мыши и обрамляют с помощью волос животных триммер.
  2. 1 день
    1. Делают 2% -ный раствор 4-этоксиметилен-2-фенил-2-оксазолин-5-она (Ox) в абсолютном этаноле, и инкубируют при 50 ° С в течение 15 мин на вращающейся пластины в инкубаторе.
    2. Кратко обезболитьмышей с помощью ИФ анестезии, как описано в 1.1.1 и применить 100 мкл 2% Быка, чтобы бритая назад в нескольких последовательных приложений около 20 мкл каждый. Подождите 5-10 сек между последовательными приложениями для решения для просушки.
    3. Позаботьтесь, чтобы избежать проливания 2% раствор Ох на других, чем сзади регионах, и ждать решения, чтобы высохнуть между приложениями.
  3. Дни 5-7
    1. Выполнить 1% -ный раствор (Ox) в абсолютном этаноле, и инкубируют при 50 ° С в течение 15 мин на вращающейся пластины в инкубаторе.
    2. Осторожно, но твердо иммобилизации мыши в загривок и основания хвоста с живота вверх и шеи слегка наклонена вниз (по аналогии с удержания для внутрибрюшинного введения) и применять 100 мкл 1% Быка на бритой фланге в нескольких последовательных приложений и нашли время, чтобы высушить кожу после, как описано выше.
    3. Для контрольных мышей, применяются 100 мкл абсолютного этанола транспортного средства к выбритой пирогк.

2. Пашина кожи Урожай

  1. Эвтаназии мышей, используя углерода вдыхания углекислого и осторожно вырезать нужный участок флангового кожи (~ 25 мм х 25 мм кожи) с 10 см хирургическими ножницами.
  2. Используя чистую, острым хирургическим скальпелем, соскрести излишки жира и соединительной ткани от кожи фланга.
  3. Поместите 3 части боковой поверхности кожи из 3 мышей из в 50 мл коническую пробирку, содержащую 10 мл HBSS RT [с фенолового красного, без кальция или магния, 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 10 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1- пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES), и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS)].

3. Предварительно пищеварения ткани Стиральная

  1. Место трубки, содержащей фрагменты кожи на вращающейся пластины в течение 30 мин в сухом, не газированной инкубаторе при температуре 37 ° С.
  2. Вортексе в течение 10 сек в конце инкубационного периода.
  3. Штамм содержимое трубки через 70 мкмфильтр для отмены промывочный буфер и собирать ткань. Один фильтр может быть повторно использован на протяжении всей процедуры в биологической группе лечения.
  4. Используя пару щипцов, передача фланг кожу от сетчатого фильтра в новый 50 мл коническую пробирку, содержащую 10 мл свежего HBSS, РТ сред (содержащие ЭДТА, HEPES и FBS, как описано выше).
  5. С 12,5 см пары хирургических ножниц, погруженных рассекающих в трубку, пропустить через мясорубку каждый кусок флангового кожи, так что средняя часть ткани примерно 2,2 мм х 2,2 мм в области.
  6. Место трубки, содержащей фрагменты кожи на вращающейся пластины в течение 30 мин в сухом, не газированной инкубаторе при температуре 37 ° С.
  7. Вортексе в течение 10 сек в конце инкубации

4. Коллагеназа Переваривание кожи

  1. Штамм содержимое трубки через 70 мкм сито, собирают и передают части задней поверхности кожи в новый 50 мл коническую пробирку, содержащую 10 мл FRESH, РТ HBSS, дополненной 0,7 мг / мл коллагеназы D.
  2. Место трубку, содержащую среду пищеварение и фрагменты кожи на вращающейся пластины в течение 30 мин в сухом, не газированной инкубаторе при температуре 37 ° С.
  3. Вихревые содержимое трубки энергично в течение 10 сек в конце инкубации.
  4. Фильтровать содержимое трубки через 70 мкм фильтр в новой 50 мл коническую трубку; держать проточные, содержащий переваренной ткани и отбросить фильтр и обрамляют мусора кожи.
  5. Вымойте проточный в 50 мл HBSS СМИ, центрифуги в течение 5 мин при 350 г, и переливать супернатант.

