Количественный анализ экспрессии белка по изучению Lineage Спецификация в клетках мышиной предимплантационной эмбрионов

Summary

Этот протокол представляет собой метод для выполнения количественного, для одной ячейки в месте анализа экспрессии белка изучать спецификации клонов у мышей преимплантационных эмбрионов. Процедуры, необходимые для сбора бластоцисты, вся монтажа обнаружение Иммунофлуоресцентной белков, томография образцов на конфокальной микроскопии и ядерного сегментации и анализа изображений описаны.

Abstract

Этот протокол представляет собой способ для выполнения количественной, одноклеточный на месте анализов экспрессии белка изучать спецификации клонов в мышиных эмбрионов предимплантационной. Процедуры, необходимые для получения эмбрионов, иммунофлюоресценции, визуализации на конфокальной микроскопии и сегментации изображений и анализа описаны. Этот метод позволяет количественное определение экспрессии нескольких ядерных маркеров и пространственные (XYZ) координаты всех клеток в эмбрионе. Он использует минут, при этом изображения инструмента сегментации программное обеспечение, специально разработанной для анализа конфокальных изображений преимплантационных эмбрионов и эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) колоний. MINS осуществляет неконтролируемый ядерный сегментацию через X, Y и Z размеры, и производит информацию о положении клеток в трехмерном пространстве, а также уровень ядерные флуоресценции для всех каналов с минимальным пользовательского ввода. Хотя этот протокол был оптимизирован для анализа изображенийиз предимплантационной эмбрионов этап мыши, он может быть легко адаптированы к анализу любых других образцов, обладающих хорошим соотношением сигнал-шум и где высокая плотность ядер представляет препятствие для сегментации изображений (например., выражение анализ эмбриональных стволовых клеток (ЭСК ) колонии, дифференцируя клеток в культуре, эмбрионы других видов или стадий, и т.д.).

Introduction

Мыши предимплантационной эмбрионов является парадигмой для изучения возникновения и поддержания плюрипотентности в естественных условиях, а также модели для изучения спецификации клеточных судеб и De Novo эпителизации у млекопитающих. В предимплантационная этапы развития млекопитающих посвящены созданию трех клеточных линий, которые составляют бластоцисты, а именно плюрипотентных эпибласте - что приводит к большинству соматических тканей и зародышевых клеток - и двух внеэмбриональные родах, то трофэктодерме (ТЕ) и примитивный эндодермы (предварительно) (1А) ^1,2. Этот протокол описывает процедуры (1) эмбрионов урожай и исправить предимплантационной стадии мыши, (2) выполняет иммунофлюоресценции маркировать белки, представляющие интерес, (3) осуществляют весь монтажа изображений с помощью конфокальной микроскопии с Z-секционирования возможностей и (4) выполнить ядерной сегментацию конфокальных изображений и анализирует последующее количественное изображение. Этот трубопровод позволяет тон Несмещенные измерение уровней белка для присвоения клеточных идентичностей охарактеризовать субпопуляции клеток на месте. Этот протокол может быть осуществлена ​​в качестве лишь 3 - 4 дней в течение одного помета (как правило, до 10 эмбрионов мыши), из коллекции эмбриона к анализу данных (Фиг.1В). Одновременный анализ нескольких пометов приведет к увеличению изображения и анализа данных в реальном времени бремя, таким образом, расширяя общую длину протокола.

Эмбрион предимплантационной стадии мышь экспериментально сговорчивым система, которая, учитывая ее небольшие размеры и стереотипное морфология ^3, хорошо подходит для в целом визуализации клеточных процессов с разрешением одноклеточного. Для того чтобы осуществить объективную, системы уровня анализа статистически соответствующее количество эмбрионов, автоматизированная, количественный анализ трубопровода желательно. Тем не менее, из-за высокой плотности ядер массы внутренней клеточной (ICM) бластоцисты ( 1А, 2D), обычные сегментация изображения платформы не в состоянии обеспечить достаточную точность, чтобы установить автоматизированную или полуавтоматическую рабочий процесс. С другой стороны, руководство сегментации, в то время как точные, не позволяет обрабатывать большие когорты клеток и эмбрионов, а также не подходит для воспроизводимой, беспристрастной определения клеточных идентичностей - что особенно важно при изучении стадий развития, где формы маркера выражение не полностью решены (например, не проявляют бинарный дистрибутив через населением). Недавно мы разработали и утверждена метод сегментации изображений специально для мыши преимплантационных эмбрионов стадии и мышиных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), что обеспечивает высокую точность, но требует ввода минимальные пользователя ^4-8.

