Методическая статья

Разработка альфа-синуклеина основе Rat модели для лечения болезни Паркинсона с помощью стереотаксической инъекции рекомбинантного аденосателлитные вирусного вектора

DOI:

10.3791/53670

⸱

28 февраля 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven, 2Division of Nuclear Medicine, Leuven University Hospital - KU Leuven, 3Laboratory for Molecular Virology and Gene Therapy, Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, KU Leuven, 4Leuven Viral Vector Core, KU Leuven

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи описывается, как вирус-вектор-опосредованная локальная доставка генов обеспечивает привлекательный способ экспрессии трансгенов в центральной нервной системе. В протоколе изложены все важнейшие шаги по выполнению инъекции вирусного вектора в черную субстанцию крысы для разработки животной модели болезни Паркинсона на основе вирусного вектора.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для изучения молекулярных путей, болезни Паркинсона (PD) и разработки новых терапевтических стратегий, научные исследователи полагаются на животных моделях. Идентификация PD-ассоциированных генов привело к разработке генетических моделей PD. Наиболее трансгенные модели α-SYN мыши развивать постепенное α-SYN патологии, но не могут отображать четкую потерю дофаминергическая клеток и допамин зависит от поведенческих проблем. Этот барьер был преодолен путем прямого нацеливания черной субстанции с вирусными векторами избыточно экспрессирующих PD-ассоциированных генов. Локальная доставка гена с использованием вирусных векторов обеспечивает привлекательный способ выразить трансгенов в центральной нервной системе. Конкретные области мозга могут быть ориентированы (например , черной субстанции), экспрессия может быть индуцирована в обстановке взрослых и высокие уровни экспрессии могут быть достигнуты. Кроме того, можно использовать различные векторные системы на основе различных вирусов. Протокол описывает все важные шаги для выполнения вирусного вектораинъекции в черной субстанции у крысы разработать вирусный вектор на основе альфа-синуклеина животной модели болезни Паркинсона.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для изучения патофизиологии PD и для разработки новых терапевтических стратегий, существует настоятельная потребность в животных моделях, которые близко напоминают невропатологии, физиологии и двигательных симптомов человека PD. Чем выше прогностическая ценность, тем лучше мы можем перевести новые методы лечения от животных моделей для пациентов.

Обнаружение альфа-синуклеина (α-SYN) в качестве первого гена парк в 1997 году привело к разработке первых генетических моделей PD. Многие трансгенные мыши сверхэкспрессией человека дикого типа (WT) или мутантного (A30P, A53T) α-SYN были получены за последнее десятилетие. Уровни α-син сверхэкспрессии оказались решающими в развитии патологии. Кроме того , штамм мыши, наличие или отсутствие эндогенного альфа-син и будет ли полная длина или укороченная форма выражается, играет определенную роль (подробный обзор Маген и Chesselet 1). Сверхэкспрессия как WT и нескольких клинических мутантов человека &# 945; -SYN у трансгенных мышей вызывает патологическое накопление альфа-син и нейронной дисфункции 2-6. Тем не менее, до сих пор наиболее трансгенные модели α-син мышь не удалось отобразить четкие потери дофаминергическая клеток и допамин-зависимых поведенческих дефицитов.

Этот барьер был преодолен путем прямого нацеливания черной субстанции (SN) с вирусными векторами избыточно экспрессирующих альфа-син. Вирусные векторы являются производными от вирусов, которые могут легко инфицировать клетки, вводят генетический материал в их геном хозяина и заставить клетки-хозяина для репликации вирусного генома с целью получения новых вирусных частиц. Вирусы могут быть сконструированы для не-тиражирование вирусных векторов, которые сохраняют свою способность проникать в клетки и ввести гены. При удалении части вирусного генома, и заменяя их генами, представляющие интерес, применение вектора приведет к одной круглой инфекции без репликации в клетке-хозяине, в целом обозначенный как '' трансдукции. Вирусные векторы сиспользоваться как для избыточной экспрессии и молчанием генов. Выраженная трансген может быть репортером белок (например , зеленый флуоресцентный белок или люциферазы светляков) 7, терапевтический белок для генной терапии приложений 8-10 или, как мы сосредоточимся в этой статье, это болезнь , связанных с белком , используемым для моделирования заболевания 11 -14.

