Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Замедленная видеомикроскопия для оценки EYFP-Паркин агрегирование в качестве маркера для сотовых Mitophagy

6.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53657

⸱

4 мая 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Cancer Biology, Thomas Jefferson University, SKCC, 2Department of Medical Oncology, Thomas Jefferson University, SKCC, 3Kazan Federal University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы подробно описываем подход покадровой видеомикроскопии к измерению временного рекрутирования EYFP-паркина во время селективного удаления поврежденных митохондрий. Этот динамический процесс EYFP-паркин-зависимого удаления поврежденных митохондрий может быть использован в качестве индикатора клеточного здоровья в различных экспериментальных условиях.

Аннотация

Покадровая видеомикроскопия может быть определена как визуализация живых клеток в реальном времени. Этот метод основан на сборе изображений в разные моменты времени. Временные интервалы могут быть заданы с помощью компьютерного интерфейса, который управляет камерой, встроенной в микроскоп. Этот вид микроскопии требует как способности регистрировать очень быстрые события, так и сигнал, генерируемый наблюдаемой клеточной структурой во время этих событий. После того, как изображения собраны, собирается фильм всего эксперимента, чтобы показать динамику интересующих молекулярных событий. Покадровая видеомикроскопия имеет широкий спектр применения в области биомедицинских исследований и является мощным и уникальным инструментом для отслеживания динамики клеточных событий в режиме реального времени. С помощью этой техники мы можем оценить такие клеточные события, как миграция, деление, передача сигнала, рост и смерть. Кроме того, с помощью флуоресцентных молекулярных зондов мы можем помечать конкретные молекулы, такие как ДНК, РНК или белки, и следить за их молекулярными путями и функциями. Покадровая видеомикроскопия имеет множество преимуществ, главным из которых является возможность сбора данных на уровне отдельных клеток, что делает ее уникальной технологией для исследований в области клеточной биологии. Однако покадровая видеомикроскопия имеет ограничения, которые могут помешать получению изображений высокого качества. Изображение может быть скомпрометировано как внешними факторами; колебания температуры, вибрации, влажность и внутренние факторы; pH, подвижность клеток. В данной работе мы описываем протокол динамического захвата специфического белка паркина, слитого с усиленным желтым флуоресцентным белком (EYFP) с целью отслеживания селективного удаления поврежденных митохондрий с использованием метода покадровой видеомикроскопии.

Введение

Макроаутофагия — это внутриклеточный процесс, который включает в себя катаболическую деградацию как поврежденных, так и дисфункциональных клеточных компонентов, таких как органеллы и белки, с целью переработки или производства энергии. Чтобы инициировать этот метаболический процесс, клетка поглощает поврежденные клеточные компоненты в двойную мембранную структуру, известную как аутофагосома, которая сливается с лизосомой, а ее содержимое разлагается и перерабатывается 1,2. Существует два основных типа аутофагии: неселективная и селективная. Процесс неселективной аутофагии происходит, когда клетка находится в условиях недостатка питательных веществ и нуждается в сборе как необходимых питательных веществ, так и энергии. Тем не менее, селективная аутофагия происходит для опосредования удаления как дисфункциональных/поврежденных органелл, так и белков, которые в противном случае могли бы быть токсичными. Одним из наиболее изученных процессов селективной аутофагии является удаление митохондрий, называемое митофагией 1,3-5.

Митохондрии являются центральными органеллами для клеточного метаболизма и основным источником аденозинтрифосфата (АТФ) путем окислительного фосфорилирования через цепь переноса электронов, окисления жирных кислот и цикла трикарбоновых кислот (ТСА). Кроме того, митохондрии регулируют продукцию активных форм кислорода (АФК) и высвобождают белки, которые участвуют в путях гибели клеток 6-8.