Трубопровод анализ, представленный здесь вращается вокруг MATLAB основе инструмента сегментации изображения Модульная Интерактивная ядерной сегментации (МИН) ^4. MINS рerforms неконтролируемого ядерного сегментацию на больших партий конфокальной Z-стеки после того как пользователь установил минимальное количество свойств изображения, используя графический пользовательский интерфейс (GUI) (таблица 1) ^4. Этот трубопровод доказала эффективность для генерации данных с высокой пропускной способностью на экспрессии белка и локализации клеток в обоих дикого типа, экспериментально обрабатывают и генетически модифицированные эмбрионы и стволовые клетки ^5-7. В настоящем протоколе, мы опишем применение минут до сегментации зародыша изображений предимплантационной стадии. Примеры исполнения минут на ESCs см ^{до 4,7.} Автоматизированная шаг ядерная сегментация позволяет значительно сократить время трудоемкости процесса идентификации ячейки, в то время как пространственные и флуоресценции измерений интенсивности позволит объективную определение клеточных идентичностей и генерацию трехмерных карт экспрессии генов доменов и положение клеток в эмбрионе (рис 1С ). Кроме того, масштабируемость этого процесса делает его применимым к анализу отдельных пометов через многочисленные группы экспериментально обработанных эмбрионов или эмбрионов различных генетических фонов ^5,6. MINS находится в свободном доступе на http://katlab-tools.org (программное обеспечение требует лицензии MATLAB).

Нет подход, разработанный на сегодняшний день не позволяет генерировать такие данные углубленных на экспрессию белка и локализации клеток в мышь преимплантационных эмбрионов. Все попытки до сих пор в количественном эти типы данных были ограничены в ручном определения и количественного числа клеток для различных групп населения в зародыше (либо полностью вручную, либо программного обеспечения при содействии) ^9-19. Этот подход (включающий программное обеспечение мин) был специально для и протестирован на мышиных эмбрионов и предимплантационной ESCs; Тем не менее его производительность на других системах с высокой плотностью ядерной, хотя еще не проверялось, как ожидается, будет эквивалентна.

Protocol

Заявление по этике: Все животное работа, в том числе животноводства, селекции и жертвы был одобрен Институциональные животных уходу и использованию комитета Memorial Sloan Kettering Cancer Центра (IACUC), протокол # 03-12-017 мимо.

1. эмбрионов

Примечание: Все животное работа должна были одобрены институциональных и местных властей и в соответствии с местными и институциональных норм.