Вирусный вектор-опосредованной доставки генов обеспечивает альтернативный способ выразить трансгенов в ЦНС с несколькими преимуществами. Использование локальной доставки трансгена, специфические области мозга могут быть направлены. Кроме того, экспрессия трансгенов может быть вызван во взрослую жизнь уменьшая риск появления компенсаторных механизмов в процессе развития. Кроме того, модели могут быть созданы в различных видов и штаммов. И, наконец, различные трансгены могут быть легко объединены. С помощью вирусных векторов, уровни экспрессии высокого трансгенные может быть достигнуто, что может иметь решающее значение, так как начало заболевания и тяжесть часто зависит от уровня Переэксression.

Было разработано несколько векторных систем, основанных на различных вирусов. Выбор векторной системы зависит от размера представляющего интерес гена, необходимого продолжительности экспрессии гена, клетки-мишени и вопросы биологической безопасности. Для получения стабильного переноса генов в головном мозге, лентивирусов (LV) и рекомбинантный адено-ассоциированный Viral (Раав) векторов в настоящее время считаются векторные системы выбора, так как они приводят к эффективному и долгосрочному экспрессии генов в мозге грызунов. Для конкретного нацеливания дофаминергических нейронов (DN) в SN, Раав векторы постепенно outcompeted векторы ЛЖ из-за их более высоких титрах и эффективности трансдукции DN.

Лучшие модели , основанные на грызунах α-SYN , доступные в настоящее время были разработаны на основе комбинированного подхода с использованием более новых AAV серотипов (Раав 1, 5, 6, 7, 8) и оптимизированы векторные конструкции, титры и чистота 15,16. Вектор титра, а также чистота вектор непосредственно влияетфенотипический результат модели. Чрезмерные векторные титры или недостаточно очищенные векторные партии могут приводить к неспецифической токсичностью. Поэтому соответствующие управляющие векторы являются обязательными. Значительные инвестиции время в вирусный вектор производства, укрупнения и процедуры очистки также доказали важное значение для получения воспроизводимых и высококачественные векторные партии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных проводятся в соответствии с директивой Европейского сообщества Совета от 24 ноября 1986 года (86/609 / EEC) и утверждено биоэтическом комитетом университета Левена (Бельгия) по.

1. Рекомбинантный AAV Получение и очистка

Примечание: вектор производства и очистки Раав проводили Левен вирусный вектор сердечника (LVVC) , как описано выше 17.

  1. В кратком изложении, субконфлюентные низкий трансфекции (<50) проход прилипшие НЕК 293T клеток с использованием 25 кД линейный полиэтиленимин 150 раствор NaCl, трансфекция нмоль и три различных плазмид в соотношении 1: 1: 1 Добавление к среде 2% фетальной телячьей сыворотки. После 24 ч инкубации при 37 ° С в 5% CO 2, замените носитель свежей DMEM , среда 2% фетальной телячьей сыворотки.
    Примечание: Плазмиды включают конструкции для серотипа AAV7, передача ААВ плазмидой, кодирующей человеческий A53T мутант α-син под контролем CMVie усиливается SYNAPSin1 промотор и pAdvDeltaF6 аденовирусная плазмиды - хелпера 17.
  2. Заготавливают среда через 5 дней после кратковременной трансфекции и концентрируют с помощью фильтрации 17 с тангенциальным потоком.
  3. Очищают векторных частиц Раав из концентрированной среды с использованием Иодиксанол ступенчатый градиент 17.
  4. Использование стандартных методов ПЦР в реальном времени для определения геномных копий (GC). В этом протоколе, вектора титром 3,0 E11 GC / мл использовали для разработки модели крысы на основе α-SYN для PD 17.

2. стереотаксической инъекции Раав альфа-SYN Вектор в SN Крысы (Рисунок 2)