PTEN-индуцированная предполагаемая киназа 1 (PINK1) и убиквитин-лигаза Parkin RBR E3 (Parkin) являются ключевыми белками, участвующими в процессе митофагии. Паркин может защитить от гибели клеток, сохраняя клетки здоровыми с помощью контроля качества митохондрий9. При потере потенциала митохондриальной мембраны цитозольный паркин рекрутируется в митохондрии с помощью PINK1. Это привлечение запускает последовательные события митофагии 10. Существует широкий спектр доказательств того, что митофагия является фундаментальным процессом контроля качества митохондрий, и аномалии в этом процессе приводят к заболеванию 7. Например, аутосомно-рецессивная болезнь Паркинсона была связана с мутациями в генах, кодирующих Parkin и PINK1 (PARK2 и PINK1 соответственно) 11. Контроль качества здоровья митохондрий имеет важное значение для удаления митохондрий, которые способствуют накоплению АФК12. Чрезмерное присутствие внутриклеточных АФК может привести к повреждению как ядерной, так и митохондриальной ДНК (ДНК и мт ДНК соответственно).

Здесь мы показываем подход к покадровой видеомикроскопии, чтобы проследить агрегацию паркина после индукции паркин-опосредованной митофагии в иммортализированных эмбриональных фибробластах мышей путем введения in vitro карбонильцианида 4-(трифторметокси)-фенилгидразона (FCCP), разобщающего агента. FCCP нарушает синтез АТФ путем короткого замыкания протонов через внешнюю мембрану митохондрий и, следовательно, разъединения окислительного фосфорилирования с электронно-транспортной цепью 13. Запуск деполяризации митохондриальной мембраны приводит к нарушению работы митохондрий и избирательному паркин-зависимому удалению. Таким образом, трансфекция интересующих клеток экспрессионным вектором, кодирующим паркин, слитым с флуоресцентным маркером (усиленный желтый флуоресцентный белок, EYFP), может быть использована в качестве флуоресцентной метки для отслеживания рекрутирования паркина во время митофагического процесса. Чтобы визуализировать митохондрии, мы совместно трансфицировали pDsRed2-Mito, который кодирует красный флуоресцентный белок (DsRed2), содержащий митохондриальную последовательность-мишень субъединицы VIII цитохром с-оксидазы (Mito). pDsRed2-Mito предназначен для флуоресцентного мечения митохондрий14. Время, необходимое для транслокации Паркина в митохондриальную мембрану, может быть измерено и дает косвенную меру клеточного здоровья. Например, можно сказать, что если клеточная линия, нокаутированная для определенного гена, представляет интерес, демонстрирует более быстрое или более медленное рекрутирование паркина после индукции митофагии FCCP, то этот генный продукт будет играть ключевую роль в поддержании скорости метаболизма клетки на физиологическом уровне и предотвращении развития заболеваний. Таким образом, покадровая видеомикроскопия представляет собой очень мощный инструмент как для фундаментальных, так и для клинических исследований, позволяющий следить за динамикой меченых белков во время их молекулярных процессов и понимать, как эти процессы влияют во время патологического состояния.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Электропорация фибробласте с обоими экспрессирующие векторы EYFP-Паркин и pDsRed2-Мито