1. Мате девственной самки мыши с плодородной шпильки мужчина желаемых генотипов.
   Примечание: Если настройка природные вязки, выбирая самок в течки этапе эстрального цикла увеличивает шансы совокупления на нужную дату. Если индукции суперовуляции, пожалуйста, обратитесь к протоколам, описанным в ^20.
2. Проверьте наличие вагинальной пробки по утрам с помощью тупого зонда. В идеале, сделать это до полудня (12:00), а совокупления вилки теряются в течение дня. Рассмотрим Нооп обнаружения вагинального пробки эмбриональный день (E) 0.5.
3. На нужный день и время эмбрионального развития, разогреть M2 или промывка держит среды (FHM) до КТ или, предпочтительно, 37 ºC. Примечание: В любом М2 или FHM могут быть использованы для промывки и обработки эмбрионов. Когда устройство не используется, хранить эти средства на 4 ° С. Расчетный использование ~ 2 мл среды для каждого матки.
4. Размораживайте 4% параформальдегида (PFA) в фосфатном буферном растворе (PBS) или подготовить свежий раствор. Расчетный 500 мкл 4% раствора PFA на лунку 4-луночный планшет в. Устранить один помет на каждую лунку 4-луночный планшет в. Примечание: В качестве альтернативы, 96-луночный планшет может быть использован для фиксации и хранения эмбрионов. При использовании 96-луночного планшета с, использовать 100 мкл раствора PFA каждую лунку.
5. Вытяните стекло пипетки Пастера использованием открытого огня нарисовать конец капиллярной на кончике.
6. Жертвоприношение самку смещением шейных позвонков или CO ₂ ингаляции или в соответствии с местными и институциональных норм. Это часто desirablе, чтобы подтвердить эвтаназию животного смещением шейных позвонков.
7. Спрей брюхо животного с 70% -ным этанолом, чтобы свести к минимуму выпадения волос и выполнять брюшную разрез, первый через кожу и впоследствии через стенки тела (брюшины), чтобы обнажить внутренности.
   Примечание: Следующие шаги описывают процедуру, чтобы собрать бластоцисты из матки беременной самки мыши на любой стадии между E3.25 и E4.5 (Рис. 1А) Для протоколов по сбору преимплантационных эмбрионов раньше, чем E3.25 см ^{до 20.}
8. Найдите матки и удалить из животного. Держа шейки конец матки с парой щипцов, вырезать через шейку и тянут мягко растянуть оба рога матки.
9. Обрежьте жир из матки, заботясь, чтобы не проколоть стенку матки. Это можно легко сделать в момент удаления, а еще привязаны к телу животного, а матка может быть вытянута. Альтернативно, егоможет быть сделано позже, под микроскопом рассечение, в РТ PBS. Для более детального протокола о вскрытии матки, см Протоколы 5 & 8 ²⁰
10. Вырезать выше яйцеводах ниже яичников, чтобы освободить всю матку, место на чашку Петри и накрыть PBS.
    Примечание: Этот шаг также позволяет мойку избыточного крови или другого мусора из матки, что облегчает последующую уборку бластоцисты.
11. Отдельные обе маточные рожки резанием через проксимальный конец, на обеих сторонах шейки матки и отбросить шейки матки. Отделить каждый яйцевод из матки путем разрезания ниже перешейка, который соединяет их (Рис. 1А) Передача оба рога к падению манипуляции среднего (либо M2 или FHM) для сбора и манипуляции эмбрионов.
12. Под микроскопом рассечение, скрытой бластоцисты из матки и в среду, заставляя 0,5 - 1 мл M2 или FHM через каждый рог матки от шейки открытия. Используйте 1мл шприц с иглой гиподермальным. Примечание: Игла может быть притуплены с помощью подачи камень, чтобы избежать разрыва матки, хотя это не является критическим. Подробное схема для матки промывки могут быть найдены в ^21.
13. Использование рассечение микроскоп, местонахождение бластоцисты, которые будут разбросаны по всей капле среды. Разрешить до 1 - 2 мин для бластоцисты для опускаются на дно чашки после промывки. Использование рот управлением, стекло пипетки Пастера с конца капиллярной, собрать все бластоцисты и передать свежего капли СМИ.
14. Промыть бластоцисты, перемещая их через 2 - 3 капли свежего M2 или FHM. Перемещение эмбрионов в группах по 5 - 10 бластоцист одновременно.
    Примечание: Перемещение больших групп в любой момент времени будет ускорить процесс, но это также увеличит шансы случайной потери много эмбрионов. Если необученных в использовании рта управлением пипетки, практикующих манипуляции и пересадка эмбрионов должны быть рассмотрены до бeginning эксперимент.
15. Удалите пеллюцида (ZP) от невыведенного бластоцисты (обычно
16. Соблюдайте осторожность при обращении денудированные бластоцисты, что они придерживаются очень легко стеклянных и пластиковых поверхностей. Манипуляция среднего содержать 4 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) для предотвращения вложение, но кислота Тирода или PBS нет, поэтому, чтобы снизить риск повреждения или потери эмбрионов не подобрать более 2 - 5 денудированные бластоцисты в то время, когда манипулируя ими в BSA-бесплатно или бессывороточной PBS или кислоты Тирода.
    Примечание: В качестве альтернативы, слой стекло пипетки с 1% BSA перед использованием, чтобы уменьшить прилипание эмбрионов к поверхности стекла.

Покройте дно каждой лункииз 4-луночный блюдо культуры ткани с тонким слоем 1% агара, 0,9% NaCl, чтобы предотвратить эмбрионов от присоединения к пластику. Альтернативно, добавить 4 мг / мл БСА в PBS (PBS-BSA).

Заполните одну лунку покрытием 4-луночного блюдо культуры ткани с 500 мкл RT PBS (или PBS-BSA), а другой хорошо с 500 мкл 4% PFA в PBS.

