Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Визуализация Серотонинергической волокон в спинном мозге мышей Использование Четкость / КУБИЧЕСКИЙ Техника

10.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53673

⸱

26 февраля 2016 г.

 ,  , 
1Brain Structure and Function Group, Neuroscience Research Australia, 2School of Medical Sciences, The University of New South Wales

В этой статье

Краткое содержание

Супраспинальные проекции важны для восприятия боли и других форм поведения, и серотонинергические волокна являются одной из таких волоконных систем. Настоящее исследование было сосредоточено на применении комбинированного протокола CLARITY/CUBIC к спинному мозгу мыши с целью изучения окончания этих серотонинергических волокон.

Аннотация

Длинные нисходящих волокон к спинному мозгу необходимы для передвижения, восприятия боли, а также другие виды поведения. Схема заделки оптоволокна в спинном мозге большинства этих волоконных систем не были тщательно исследованы в любых видов. Серотонинергической волокна, которые выступают в спинной мозг, были изучены у крыс и опоссумов на гистологических срезов и их функциональное значение было выведено на основе их рисунка заделки оптоволокна в спинном мозге. С развитием четкостью и КУБИЧЕСКИХ методов, можно исследовать эту систему волокна и его распределение в спинном мозге, который, вероятно, выявить ранее неизвестные особенности серотонинергической супраспинальных путей. Здесь мы приводим подробный протокол для визуализации серотонинергической волокон в спинном мозге мыши с использованием комбинированного ЯСНОСТИ и кубические техники. Способ включает перфузию мыши с раствором гидрогеля и осветления ткани с Комбенвания очистки реагентов. Ткани спинного мозга был очищен в чуть менее двух недель, и последующее окрашивание иммунофлуоресцентного против серотонина было завершено менее чем за десять дней. С многофотонном флуоресцентного микроскопа, ткань была отсканирована и 3D-изображение было реконструировано с помощью программного обеспечения OsiriX.

Введение

Надспинальные проекции отвечают за модуляцию разнообразного поведения, такого как восприятие боли. Одна из проекций, несущих ноцицептивную информацию, содержит серотонинергические волокна, которые берут начало от рафе заднего мозга и прилегающих ретикулярных ядер1,2. Физиологические и фармакологические исследования продемонстрировали повышенный выброс серотонина в дорсальном роге спинного мозга после электростимуляции ядер рафе в заднем мозге3-5. У крысы и опоссума серотонинергические рафеспинальные волокна имеют плотные окончания не только в спинном роге6-8, но и в промежуточной зоне7,9,10, вентральном роге7,11 и даже пластинке 1012,13. Подобных исследований на мышах нет. Целью настоящего исследования было картирование паттерна терминации серотонинергических волокон, возникающих из ядер заднего мозга и прилегающих к ним ретикулярных ядер в спинном мозге мыши, с использованием недавно опубликованного метода CLARITY14 и его модификации - CUBIC15.

Обычная флуоресцентная или пероксидазная иммуногистохимия спинного мозга ясно показывает распределение серотонинергических волокон в сером веществе спинного мозга в поперечных срезах толщиной 30-40 мкм. Тем не менее, этот подход не показывает непрерывность серотонинергических волоконных трактов в белом веществе и их коллатералей в сером веществе. Несмотря на то, что 3D-реконструкция гистологических срезов расширила наши знания о волокнистых трактах, для гистологов и анатомов остается проблемой следить за одним трактом из-за небольших искажений в ткани, вызванных разрезами. Чтобы обойти это препятствие, ряд исследователей разработали различные протоколы, позволяющие сделать всю структуру ткани прозрачной, а также собрать изображение неизмененной ткани в одном видеофайле17-21. На сегодняшний день наиболее успешными являются прозрачный, липид-обменный, гибридизированный акриламидом жесткий, совместимый с визуализацией и иммуноокрашиванием, тканевый гидрогелевый метод (CLARITY), разработанный группойDeisseroth 14,15, а также CUBIC, разработанный Susaki et al16. С момента публикации протоколов многие исследователи начали использовать эти методы для изучения различных аспектов биологических тканей, включая не только мозг22-25, но и сердце, почки, кишечник и легкие26,27.

Путем фиксации спинного мозга мыши с помощью раствора гидрогеля (CLARITY) и очистки с помощью реагентов CUBIC (что является гораздо более быстрым методом, чем тот, который описан в оригинальном протоколе CLARITY14,15), блок ткани спинного мозга длиной 2-3 мм был очищен в течение двух недель, а иммунофлуоресцентное окрашивание на серотонин было завершено за восемь дней. С помощью всего лишь комбинации химических агентов обычная иммуногистохимия может быть использована для создания изображения отдельных волоконных трактов в 3D-видеофайле примерно за один месяц.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этика Заявление: Все процедуры, связанные с предметов животного происхождения следуйте рекомендациям по уходу и комитетом по этике животных (ACEC) в Университете Нового Южного Уэльса (утвержденный номер ACEC на 14 / 94А).

