Количественный анализ экспрессии белка по изучению Lineage Спецификация в клетках мышиной предимплантационной эмбрионов

Summary

Этот протокол представляет собой метод для выполнения количественного, для одной ячейки в месте анализа экспрессии белка изучать спецификации клонов у мышей преимплантационных эмбрионов. Процедуры, необходимые для сбора бластоцисты, вся монтажа обнаружение Иммунофлуоресцентной белков, томография образцов на конфокальной микроскопии и ядерного сегментации и анализа изображений описаны.

Abstract

Этот протокол представляет собой способ для выполнения количественной, одноклеточный на месте анализов экспрессии белка изучать спецификации клонов в мышиных эмбрионов предимплантационной. Процедуры, необходимые для получения эмбрионов, иммунофлюоресценции, визуализации на конфокальной микроскопии и сегментации изображений и анализа описаны. Этот метод позволяет количественное определение экспрессии нескольких ядерных маркеров и пространственные (XYZ) координаты всех клеток в эмбрионе. Он использует минут, при этом изображения инструмента сегментации программное обеспечение, специально разработанной для анализа конфокальных изображений преимплантационных эмбрионов и эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) колоний. MINS осуществляет неконтролируемый ядерный сегментацию через X, Y и Z размеры, и производит информацию о положении клеток в трехмерном пространстве, а также уровень ядерные флуоресценции для всех каналов с минимальным пользовательского ввода. Хотя этот протокол был оптимизирован для анализа изображенийиз предимплантационной эмбрионов этап мыши, он может быть легко адаптированы к анализу любых других образцов, обладающих хорошим соотношением сигнал-шум и где высокая плотность ядер представляет препятствие для сегментации изображений (например., выражение анализ эмбриональных стволовых клеток (ЭСК ) колонии, дифференцируя клеток в культуре, эмбрионы других видов или стадий, и т.д.).

Introduction

Мыши предимплантационной эмбрионов является парадигмой для изучения возникновения и поддержания плюрипотентности в естественных условиях, а также модели для изучения спецификации клеточных судеб и De Novo эпителизации у млекопитающих. В предимплантационная этапы развития млекопитающих посвящены созданию трех клеточных линий, которые составляют бластоцисты, а именно плюрипотентных эпибласте - что приводит к большинству соматических тканей и зародышевых клеток - и двух внеэмбриональные родах, то трофэктодерме (ТЕ) и примитивный эндодермы (предварительно) (1А) ^1,2. Этот протокол описывает процедуры (1) эмбрионов урожай и исп....

Protocol

Заявление по этике: Все животное работа, в том числе животноводства, селекции и жертвы был одобрен Институциональные животных уходу и использованию комитета Memorial Sloan Kettering Cancer Центра (IACUC), протокол # 03-12-017 мимо.

1. эмбрионов

Примечание: Все животное работа должна были одобрены институциональных и местных властей и в соответствии с местными и институциональных норм.

1. Мате девственной самки мыши с плодородной шпильки мужчина желаемых генотипов.
   Примечание: Если настройка природные вязки, выбирая самок в течки этапе эстрального цикла увеличива....

Results

Для облегчения интерпретации данных и представления, следует позаботиться, чтобы не повредить эмбрионов во время сбора и обработки, так что могут быть проанализированы все клетки и их взаимное расположение фиг.2А -. D приведены примеры неповрежденных бластоцисты на разных этапах с расширенной полости. В случае повреждения, особую осторожность следует принимать при анализе и интерпретации результатов.

Качество .......

Discussion

Настоящий Протокол описывает метод для выполнения количественного анализа целом монтажа иммунофлуоресценции на предимплантационной эмбрионов этап мыши. Надежный протокол ²² иммунофлюоресценции следует высоким разрешением, целый монтажа конфокальной микроскопии и сегментацией изображения, используя индивидуальный кусок программного обеспечения ^4. Хотя выбор протокола иммунофлюоресценции не является критическим, мы находим один представленные здесь ^22, чтобы быть быстрым, надежным и обеспе.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Embryo collection
Тупой зонд для проверки пробок	Roboz	RS-9580
Щипцы	Roboz	RS-4978
Хирургические ножницы	Roboz	RS-5910
Стеклянные пипетки Пастера	Fisher	13-678-20C
Предварительно собранная аспираторная трубка и	мундштук Sigma	A5177
Резиновая трубка длиннее	Fisher	14-178-2AA
M2	Millipore	MR-015-D
FHM	Millipore	MR-024-D
Раствор кислотного тирода,	Millipore	MR-004-D Пенициллин
/Стрептомицин	Gibco	15140
Бычья сыворотка Альбумин	Sigma	A9647
4-х луночные планшеты	Nunc/Thermo-Fisher	12-566-300
<сильная>Иммунофлюоресцентная
96-луночная U-образная донная пластина	Fisher	14-245-73
Triton X-100	Sigma	T8787
Глицин	Sigma	G7403
Лошадиная сыворотка	Sigma	H0146
Первичные антитела			<сильная>концентрация
CDX2	Biogenex	AM392-5M	1:200
GATA6	R& D	AF1700	1:100
GATA4	Санта-Круз	sc-9053	1:100, 10 мин фиксация
GATA4	Санта-Крус	sc-1237	1:100, O/N фиксация
SOX17	R& D	AF1924	1:100
Nanog	ReproCELL	RCAB0002P-F	1:500
OCT4	Santa Cruz	sc-5279	1:100, 10 мин до фиксации O/N
DAB2	BD	BD-610464	1:200
Вторичные антитела	Life Technologies	Различные	1:500
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
Imaging
35 мм посуда со стеклянным дном	MatTek	P35G-1.5-14-C
Segmentation
Компьютер под управлением 64-разрядной ОС		n/a	Проверьте минимальные системные требования на http://katlab-tools.org и в Lou et al., (2014) Stem Cell Reports
MATLAB (программное обеспечение)	Mathworks	n/a
MINS (программное обеспечение)	Бесплатный	н/д	http://katlab-tools.org