Промыть бластоцисты в РТ PBS и зафиксировать в 4% PFA в ФБР в течение 10 мин при комнатной температуре. Переезд в PBS (или PBS-BSA) после фиксации.

Если эмбрионы не будут обработаны немедленно, покрыть PBS, содержащий зародыши слоем минерального масла для предотвращения испарения (что приводит к высыханию образца) и хранить пластины при температуре 4 ° С.
Примечание: Различные методы фиксации и времена могут быть использованы в зависимости от эксперимента, эпитопы интересных и антитела, которые будут использоваться. Какой бы метод выбора, быть постоянной в течение эквивалентные эксперименты, чтобы облегчить последующее сравнение результатов окрашивания.
Примечание: Паузаточка: Эмбрионы могут храниться при температуре 4 ° С в PBS в течение нескольких недель, прежде чем приступить к следующему шагу. Обеспечить PBS стерильна и / или добавить 100 ед / мл пенициллина + 100 мкг / мл стрептомицина (Pen-Strep) для предотвращения бактериального заражения (особенно при использовании PBS-BSA), если предвидя длительного хранения.

2. иммунофлуоресценции

1. Выполните иммунофлуоресценции с использованием любого протокола, который ранее была проверена и подтверждена, чтобы быть надежной для всей монтажа иммунофлюоресценции. Примечание: Мы рекомендуем те, что описаны ^{в 22 и 11.} В настоящей статье бывший будут описаны. Какой бы метод выбора, быть постоянной в течение эквивалентные эксперименты, чтобы облегчить сравнение результатов окрашивания.
2. Используйте гибкую, поливинилхлорид, понятно, U-дном 96-луночного планшета для выполнения последовательные стадии протокола иммунофлюоресценции. Заполните каждую лунку 50 - 100 мкл раствора и двигаться эмбрионов от одного решенияк другому с использованием L-образный рот пипеткой. Примечание Этот подход минимизирует использование реагентов и облегчает отслеживание шаги, а также параллельное окрашивание нескольких экспериментальных группах.
   1. Дополнительно: Покрыть дно лунки с тонким слоем 1% агара, 0,9% NaCl, чтобы предотвратить прилипание зародышей к пластмассе. Не добавлять BSA в иммунофлюоресценции решений.
3. Подготовьте УАТС (0,1% Тритон Х-100 в PBS). Если ожидая выполнения нескольких экспериментов иммунофлюоресценции, подготовить 50 мл АТС и хранить при температуре 4 ° С между экспериментами.
4. Получают раствор проницаемости (0,5% Тритон Х-100, 100 мМ глицина в PBS). Сделать 1 мл (или в зависимости от того количество, необходимое) свежего раствора пермеабилизации для каждого эксперимента.
5. Подготовьте блокирующий раствор (2% лошадиной сыворотки (HS) или 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) с Pen-Strep в PBS). Подготовьте 10 мл и хранят при температуре 4 ° С между экспериментами.
   1. Никаких различий не наблюдалось между либотип сыворотки, однако, быть последовательным в выборе блокирующий раствор, используемый для эквивалентных экспериментах.
6. Промыть фиксированные эмбрионы в течение 5 мин при комнатной температуре в УАТС (~ 100 мкл).
7. Проницаемыми эмбрионов в течение 5 мин при комнатной температуре в пермеабилизации раствора (~ 100 мкл).
8. Промыть эмбрионы в течение 5 мин при комнатной температуре в УАТС (~ 100 мкл).
9. Блок эмбрионы в течение 30 мин до 1 ч при комнатной температуре в ~ 100 мкл блокирующего раствора. Накройте решение со слоем минерального масла, чтобы предотвратить испарение или держать во влажной камере.
   Примечание: Эмбрионы могут быть заблокированы до O / N периодов при 4 ° С без заметного улучшения или ущерб по сравнению с 30 мин блокирующих шагов.
10. Выдержите эмбрионов O / N при 4 ° С в первичных антител / антитела разводили в блокирующем растворе (~ 100 мкл). Накройте решение со слоем минерального масла, чтобы предотвратить испарение или держать во влажной камере.
    1. Определить оптимальную разбавление для каждого первичного антитела заранее. См дiscussion и материалы раздела для тестируемых разбавлений ряда антител.
11. После O / N инкубации, промыть эмбрионы 3x в течение 5 минут каждый при комнатной температуре в УАТС (~ 100 мкл).
12. Блок эмбрионы в течение 30 мин до 1 ч при комнатной температуре в ~ 100 мкл блокирующего раствора. Накройте решение со слоем минерального масла, чтобы предотвратить испарение или держать во влажной камере.
13. Инкубируйте эмбрионов для 1 до 2 ч при температуре 4 ° С в вторичное антитело / антител разбавленного в 4 мкг / мл в ~ 100 мкл блокирующего раствора. Накройте решение со слоем минерального масла, чтобы предотвратить испарение или держать во влажной камере.
14. Промыть эмбрионы 2x в течение 5 мин каждый при комнатной температуре в УАТС.
15. Перемещение эмбрионов предпочтительного пятна ДНК. При использовании Hoechst 33342, разбавить до 5 мкг / мл в PBS. Накройте решение со слоем минерального масла, чтобы предотвратить испарение или держать во влажной камере.
    Примечание: Пауза точку: Если эмбрионы не изображаемого сразу, они могут быть сохранены для ир до нескольких недель в растворе ядерного окрашивания. В этом случае, обеспечить PBS стерильна и / или добавить Pen-Strep или азид натрия, чтобы предотвратить рост бактерий и загрязнений.