  1. Дом восемь недель самок крыс линии Вистар весом 200-250 г при нормальном 12 ч цикле свет / темнота со свободным доступом к гранулированной пище и водопроводной воде.
  2. Submit крысе внутрибрюшинного (IP) анестезия, содержащий смесь кетамина (60 мг / кг) и медетомидин (0,4 мг / кг). После того, как крыса под наркозом и не реагируеткогда сдавливая различные лапами, администрировать микро-транспондера подкожно на спине крысы для дальнейшего распознавания с помощью микро-транспондера имплантер. Проверьте, если микро-транспондера правильно установлен и может быть считан считывающим устройством.
  3. Вырезать волосы на верхней части головы. Нанесите местный анестетик как на кожу головы и ушей. Выполните остальную часть хирургической процедуры в соответствии с ламинарным потоком с использованием асептических методов.
  4. Поместите крыс в стереотаксической рамы головки, используя два уха бара, рот и нос бар. Накройте тело крысы с бумажным одеялом, чтобы избежать снижения температуры тела. Нанести глазную смазку, чтобы предотвратить глаз от высыхания.
  5. Лечить кожи головы с jodium 1% в изопропаноле 70% и сделайте небольшой надрез по средней линии головы. Аккуратно соскрести мембраны на черепе и промыть физиологическим раствором. Пусть череп высохнуть в течение нескольких минут. Соблюдайте черепных швов и две опорные точки: темени и лямбда.
  6. Для того, чтобы впрыснуть Раав вектор в SN, определяют координаты в направлении брегмы (переднезаднем: 5,3 мм; медиолатеральной: 2,0 мм и дорсовентральный: 7.2 мм, рассчитанные из ТМО).
    Примечание: Трехмерные координаты для каждой интересующей области можно вычислить с помощью стереотаксической атлас мозга крысы, применяя брегма в качестве анатомической точки отсчета.
  7. Заполните 10 мкл микроинъекции шприц (30 калибр 20 мм) с Раав вектором и поместить его в стереотаксической инструмент, связанный с моторизованным микроинъекции насосом. Регулировка громкости, выпуская каплю вектора и устранить в поливалентной моющего средства рН 9 (например , RBS).
  8. Визуально проверьте, если головка крепится прямо в раме головки и оценить лево-правой оси. Тщательно визуально определить переднезадней и медиолатеральной координаты брегмы и Lambda и измерить их высоту с помощью иглы 30 мм калибра 20 в дорсовентральной руку стереотаксической рамы.
    1. Разрешить утраaximum разница 0,3 мм в высоте между брегмы и Lambda. Поместите иглу обратно на брегмы и применять переднезаднем и медиолатеральной координаты, перемещая переднезаднем и медиолатеральной руку стереотаксической рамы.
  9. На месте инъекции, измеряют высоту черепа и убедитесь, что она не отличается более чем на 0,3 мм от высоты брегмы. Просверлите отверстие в черепе диаметром около 2 мм. Измерьте высоту Дура, это будет служить ориентиром для применения дорсовентральной координат. В качестве альтернативы вычитать фиксированную толщину для черепа (0,9 мм).
  10. Проникнуть твердую мозговую оболочку с использованием 26 иглы калибра и поглощать кровь с стерильной салфеткой. Подождите, пока все кровотечение не остановилось, прежде чем продолжить.
  11. Медленно вставьте 10 мкл микроинъекции шприц предварительно загруженным с вектором раствора в мозг к заранее определенной глубины (дорсовентральный координат). Подождите 1 мин с иглой в месте. Вводят 3 мклвекторного раствора (3,0 E11 геномных копий / мл (средний вектор доза) или 1,0 Е12 GC / мл (высокий вектор доза) rAAV2 / 7 & alpha; SYN или EGFP управления вектором) с использованием моторизованных микроинъекции насос с пропускной способностью 0,25 мкл / минимум
  12. После инъекции держать иглу на месте в течение еще 5 мин, а затем медленно удалить его. Вышивание кожу головы при помощи покрытого плетеного полиэфира 3.0, дезинфицируют 1% jodium в 70% изопропилового спирта и осторожно удалить животное от стереотаксической инструмента. Сначала ослабьте бар нос и рот, а затем два уха бара.
  13. Для обратного анестезии, инъекции крысе внутрибрюшинно 0,5 мг / кг атипамезола и помещают крысу в чистую клетку на нагревательной пластине 38 ° С, пока он не просыпается. Накройте крыса с бумажным одеялом, чтобы предотвратить падение температуры тела.
  14. Обеспечить легкий доступ к пище и воде в течение первых часов. Монитор крысы в ​​течение первых нескольких дней. При необходимости применять обезболивание.
    Примечание: Там нет необходимости удалять стежки из тон череп. Через 1-2 недели череп полностью отремонтированы и stiches отсоединился.