  1. Grow иммортализованных мышиных эмбриональных фибробластах клеток на 10 см ткани планшет для культивирования с использованием DMEM (модифицированная среда Игла Дульбекко) среде, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 ммоль / л L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицин в увлажненной атмосфере , содержащей 5% СО 2 при 37 ° с.
    1. На 80% сплошности клеток, отбрасывать полную среду DMEM с помощью стерильного отсоса и добавляют 10 мл стерильного 1x фосфатного буферного раствора (PBS) (80 г NaCl, 2,0 г KCl, 14,4 г Na 2 HPO 4 2,4 г КН 2 PO 4 и 1 л дистиллированной H 2 O, PH: 7,4).
    2. Выбросьте PBS стерильным отсасывают и добавляют 1 мл трипсина-EDTA 0,25%. Инкубируйте планшет при 37 ° С до тех пор, пока клетки не отделяются (2 - 3 мин). Добавляют 4 мл полной среды DMEM, ресуспендирования клеток и вынимают 10 _6; л клеточной суспензии для подсчета гемоцитометра.
      Примечание: гемоцитометре разработан таким образом , что число клеток в одном наборе из 16 угловых квадратов эквивалентно числу ячеек х 10 4 / мл.
  2. Семенной 1 х 10 6 клеток на 10 см для культуры ткани блюд за 24 часа до начала процесса электропорации.
  3. Выбросьте полной среды DMEM стерильным отсасывают и добавляют 10 мл стерильной PBS. Выбросьте PBS стерильным отсасывают и добавляют 1 мл трипсина-EDTA 0,25%. Инкубируйте планшет при 37 ° С до тех пор, пока клетки не отделяются (2 - 3 мин). Добавляют 4 мл полной среды DMEM и клетки вновь суспендируют в 15 мл пробирку.
  4. Спин ячейки вниз при 250 х г в течение 5 мин, используя охлаждаемую-центрифуге (4 ° С). Жидкость над осадком сливают стерильным отсоса и ресуспендируют осадок в 1 мл стерильной PBS. Спин ячейки вниз при 250 х г в течение 5 мин при 4 ° C.
  5. Удалите супернатант с помощью стерильного отсасыванием и добавляют 100 мкл Oе смесь раствор для электропорации (82 мкл электропорации Solution V + 18 мкл раствора 1 Дополнительное) к осадку клеток и осторожно ресуспендируют осадок пипеткой (Для получения более подробной информации обратитесь к руководству пользователя). Добавить 2 мкг EYFP-Паркином (возбуждения / испускания 514/527) и 1 мкг pDsRed2-Мито (возбуждение / излучение 565/620) в клеточной суспензии.
  6. Переносят раствор в стерильной кювету с использованием одноразового использования Пастера (оба инструмента снабжены комплектом) и электропорации с использованием предварительно установленной программы NIH / 3T3 U-030 (Одиночный импульс, напряжение 200 В, емкость 960 мкФ, длительность импульса 20 мс , количество импульсов: 1).
  7. Сразу после электропорации, добавьте 500 мкл свежей подогретого полной среде DMEM и семенем клетки на 6 см тканевого культурального планшета живого изображения степени злокачественности и инкубировать их в увлажненной атмосфере , содержащей 5% СО 2 при 37 ° С в течение 24 часа.

2. Замедленная видеомикроскопия

  1. Установите температуру камеры микроскопа при 37 ° C перед использованием.
  2. На данный момент, подготовить конкретную среду живого изображения, чтобы приступить к экспериментальным протоколом. Подготовьте носитель живого изображения следующим образом; смешивать DMEM, фенолов в с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 ммоль / л L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина. Предварительно нагреть среду живого изображения при 37 ° С в водяной бане.
  3. Выбросите среду электропорации клетки стерильным отсоса и добавляют 1 мл подогретого среды живого изображения, используя пипетку P1000 и инкубируйте в течение 30 мин при 37 ° С.
  4. В течение периода инкубации пластины, приток 5% СО 2 в камере уже микроскопа при стабильной температуре 37 ° С.
  5. Поместите пластину с электропорации клеток в камере микроскопа, избегая крупных движений или колебаний.
  6. С помощью программного интерфейса, установите микроскоп, чтобы обнаружить как fluoreScence сигналы от слитых белков, кодируемых котрансфицируют векторами, EYFP-Паркин (диапазон возбуждения 495 до 510 нм и диапазон эмиссии от 520 до 550 нм, зеленый) и pDsRed2-Мито (Возбуждение максимум 558 нм и эмиссии максимум 583 нм, красный).
    1. Откройте замедленную видеомикроскопия программного обеспечения. В верхнем меню выберите FITC для EYFP-Паркин и родамина для pDsRed2-Мито. В верхнем меню выберите увеличение (20X).
  7. Используя программный интерфейс, обратите внимание на одну ячейку, выражающего оба котрансфицируют векторов и зарегистрировать положение. Повторите этот шаг до тех пор, как минимум 10 клеток не собирается для каждого условия эксперимента (экспериментальная группа).
    1. Выберите меню "Программы" и нажмите на многомерные Приобретения. В многомерном окна Приобретение выберите параметры, необходимые, например, количество приобретений, интервал времени между каждым приобретением и положением записанной ячейки. Нажмите на кнопку "Acquire"Чтобы начать процесс покупки.
  8. Запуск базальную приобретение как EYFP-Паркином и DsRed2-Мито флуоресцентного сигнала для сбора изображений каждые 5 мин в течение полного интервала 15 мин.
  9. Подготовка подогретого среды живого изображения с концентрацией FCCP в два раза выше, чем в окончательной рабочей концентрации (0,1 - 10 мкМ, зависящая от типа клеток).
  10. Прерывание процесса приобретения и добавьте мягко 1 мл подогретого среды живого изображения с FCCP в пластину внутри камеры микроскопа с использованием P1000 пипетку.
  11. Перезапустите процесс обнаружения, как описано выше, в течение общей сложности в течение 3-х часов, используя запомненное положение. Сохранить все полученные изображения для того, чтобы проанализировать их и создать видео из mitophagic процесса, когда приобретение закончится.