3. конфокальной микроскопии

Примечание: Отдельные конфокальной конфигурации микроскопа потребует особых параметров измерения быть скорректированы для системы и программного обеспечения на месте. Тем не менее, в следующем разделе представлены ряд общих правил, которые следуют, которые должны быть применимы к любой данной системы.

1. Использование тонкой рот пипеткой, сделать микрокапель PBS или раствора ядерной пятно на стеклянной поверхности 35мм стеклянным дном блюдо и накрыть минеральном масле. В качестве альтернативы, использовать обычный покровное с силиконовыми сепараторов, чтобы избежать повреждения эмбрионов и накрыть предметное стекло микроскопа. Примечание: При использовании обычного покровное, эмбрионы могут не быть впоследствии вновь расположен или восстановлены для генотипирования, поэтому мы настоятельно рекомендуем использовать стеклянным дномблюда.
2. Место эмбрионов в микрокапель и устроить в согласованном порядке, предпочтительно с осью ICM-полости, параллельной поверхности стекла. Настройка блюдо на держателе микроскопа. Примечание: Изображения, полученные на лазерных сканирующих конфокальных микроскопов страдают от оси Z.-ассоциированной потерей интенсивности флуоресценции. Поэтому последовательность в расположении важно для сравнения интенсивности между эквивалентными регионах на разных эмбрионов.
3. Настройка параметров-ссылок, используя дикие эмбрионов типа, которые не были предметом каких-либо лечения, которые могут изменить экспрессию генов.
   1. Получение изображений с использованием объектива большим увеличением (т.е. 40X или выше), чтобы получить данные, которые будут способствовать точной сегментации, используя инструмент мин ^4.
      Примечание: Использование цифрового зума на цели 20Х не даст изображения подходящего разрешения для сегментации, используя мин. Следует также отметить, рабочее расстояние (WD) целевой, так и должно бытьдостаточно, чтобы позволить приобретение Z-стека, который охватывает весь бластоцисты, таким образом долгое WD (~ 130 - мкм 150) Цель обычно необходимо. Показанные изображения на рисунках 2 - 4 были получены с помощью 1,30 масляный иммерсионный объектив 40X / NA с рабочим расстоянием 210 мкм.
   2. Используйте самую слабую лазерный, что обеспечивает сильное отношение сигнал-шум без отбеливания флуорофоры.
   3. Регулировка усиления и смещения для получения широкого динамического диапазона без передержки образца. Разоблачение изображений, чтобы покрыть большую часть, или охватывать весь, серый Диапазон шкалы будет способствовать выявлению небольшими различиями в интенсивности между изображениями.
   4. С помощью небольшой (1 мкМ) Z-шаг, так как разрешение по оси Z является критическим для точного сегментирования с мин.
      Примечание: размеры XY не влияют на процесс ядерного сегментации, только размер файла изображения. Как правило, 512 х 512 пикселей является достаточным разрешением XY для публикации качественных снимков без compromiпеть места на жестком диске.
   5. Критический шаг: Держите визуализации параметров последовательные внутри и между изображениями сессий того же эксперимента с тем, чтобы иметь возможность сравнить образцы.
4. Визуализация партий эмбрионов:
   1. Image когерентные группы (пометы, эксперименты) в течение одной сессии, когда это возможно.
   2. Хранить параметры последовательные внутри и между сеансами изображений для повторов одного и того же эксперимента.
   3. Эмбрионы Image повсюду (всего оси Z.), чтобы захватить каждую клетку.
      Примечание: Если желательно, эмбрион генотипирование может быть сделано после визуализации, как описано в ^23. Необходимость ПЦР должна быть определена эмпирически и зависит от локуса, которые необходимо анализировать и праймеров, используемых.
5. Убедитесь, чтобы иметь возможность соответствовать эмбрионов к изображениям ретроспективно.