3. Оценка rAAV2 / 7 α-SYN Введенные Крысы с использованием неинвазивных ПЭТ, поведенческие тесты и иммуногистохимического анализа

  1. Для того, чтобы следить за кинетики нигростриатальных дофаминергической нейродегенеративные неинвазивным с течением времени в отдельных животных, количественно переносчика дофамина (DAT) связывания с использованием малых животных позитронно - эмиссионной томографии (ПЭТ) и трассирующими ПДР Transporter , например , [18 F] -FECT 16 ,
  2. Чтобы проверить, является ли достаточным уровень дофаминергической нейродегенерации, чтобы побудить двигательных нарушений у крыс, крыс подвергают испытанию цилиндра для оценки спонтанного использования передних конечностей.
    1. Поместите крысу в 20 см шириной ясно стеклянный цилиндр и видеокассета поведение во время вертикальных движений вдоль стены и посадки после тыла. Оценка количества контактов, сделанных каждой лапой в общей сложности 20контакты. Для получения подробного описания критериев подсчета очков см Schallert и др. 18 Экспресс количество обесцененных передних конечностей контактов (например , левая передняя лапа) в процентах от общего числа контактов (передних конечностей левый плюс правый лапой).
      Примечание: Не имеет поражений у контрольных крыс с использованием обеих лап в равной степени должны набрать около 50% в этом испытании.
  3. Выполните иммуногистохимического (IHC) анализа для оценки уровня экспрессии трансгена и потери дофаминергическая клеток.
    1. На разных конце стадии, жертвуют крыс с передозировкой пентобарбитала натрия (60 мг / кг, внутрибрюшинно) и выполнить внутрисердечной перфузию с холодным физиологическим раствором с последующей обработкой 4% параформальдегида в PBS 19. Сосредоточение мозг в течение ночи при температуре 4 ° С и разрезают толщиной 50 мкм Коронарные срезы мозга с помощью вибрирующий микротом.
    2. Выполнение IHC окрашивания на свободно плавающих участках с использованием антител против альфа-син и тирозингидроксилазе анализировать уровни экспрессии α-син и ЛеVel нейродегенерации 16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общая схема эксперимента изображена на рисунке 1

Раав 2/7-опосредованной избыточная экспрессия A53T альфа-SYN индуцирует допамина-зависимого дефициты двигателя.
Чтобы проверить , является ли достаточным , чтобы вызвать двигательные нарушения у крыс уровень α-SYN оверэкспрессии, мы подвергли крыс испытанию цилиндра для оценки спонтанного использования передних конечностей (рис 3А)....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Есть несколько важных шагов в рамках протокола. Вектор титра, а также чистота вектор непосредственно влияет на фенотипическое исход модели. Чрезмерные векторные титры или недостаточно очищенные векторные партии могут приводить к неспецифической токсичностью. Таким образом, использование высококачественных векторных партий и соответствующих контрольных векторов является необходимым условием. Кроме того, точное позиционирование головы крысы в ​​стереотаксической рамы и точное определение координат имеет важное значение дл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что не существует никакого фактического или потенциального конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Йорис Ван Asselberghs и Энн Ван Santvoort за отличную техническую помощь. Исследование финансировалось ИВТ-Vlaanderen (ИВТ SBO / 80020), в FWO Фландрии (G.0768.10), программой EC-FP6 'Dimi' (LSHB-CT-2005-512146), проект MEFOPA FP7 RTD (Health -2009-241791), программа FP7 "InMind" (ЗДОРОВЬЕ-F2-2011-278850), Ку-Лёвен (IOF-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, IMIR PF / 10/017), а также MJFox Foundation (Целевая проверка 2010). А. Ван дер Перрен и С. Casteels являются постдокторской фламандского фонда научно-исследовательских работ. К. Ван Laere является старшим клинический сотрудник фламандского фонда научных исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Самки 8-недельных крыс WistarJanvier/200-250 г
Кетамин (Nimatek)Eurovet animal health804132
Медетомидин (Dormitor)Orion-Pharma/ Janssen Animal Health1070-499
  Местный анестетик для кожи головы и ушей: Xylocaï 2% гельAstrazeneca0137-547
ТеррамицинPfizer0132-472
Bupré norphine (Vetergesic)Ecuphar2623-627
Jodium 1% изопропанолVWR0484-0100
стереотаксическая головная рамаStoeling/
Hamilton Шприц (30 калибр -20 мм -pst 2)Hamilton/Filter Service7803-07
атипамезол (антиседан)Orion-Pharma/Elanco1300-185
rAAV A53T & альфа;-SYN векторLVVC, KU Leuven/https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/
pentobarbital (Nembutal)Ceva Santé0059-444
микротомMicromHM650
кроличий поликлональный синуклеин AbChemicon50381:5,000
кролик поликлональный TH AbChemicon1521:1,000
оксиортосиликат лютеция на основе детектора FOCUS 220томограф Siemens/ Concorde Microsystems/
радиолиганд: 18F-FECTВнутри дома/
L-допа: Prolopa 125Roche6 мг/кг в/ч.
DMEM, GlutamaxLife TechnologiesN° 31331-093
Фетальная бычья сывороткаLife TechnologiesN° 10270-106
25 kD линейный полиэтиленимин (PEI)Polysciences/
OptiPrep Градиентная среда для плотности: IodixanolSigmaD1556-250ML
OptimenLife TechnologiesN° 51985-026
Paxinos 1 watston steretactic atlas, четвертое изданиеElsevier/
sodium