5. центрифугирования в градиенте плотности

  1. Использование серологических пипетки внести 3 мл 67% RT центрифугированием в градиенте плотности сред в 1X фосфатным буферным раствором (PBS) в новый 15 мл коническую пробирку для каждого образца.
  2. Ресуспендируют осадок клеток в 5 мл РТ 44% центрифугирования в градиенте плотности информации в HBSS с фенолом красным.
  3. ДжентльменСлой лы 5 мл 44% центрифугированием в градиенте плотности среды, содержащей клетки в верхней части 67% центрифугированием в градиенте плотности образца с помощью средств массовой информации серологическое пипетки. Убедитесь, что для установки дозаторов к медленной скорости, и место пипеткой вдоль стены конической трубе. Будьте осторожны, чтобы не трясти, нарушить или инвертировать градиент.
  4. Установите разгон до самой низкой обстановке, отключить тормоз, и центрифуга градиент на 931 мкг в течение 20 мин при комнатной температуре, убедившись, что центрифуги сбалансированы.
  5. После центрифугирования, тщательно удалить градиент из центрифуги и осторожно транспортировать в лабораторию скамейке проведение трубки в вертикальном положении. Использование 5 мл пластиковые пипетки передачи, снимите слой клеток на поверхности раздела 44% и 67% центрифугирования в градиенте плотности информации и переход к новой 15 мл коническую трубку. Если интерфейс не отображается, просто удалить около 2 мл жидкости на 67% -44% границы.
  6. Заполните коническую трубку, содержащую клетки из интеrface с 2% FBS в 1X ледяной PBS, центрифугируют клетки течение 5 мин при 350 х г, и декантируют супернатант.
    Примечание: Это первый случай, когда эти клетки могут быть охлаждены / держать в холоде, так как шаги пищеварения при 37 ° С и центрифугированием в градиенте плотности носителей шаги при комнатной температуре. Клетки могут быть повторно суспендируют в соотношении 1: 1 трипановым синим и подсчета разбавления и информации жизнеспособности могут быть получены в этой точке.

6. Блокировка и окрашивание для анализа потока цитометрии

  1. Блок FcγRII / рецепторы III на клетки, чтобы предотвратить неспецифическую окрашивание антител. Для экспериментов, описанных здесь, чтобы мастер-антитела в смеси PBS с 2% FBS, содержащей 1: 100 разбавление неконъюгированного антитела против CD16 / 32 (2.4G2) связывать и блокируют рецепторы FcγRII / III.
  2. Выдержите заблокированные ячейки с соответствующими мастер смесей антител против CD3ɛ (145-2С11), CD4 (RM4-5), CD8α (53-6.7), CD11b (М1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14) и Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), а также Brilliant Violet 510 живой / мертвый пятно, чтобы идентифицировать мертвые клетки. Используйте все антитела либо при разведении рекомендованных производителями или ранее оптимизированной исследователями. Для экспериментов, описанных здесь, используют все антитела в разведении 1: 100.
  3. Промыть клетки и ресуспендируют в 50 мкл 1X PBS буфера окрашивания с 2% FBS. Держать на льду пока данные не флуоресценции могут быть приобретены на проточном цитометре.
    Примечание: Важно, чтобы параметры компенсации заранее оптимизирована с лимфоидной ткани и общей поверхности антигена клеточной (например, CD4 или CD8) до получения данных флуоресценции.
  4. Для увеличения количества клеток для последующего анализа методом проточной цитометрии, получать данные из целых образцов окрашенных клеток.

7. Анализ проточной цитометрии данных с помощью стандартных методов для выполнения шагов, описанных ниже