4. Анализ изображения и предварительной обработки данных

1. Загрузить и установить минут ^{4 от} HTTP: // Катлаb-tools.org (требуется лицензия MATLAB).
2. Выполните сегментацию изображения:
   1. Следуйте графический пользовательский интерфейс (GUI) из минут, чтобы загрузить конфокальной изображение или стек с жесткого диска, обнаружение ядер и сегментировать изображение. Загрузите весь Z-Stack исходных данных, генерируемых микроскопом (.lsm, .lif, .oif и т.д.). См таблицу 2 для подробной информации о каждом шаге и инструкциями по http://katlab-tools.org и ^4. После завершения просмотра результатов каждого шага, нажав на кнопку, соответствующую 'View'. Желтый тег над кнопкой указывает операцию в процессе, зеленый бирка указывает операция завершена.
      Примечание: MINS настоящее время не поддерживает .czi файлы, .tiff последовательностей или многостраничных файлов позиции - каждый Z-стек должен быть независимым файлом.
   2. После удовлетворительной сегментации, сохранить трубопровод созданную таким образом это может быть использован непосредственно для других эмбрионов или пометов.
3. Сегментация в пакетном режиме:
   Примечание: Single файлы могут быть сегментирован по отдельности. Однако, учитывая, что эмбрионы внутри подстилки или эксперимента, как правило, сопоставимой стадии, MINS можно применить сегментации трубопровод, созданный для одного снимка к группе них без присмотра.
   1. Из меню в пакетном режиме Run, нажмите кнопку "Добавить файлы" и загрузить все файлы, которые будут обработаны сразу. Примечание: Файлы из различных источников могут быть добавлены в очередь сегментации.
   2. Нажмите "Начать пакетном режиме Run 'и дать время для программного обеспечения для обработки файлов. Примечание: Выход Сегментация будут сохранены в той же директории, где исходные файлы, где находится.
4. Оценка Сегментация и ручная коррекция
   Примечание: MINS сегменты изображения с очень высокой точностью (> 85%), однако, качество окраски и обработки изображений, а также этап эмбриона, может повлиять на производительность мин. Обычно, чем выше ядерная плотность в пределах эмбриона, тем больше вероятность ошибки сегментации примет Placе (Рисунки 2D, 3). Таким образом, точность сегментации должны быть оценены для каждого образца и вручную исправить, если это необходимо. Два типа ошибок, как правило, происходят: чрезмерной сегментации и под-сегментации.
   1. Решение чрезмерной сегментации:
      1. Определить количество ложных срабатываний - апоптоза везикулы (Фигура 3А а, б, д, звездочками) или другие элементы, которые не являются неизменными ядра, но которые, возможно, были идентифицированы в качестве таковых минут.
         Примечание: Как правило, такие ложных срабатываний имеют меньший размер, чем реальных ядер и может, в большинстве случаев, можно легко идентифицировать и сортируются на таблицу. Однако визуальный осмотр настоятельно рекомендуется, так как зачастую ядра могут быть лишь частично сегментированные, в результате чего меньше, но действительный сегментированного объема (Фигура 3А б, стрелки).
      2. Удалить соответствующие записи для ложных срабатываний из файла * statistics.csv. Сохранить оригинальный * Статистика.csv файл для дальнейшего использования и редактирования только его копию.
      3. Если ядро было чрезмерно сегментирован и представлены в виде 2-х или более ядер (рис 3А с, стрелки и наконечники для стрел), либо объединить эти записи путем усреднения их уровень интенсивности или, если подобное, держать на одной из записей для этой ячейки и отбросить отдых.
   2. Решение под сегментации:
      1. Определить события, где MINS не удалось обнаружить границу между двумя или более ядер и, следовательно сегментированные их как одно ядро (фиг.3А д, стрелка и 3В). Примечание: Это создает проблему для точного подсчета клеток, но что более важно, для количественного содержания белка, а измеренные уровни будет средним из клеток, которые были ошибочно объединены, и которые могут принадлежать к различным родах.
      2. Определить события, где MINS не удалось обнаружить ядро ​​в целом.
      3. В этих случаях (4.4.2.1 и 4.4.2.2), измерить средние уровни серого Fили каждый канал в недо- или снимите сегментированного элемента (элементов) с использованием альтернативного инструмента, таких как ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/~~HEAD=pobj), и заменить неисправный запись с правильными уровнях. Сохранение оригинального * statistics.csv файл для дальнейшего использования и редактирования только копию. Чтобы сделать это, используя ImageJ, выполните следующие действия:
         1. Откройте соответствующую стопку многоканальный на ImageJ и импорта соответствующий * overlaid.tiff файл, созданный с помощью МИНУТ качестве виртуального стека ( 'Файл'> 'Import'> 'TIFF виртуальный стек ... ").