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Magen, I., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of Parkinson's disease The state of the art. Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).
  2. Masliah, E., et al. Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders. Science. 287, 1265-1269 (2000).
  3. Freichel, C., et al. Age-dependent cognitive decline and amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice. Neurobiol Aging. 28, 1421-1435 (2007).
  4. Fleming, S. M., Fernagut, P. O., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and limitations. NeuroRx. 2, 495-503 (2005).
  5. Kahle, P. J., et al. Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model. Am J Pathol. 159, 2215-2225 (2001).
  6. Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson's disease in mice. Lancet Neurol. 10, 1108-1118 (2011).
  7. Deroose, C. M., Reumers, V., Debyser, Z., Baekelandt, V. Seeing genes at work in the living brain with non-invasive molecular imaging. Curr Gene Ther. 9, 212-238 (2009).
  8. Manfredsson, F. P., et al. rAAV-mediated nigral human parkin over-expression partially ameliorates motor deficits via enhanced dopamine neurotransmission in a rat model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 207, 289-301 (2007).
  9. Vercammen, L., et al. Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson's disease. Mol Ther. 14, 716-723 (2006).
  10. Winklhofer, K. F. The parkin protein as a therapeutic target in Parkinson's disease. Expert opinion on therapeutic targets. 11, 1543-1552 (2007).
  11. Kirik, D., et al. Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system. J Neurosci. 22, 2780-2791 (2002).
  12. Kirik, D., et al. Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2884-2889 (2003).
  13. Lauwers, E., et al. Neuropathology and neurodegeneration in rodent brain induced by lentiviral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein. Brain pathology. 13, 364-372 (2003).
  14. Klein, R. L., King, M. A., Hamby, M. E., Meyer, E. M. Dopaminergic cell loss induced by human A30P alpha-synuclein gene transfer to the rat substantia nigra. Hum Gene Ther. 13, 605-612 (2002).
  15. Vander Perren, A., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Viral Vector-Based Models of Parkinson's Disease. Curr Top Beh Neurosci. , (2014).
  16. Van der Perren, A., et al. Longitudinal follow-up and characterization of a robust rat model for Parkinson's disease based on overexpression of alpha-synuclein with adeno-associated viral vectors. Neurobiol Aging. , (2014).
  17. Van der Perren, A., et al. Efficient and stable transduction of dopaminergic neurons in rat substantia nigra by rAAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/6.2, 2/7, 2/8 and 2/9. Gene Ther. , (2011).
  18. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
  19. Soueid, J., Nokkari, A., Makoukji, J. Techniques and Methods of Animal Brain Surgery: Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. , (2015).
  20. Dale, G. E., et al. Relationships between Lewy bodies and pale bodies in Parkinson's disease. Acta Neuropathol. 83, 525-529 (1992).
  21. Dawson, V. L. Neurobiology of flies and mice. Science. 288, 631-632 (2000).
  22. Dawson, T., Mandir, A., Lee, M. Animal models of PD: pieces of the same puzzle? Neuron. 35, 219-222 (2002).
  23. LeVine, H. 3rd Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T. Methods Enzymol. 309, 274-284 (1999).
  24. Oliveras-Salva, M., et al. rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration. Mol Neurodegener. 8, (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

AAV

Похожие статьи