1. Приготовление прозрачного спинного мозга мыши

  1. Получение Ice Cold гидрогеля Solution
    1. Приготовление 16% раствора параформальдегида (PFA)
      1. Добавьте 16 г параформальдегида порошка в 70 мл предварительно подогретой дистиллированной воды (50-55 ° С) и перемешивают на магнитной мешалке с подогревом до параформальдегида не растворится. Примечание: Не допускайте раствор нагреть более 55 ° C и знать, что параформальдегид является токсичным.
      2. Переносят раствор параформальдегида в цилиндр и добавляют дистиллированную воду до 100 мл. Охлаждают раствор параформальдегида, используя 4 ° C холодильник.
    2. Растворите 125 мг VA-044 инициатора в 26,25 мл дистиллированной воды и охлаждают раствор в 4° C холодильник.
    3. Прохладный 5 мл раствора акриламида (40%), 1,25 мл раствора бис (2%) (ВНИМАНИЕ: Бис и акриламид растворы являются токсичными, могут вызывать генетические дефекты или рак), 5 мл 10х PBS, 12,5 мл 16% -ного раствора PFA, и тому раствор инициатора ВА-044 на льду.
    4. Смешайте вышеуказанные решения на льду.
      Примечание: общий объем составляет 50 мл.
  2. Кровоснабжение и Коллекция шнура мыши Spinal
    1. Анестезировать мышь с внутрибрюшинного введения кетамина (80 мг / кг) и xyzaline (5 мг / кг), разведенного в 0,9% физиологического раствора. Дозировка для мыши может быть ниже, чем у крыс.
    2. На подходящей пластиковой поверхности в вытяжном шкафу, фиксируют конечности мыши далеко от тела (клейкая лента эффективна), как только мышь не реагирует на крайнем случае к его коже стопы.
    3. Разрежьте кожу мыши на груди, а затем кости грудной клетки, чтобы разоблачить сердце с ножницами.
    4. С помощью перистальтического насоса, с 25 G игла прилагается к йе конец трубки, вставьте иглу в левый желудочек сердца, надрез в правое предсердие, чтобы создать точку выхода для крови, а затем начать промывку с 40 мл 0,9% физиологического раствора со скоростью примерно 10 мл / мин.
    5. После завершения заливать мышь с 35 мл ледяного раствора холодной гидрогеля.
      Примечание: обрызгивать со скоростью 10 мл / мин, чтобы избежать отека нервной ткани.
    6. Надрезать кожу на спину с лезвием, а затем удалить мышцы рядом с позвоночным. После разрезания позвоночные дуги на одной стороне и листать их на другую сторону, возьмите спинной мозг из позвоночного столба с тонкой ножницами.
  3. Очистка шнура мыши Spinal
    1. Поместите спинного мозга в 15 мл гидрогеля раствора в течение ночи при температуре 4 ° С.
    2. Удалить 10 мл раствора гидрогеля и вылить остальную часть раствора с сегментов спинного мозга в 5 мл пробирку. Заполните 5 мл пробирку с раствором гидрогеля, пока не будет полностью заполнен,
    3. Stretch небольшой кусочек парафином над верхней части 5 мл пробирку, а затем обернуть парафильмом вокруг шеи трубки. Примечание: Убедитесь, что парафильмом контактов решение гидрогеля и нет никаких пузырей между раствором гидрогеля и парафином.
    4. Поместите 5 мл трубку в 37   ° C печи в течение ночи. Обратите внимание на решение гидрогеля, пока она не станет гель.
    5. Возьмем 5 мл трубку из печи и удалите гель из трубки с помощью гаечного ключа (например, вливаются 1 мл пипетки). Удалите гель из ткани спинного мозга путем наклеивания грубой ткани в гель, а затем взять грубую ткань прочь (гель будет прилипать к ткани и, следовательно, будут удалены ткани).
    6. После удаления геля из ткани спинного мозга, моют спинного мозга 4 раза с помощью 1x PBS (рН 7,4) в течение 24 часов на шейкере.
    7. Готовят Кубическую клиринговую раствор путем растворения 3,85 г мочевины и 3,85 г N, N, N ', N'-тетракис (2-гидроксипропил) ethylenediamине в 5,38 мл дистиллированной воды.
      Примечание: используется горячий мешалка. Добавить 2,31 г Полиэтиленгликоль моно-п-isooctylphenyl эфир / тритона Х-100 к раствору сразу понятно и остывает до комнатной температуры.
      Примечание: 10 г этих трех химических веществ для одной мыши.
    8. Вырезать спинного мозга мыши коронковой на 2-3 мм длиной сегментов с лезвием бритвы и поместить их в 5 мл указанного выше раствора КУБИЧНОЙ клирингового. Место на шейкере в духовке при температуре 37   ° C в течение 3-х дней.
    9. Через три дня, изменить клиринговую решение свежую. Примечание: Вышеуказанный раствор готовят непосредственно перед использованием.
    10. Два-три дня спустя после того, как освежающий кубическая клиринговую решение, проверить прозрачность ткани против бумаги с шрифтом 8 букв. Если он прозрачен, то буквы можно увидеть через очищенную ткани. Удалите клиринговую раствор и добавляют 4 мл PBST (0,1% Triton-X100), чтобы вымыть ткани 4 раза в день (каждые 6 часов).