         2. Найти медиальной раздел недо- или не-сегментированным ядром.
         3. Используя инструмент выделения произвольной формы очертить периметр понимания или не-сегментированным ядром на канале ДНК пятен.
         4. Пресс Crl + М (Cmd + M на Macintosh) или перейти к меню Анализ и выберите 'Measure'. Это действие будет записывать среднее значение серого для области, описанной и отобразит его в новом окне. К "Анализ">9; измерения Set ... "и убедитесь, что 'Mean значение серого' выбран. Выберите любые другие параметры должны быть измерены.
         5. Используя ту же самую площадь, описанной в шаге 4.4.2.3.3, повторить измерение для каждой из флуоресцентных каналов, представляющих интерес. Результаты будут добавлены к предыдущим на окне измерений 'Результаты.
         6. Используйте полученные замеры, чтобы заменить ошибочные записи в файле * statistics.csv. Если ядро ​​не были сегментирован, вставить новую строку, присвоить ему новое Cell ID и ввести полученные значения в ImageJ под соответствующей колонке для каждого канала. Эта ячейка не имеют пространственные координаты (X, Y и Z.). Если ядро ​​было undersegmented, дублировать строку, присвоить различные идентификаторы мобильных каждому новому клетки и ввести полученные значения в ImageJ под соответствующей колонке. В этом случае, оба клетки будут делиться пространственные координаты.
            Примечание: Если пространственное распределение должно быть проанализировано, мы гecommend исключая XYZ координаты этих клеток, как они будут перекрываться. С этой целью, при создании новых записей, назначить идентификаторов сот на них, которые легко отличить от оригинальных (например, не являющихся целыми числами).
   3. Результат деления клеток. Примечание: MINS обнаруживает митотического а также интерфазных ядрах, но не может их различить.
      1. Если митоза ядер следует рассматривать отдельно в анализе, вручную набрать эти и добавить эту информацию в файле данных. Для записи митотических клеток, добавьте новую переменную (столбец) в * файла данных statistics.csv и назначать различные значения митотического и интерфазных ядрах.
5. Данные предварительной обработки.
   Примечание: После того, как электронные таблицы были исправлены для избыточной и недостаточной сегментации они готовы быть проанализированы. Процесс анализа и представления данных, будет зависеть от конкретного эксперимента. Тем не менее, ниже приведены некоторые общие преобразования данныхрекомендуется проводить перед анализом:
   1. Transform значения интенсивности флуоресценции в их логарифм или корень квадратный уменьшить разброс данных. Это также помогает визуализация, а исходные данные имеют тенденцию концентрироваться вблизи оси участке (рис 4B, C).
   2. Исправьте Z-ассоциированной затухание флуоресценции:
      Примечание: Интенсивность флуоресценции в лазерной сканирующей конфокальной микроскопии изображений уменьшается глубже по оси Z. кусочек находится (рис 4E, F).
      1. Если один из эпитопов, обнаруженных в образцах является повсеместно и равномерно выражена уборка ядерного маркера, нормализуют интенсивности флуоресценции других эпитопов путем деления их значения в каждой ячейке по соответствующим значением домашнего хозяйства маркера.
      2. При отсутствии такого опорного маркера, компенсировать Z-ассоциированной потерей флуоресценции следующим образом:
         1. Участок значения каждого маркера (Yось графика) над Z положении (ось Х на графике), чтобы визуализировать снижение интенсивности по Z - участок вместе значения всех контролем, дикие эмбрионы типа (рис 4F).
         2. Установите линейную модель (кривая регрессии) к сюжету, полученного на предыдущей стадии (интенсивность ценностей над Z) для каждого маркера (рис 4F).
         3. Исправьте все значения для каждого маркера, используя следующую формулу:
            Журнал (исходное значение) + Z * наклон модели (рис 4D, G).
            Примечание: конкретные шаги для выполнения этой коррекции будет зависеть от программного обеспечения для анализа, используемого (R, MATLAB и т.д.). При использовании R, выполните следующую формулу, чтобы соответствовать линейной модели к данным:
            > Лм (журнал (канал) ~ Z, данные = dataframe)
            где, канал флуоресценции канала должна быть исправлена, Z является Z координат и dataframe является таблица, содержащая все значения для нужного эмбриона (ов) (в * статistics.csv файл, сгенерированный минут или модификации ней).
            Примечание: Выход по вышеприведенной формуле будет иметь следующий формат:
            (Переадресация) Z
            4,76373 -0,01947
            где значение Z представляет собой наклон линии регрессии для этого набора данных, который абсолютное значение должно быть использовано для изменения первоначальной стоимости с формулой, приведенной в 4.5.2.2.3 (рис 4G для примера).