  1. Во-первых, ворота на области лимфоцитов переднего разброса(область) с боковой разброс (область) участка.
  2. Затем выберите отдельные клетки, используя вперед разброс (ширина) по стороне рассеяния (ширина), чтобы избежать анализа дублеты. Это также может быть достигнуто с передней высоте рассеяния бок высота разброс участка.
  3. Затем ворота на линии (CD11b, CD11c, CD45R и / B220) -отрицательное и CD3-позитивных событий, чтобы исключить макрофаги, дендритные клетки, В-клетки и, соответственно, и ограничить анализ на клеточный компартмент T, если целью является, как здесь, чтобы оценить проникновение Т-клеток.
  4. Далее, ворота на живые клетки, которые исключают живое / мертвое пятно.
  5. Наконец, ворота на популяции клеток интерес (см репрезентативные результаты раздел).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Коллагеназа D лечение спленоцитов показывают, что аналогичные уровни CD4 и CD8 альфа на Т-клеток по сравнению с медиа-лечение управления
Во-первых, любые потенциальные последствия коллагеназы D от частоты и поверхностной обилие происхождение и активации маркеров на Т-клеток подмножеств были оценены с использованием вторичных лимфоидных тканей в качестве контроля. Суспензию спленоцитов были получены от мышей ND4 и промывают в течение...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Характеризующий изменение кожных резидентные лейкоцитов в моделях грызунов кожных заболеваний, таких как атопический дерматит и псориаз важно для понимания механистических связей между притоком воспалительных клеток и патологии болезни. Здесь мы опишем экономичный метод, чтобы изолировать лейкоциты из ткани кожи с основным оборудованием найдены в большинстве биомедицинских исследовательских лабораторий. Это относительно быстрый метод позволяет избежать использования дорогостоящих тканей диссоциации машин и пользовательс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют никаких финансовых или других интересов раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Национальные институты здоровья (NIH R15 NS067536-01A1 для постоянного тока), Национальный Вульводиния ассоциация (награда, округ Колумбия), и Macalester колледж поддерживает эту работу. ЦБ получил стипендию от колледжа Макалестер Beckman Ученые программы, финансируемой Арнольд и Мейбл Beckman Foundation. БТФ и ТМ поддерживаются JDRF 2-2011-662. Мы благодарим доктора Джейсона Schenkel и д-р Юлиана Льюис за технической консультацией, и все нынешние и бывшие члены лаборатории Chatterjea за помощь и поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
HBSS с фенолом красным, без кальция, без магния, жидкостьSigma Aldrich55021CХранить стерильно до дня использования.
HEPES, ≥ 99,5% (титрование)Sigma AldrichH3375
EDTA раствор динатриевой солиSigma AldrichE7889Хранить стерильно до дня использования.
Фетальная бычья сыворотка, Министерство сельского хозяйства США, термоинактивированная, Premium SelectMidSciS01520HIСохраняйте стерильность до дня использования.
Percoll, pH 8,5-9,5 (25&�; C)Sigma AldrichP1644Сохраняйте стерильность. Перед использованием Percoll необходимо сделать изотоническим с помощью стерильного 10X PBS.
Комбинированный набор триммеровKent ScientificCL9990-1201 Используйте триммер большего размера для бритья бока и спины.
4-этоксиметилен-2-фенил-2-оксазолин-5-онSigma AldrichE0753-10Gрастворить в 100% EtOH при 50°С; C в течение 15 минут на вращающейся пластине.
Очищенный антимышиный CD16/CD32 (2.4G2)Tonbo Biosciences70-0161Антитело, используемое для блокирования связывания неспецифических антител во время окрашивания антител для проточной цитометрии
анти-CD3ε-BV650 (145-2C11)Becton Dickinson564378Антитело, используемое для окрашивания клеток для проточной цитометрии
анти-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)eBioscience47-0042-80Антитело, используемое для окрашивания клеток для потока цитометрия
anti-CD8α-BV785 (53-6.7)BioLegend100749Антитело, используемое для окрашивания клеток для проточной цитометрии
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)eBioscience48-0112-80Антитело, используемое для окрашивания клеток для проточной цитометрии
anti-CD11c-eFluor450 (N418)eBioscience48-0114-80Антитело, используемое для окрашивания клеток для проточной цитометрии
anti-CD44-BV711 (IM7)Becton Dickinson563971Антитело, используемое для окрашивания клеток для проточной цитометрии
анти-CD45-FITC (30-F11)Tonbo Biosciences35-0451-U025Антитело, используемое для окрашивания клеток для проточной цитометрии
анти-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)eBioscience48-0452-80Антитело, используемое для окрашивания клеток для проточной цитометрии
анти-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)BioLegend104431Антитело, используемое для окрашивания клеток для проточной цитометрии
Anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)BioLegend108407Антитело, используемое для окрашивания клеток для проточной цитометрии
Ghost Dye-BV510Tonbo Biosciences13-0870-T100Жизнеспособный краситель для проточной цитометрии
LSR FortessaBecton DickinsonN/AКлеточный анализатор (18 параметров)
Коллагеназа D из Clostridium histolyticumRoche Applied Science11088858001Аликвотный лиофилизированный фермент в дозе 5 мг/мл в HBSS с феноловым красным, без кальция и без магния в 1 мл аликвот. Хранить сразу при -20°С; C на срок до шести месяцев.
ND4 Швейцарские самки мышейHarlan0-328-12 недель; обычно содержатся со свободным доступом к пище и воде и используются в соответствии с рекомендациями IACUC колледжа Макалестер.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
  2. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).
  3. Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T. Mouse models of psoriasis. J. Invest. Dermatol. 127 (6), 1292-1308 (2007).
  4. Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R. Mouse Models of Innate Immunity. Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).
  5. Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
  6. Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).
  7. Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).
  8. Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).
  9. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029(2008).
  10. Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
  11. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267(2009).
  12. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
  13. Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).
  14. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).
  15. Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).
  16. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
  17. Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311(2013).
  18. Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803(2014).
  19. Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8 (10), e78673(2013).
  20. Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).
  21. Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).
  22. Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DCD45

Похожие статьи