3. Анализ

  1. Соберите все полученные изображения в формате ".tiff" на персональном компьютере
  2. Откройте изображение с графическим мягкимпосуда и определяют временной интервал произошел из митохондриального наведенного деполяризации с FCCP на первое изображение, показывающий набор Паркином в митохондриальной мембране (изображения получены каждые 5 мин). Повторите этот анализ для каждой ячейки в экспериментальной группе.
  3. Добавьте первую ячейку столбца на таблицу с именем экспериментальной группы. Для каждой экспериментальной группы, измерения временных интервалов для Паркин найма минимум 10 клеток. Сделать среднее число вычисленных временных интервалов для Parkin набора и определяют стандартное отклонение для каждой экспериментальной группы (среднее ± стандартное отклонение, n = 10).
    1. Организация в столбцы отдельные расчетные временные интервалы. Каждый столбец содержит N = 10 измерений экспериментальной группы.
    2. Выберите функцию "среднее" из меню Formula Builder. Выберите данные в столбце. Выберите функцию "Стандартное отклонение" в меню Formula Builder. Селект данных в столбце.
  4. Используя статистический подход, сравнить экспериментальные группы, применяющим соответствующие статистические данные, чтобы определить значительную разницу в динамике mitophagy между экспериментальными группами. (К примеру, две группы = Стьюдента-тест, три или более групп = ANOVA плюс испытание ретроспективном)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь мы покажем, как замедленная видео микроскопия является мощным методом, который может быть использован, чтобы следовать за молекулярных событий флуоресцентно-меченных белков в одной клетке. Представительные результаты также показывают, как эта методика позволяет для приобретения высококачественных изображений. Когда изображения молекулярного процесса, получены, мы имеем возможность анализировать их по-разному. Здесь мы анализируем интервал времени между началом индуцированного проце...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Покадровый микроскопии может быть определена как метод, который расширяет изображений живых клеток от одного наблюдения во времени для наблюдения за клеточной динамики в течение длительных периодов времени. Эта методика отличается от простого конфокальной микроскопии или клеток живой, поскольку он позволяет наблюдателю определить в режиме реального времени одну люминесцентную-меченый белок и следить за его динамикой внутри одной живой клетке. На самом деле, конфокальной микроскопии может легко идентифицирует иммуно-мече...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана грантами NIH (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 в R.G.P.), грантом Онкологического центра Киммела NIH Core P30CA056036 (R.G.P.), грантом от Фонда исследований рака молочной железы, щедрыми грантами от Фонда медицинских исследований доктора Ральфа и Мариан К. Фальк (R.G.P.) и грантом от Департамента здравоохранения Пенсильвании (R.G.P.). Частично эта работа была поддержана стипендией Американо-итальянского онкологического фонда (G.D.) и общим ресурсом биовизуализации Онкологического центра Сиднея Киммела (NCI 5 P30 CA-56036). Департамент прямо снимает с себя ответственность за анализ, интерпретации или выводы. В связи с данной рукописью нет никаких конфликтов интересов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMCorning Life Science10-013-CVПредварительный прогрев при 37 ° C перед использованием
DMEM без фенола CorningLife Science17-205-CVПредварительно прогреть при 37 ° C перед применением
Фетальная бычья сывороткаSigma-AldrichF2442Предварительно подогреть при 37 ° C перед применением
L-глютаминGibco25030Предварительно подогреть до 37 ° C перед применением
Пенициллин/стрептомицинCorning Life Science30-002-CIПредварительно подогреть при 37 ° C перед применением
вектора экспрессии EYFP-PARKINAddgene23955
pDsRed2-Mito вектор экспрессииClontech632421
Nucleofector 2B deviceLONZAAAD-1001S
Nucleofector for kit R NIH/3T3LONZAVCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M инвертированный микроскопCARL ZEISS
Карбонилцианид 4-(трифторметокси)-фенилгидразон (FCCP)Sigma-AldrichC2920
MetaMorph Молекулярные устройстваЭкспериментальный конструктор
ImageJНациональный институт здравоохраненияЭкспериментальный конструктор