Results

Для облегчения интерпретации данных и представления, следует позаботиться, чтобы не повредить эмбрионов во время сбора и обработки, так что могут быть проанализированы все клетки и их взаимное расположение фиг.2А -. D приведены примеры неповрежденных бластоцисты на разных этапах с расширенной полости. В случае повреждения, особую осторожность следует принимать при анализе и интерпретации результатов.

Качество ...

Discussion

Настоящий Протокол описывает метод для выполнения количественного анализа целом монтажа иммунофлуоресценции на предимплантационной эмбрионов этап мыши. Надежный протокол ²² иммунофлюоресценции следует высоким разрешением, целый монтажа конфокальной микроскопии и сегментацией изображения, используя индивидуальный кусок программного обеспечения ^4. Хотя выбор протокола иммунофлюоресценции не является критическим, мы находим один представленные здесь ^22, чтобы быть быстрым, надежным и обеспе...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Embryo collection
Тупой зонд для проверки пробок	Roboz	RS-9580
Щипцы	Roboz	RS-4978
Хирургические ножницы	Roboz	RS-5910
Стеклянные пипетки Пастера	Fisher	13-678-20C
Предварительно собранная аспираторная трубка и	мундштук Sigma	A5177
Резиновая трубка длиннее	Fisher	14-178-2AA
M2	Millipore	MR-015-D
FHM	Millipore	MR-024-D
Раствор кислотного тирода,	Millipore	MR-004-D Пенициллин
/Стрептомицин	Gibco	15140
Бычья сыворотка Альбумин	Sigma	A9647
4-х луночные планшеты	Nunc/Thermo-Fisher	12-566-300
<сильная>Иммунофлюоресцентная
96-луночная U-образная донная пластина	Fisher	14-245-73
Triton X-100	Sigma	T8787
Глицин	Sigma	G7403
Лошадиная сыворотка	Sigma	H0146
Первичные антитела			<сильная>концентрация
CDX2	Biogenex	AM392-5M	1:200
GATA6	R& D	AF1700	1:100
GATA4	Санта-Круз	sc-9053	1:100, 10 мин фиксация
GATA4	Санта-Крус	sc-1237	1:100, O/N фиксация
SOX17	R& D	AF1924	1:100
Nanog	ReproCELL	RCAB0002P-F	1:500
OCT4	Santa Cruz	sc-5279	1:100, 10 мин до фиксации O/N
DAB2	BD	BD-610464	1:200
Вторичные антитела	Life Technologies	Различные	1:500
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
Imaging
35 мм посуда со стеклянным дном	MatTek	P35G-1.5-14-C
Segmentation
Компьютер под управлением 64-разрядной ОС		n/a	Проверьте минимальные системные требования на http://katlab-tools.org и в Lou et al., (2014) Stem Cell Reports
MATLAB (программное обеспечение)	Mathworks	n/a
MINS (программное обеспечение)	Бесплатный	н/д	http://katlab-tools.org