Ссылки

  1. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 9-14 (2011).
  2. Zhi, X., Zhong, Q. Autophagy in cancer. F1000Prime Rep. 7, 18(2015).
  3. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biol Chem. 393, 547-564 (2012).
  4. Lemasters, J. J. Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging. Rejuvenation Res. 8, 3-5 (2005).
  5. Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria. J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).
  6. Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).
  7. Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. Mitophagy mechanisms and role in human diseases. Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).
  8. Di Sante, G., et al. Loss of sirt1 promotes prostatic intraepithelial neoplasia, reduces mitophagy, and delays park2 translocation to mitochondria. Am J Pathol. 185, 266-279 (2015).
  9. Tanaka, A. Parkin-mediated selective mitochondrial autophagy, mitophagy: Parkin purges damaged organelles from the vital mitochondrial network. FEBS Lett. 584, 1386-1392 (2010).
  10. Shiba-Fukushima, K., et al. PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy. Sci Rep. 2, 1002(2012).
  11. Trinh, J., Farrer, M. Advances in the genetics of Parkinson disease. Nat Rev Neurol. 9, 445-454 (2013).
  12. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
  13. Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochem Biophys Res Commun. 7, 272-275 (1962).
  14. Karan, G., Yang, Z., Zhang, K. Expression of wild type and mutant ELOVL4 in cell culture: subcellular localization and cell viability. Mol Vis. 10, 248-253 (2004).
  15. Jin, S. M., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance. J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).
  16. Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. J Cell Sci. 119, 3967-3980 (2006).
  17. Edin, F., et al. 3-D gel culture and time-lapse video microscopy of the human vestibular nerve. Acta Otolaryngol. 134, 1211-1218 (2014).
  18. Ramsden, A. E., Mota, L. J., Munter, S., Shorte, S. L., Holden, D. W. The SPI-2 type III secretion system restricts motility of Salmonella-containing vacuoles. Cell Microbiol. 9, 2517-2529 (2007).
  19. Meseguer, M., et al. Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study. Fertil Steril. 98, 1481-1489 (2012).
  20. Campbell, A., et al. Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics. Reprod Biomed Online. 26, 477-485 (2013).
  21. Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510, 370-375 (2014).
  22. Carroll, R. G., Hollville, E., Martin, S. J. Parkin sensitizes toward apoptosis induced by mitochondrial depolarization through promoting degradation of Mcl-1. Cell Rep. 9, 1538-1553 (2014).
  23. Batlevi, Y., La Spada, A. R. Mitochondrial autophagy in neural function, neurodegenerative disease, neuron cell death, and aging. Neurobiol Dis. 43, 46-51 (2011).
  24. Frank, M., et al. Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner. Biochim Biophys Acta. 1823, 2297-2310 (2012).
  25. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
  26. Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophys Chem. 19, 211-225 (1984).
  27. Lemasters, J. J. Variants of mitochondrial autophagy: Types 1 and 2 mitophagy and micromitophagy (Type 3). Redox Biol. 2, 749-754 (2014).
  28. Aggarwal, B. B., Quintanilha, A. T., Cammack, R., Packer, L. Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light. Biochim Biophys Acta. 502, 367-382 (1978).
  29. Alexandratou, E., Yova, D., Handris, P., Kletsas, D., Loukas, S. Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy. Photochem Photobiol Sci. 1, 547-552 (2002).
  30. Kim, I., Lemasters, J. J. Mitophagy selectively degrades individual damaged mitochondria after photoirradiation. Antioxid Redox Signal. 14, 1919-1928 (2011).
  31. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J Cell Sci. 126, 3805-3815 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FCCP
Замедленная видеомикроскопия для оценки EYFP-Паркин агрегирование в качестве маркера для сотовых Mitophagy
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.