2. иммунофлуоресценции Окрашивание

  1. Инкубируйте сегментов спинного мозга в растворе первичного антитела (анти-серотонин, поднятый в кролика, разведенной 1: 100 в PBST) в течение 3-х дней на вибраторе в 37 ° C духовке.
  2. Удалите раствор антитела и добавляют 4 мл PBST (0,1% Тритон-Х100) для мойки сегментов спинного мозга 4 раза в день (каждые 6 ч) в 37 ° C духовке.
  3. Удалить решение PBST и добавить вторичное раствор антитела (594 конъюгированный козий анти-кроличий IgG, разведенного 1: 100 в PBST), чтобы инкубировать ткани в течение 3-х дней на вибраторе в 37 ° C духовке.
  4. Удалите раствор вторичного антитела и добавляют 4 мл PBST, чтобы вымыть сегментов спинного мозга 4 раза в день (каждые 6 часов) на шейкере в 37 ° C духовке. На следующий день ткань готова к визуализации.

3. обработки изображений

  1. Удалите раствор PBST и добавляют 4 мл 85% глицерина, чтобы сделать показатель преломления ткани даже.
  2. Проверьте чистоту ткани. После того, как ясно примерно 1 ч, положить ткань на большую, тонкую стеклянную пластинку, которая соответствует крепежной рамки мульти-фото флуоресцентного микроскопа.
  3. Положите несколько капель 85% глицерина рядом с ткани спинного мозга и покровное его с покровным стеклом 22 х 50 мм 2.
    Примечание: Ориентация спинного мозга решает, как выглядит изображение.
  4. Поместите предметное стекло на крепежной рамки формирующего многофотонном флуоресцентного микроскопа и перемещения ткани, в световом пути.
  5. Выберите Гелий-неоновый лазер линии 594 нм и регулировать интенсивность лазера до оптимального уровня, проверяя яркость положительного сигнала на изображении.
  6. Выберите область сканирования из ткани спинного мозга с использованием цели 20X (в воде, Н. А. 0,7) и подготовить для создания Z-стека, а глубина каждого шага устанавливается равным 3 мкм.
  7. Сканирование ткань от верхней части к нижней части Z-стека под объективистские 20Хный, а затем цель 63X (в масле, Н. А. 1.4) (размер шага был 1 мкм), соответственно. Реконструировать 3D - видео с использованием 3D программного обеспечения 28.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом разделе показаны результаты окрашивания серотонин антител в прозрачной мыши спинного мозга с использованием комбинации Четкость и кубические протоколов. Показано , что серотонинергические волокна присутствуют во всех пластинках спинного мозга с преобладанием в вентральной части вентральной рога (рис 1, а также смотрите видео 1). Контрольной ткани не имеют положительных волокон (результат не показан). В вентральном роге, плотно упакованные серотони...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол, описанный показывает, как изображение серотонинергических волокон в спинном мозге мыши с комбинированным четкостью и КУБИЧЕСКИХ техники. Он вводит более быстрый процесс клиринга по сравнению с пассивным протоколом клиринга , разработанного Cheung и др. 14 и Томер и др. 15 и позволяет ткани спинного мозга , чтобы быть хорошо поддерживается гидрогеля в процессе очистки.

Важным шагом в процессе фиксации спинного мозга мыши, как сообщает Cheung и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Центром передового опыта Австралийского исследовательского совета по интегративной функции мозга (ARC Centre Grant CE140100007), грантом проекта NHMRC (#1086643). Профессор Джордж Паксинос получил грант старшего научного сотрудника NHMRC (#1043626).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фотоинициатор VA044Wakova-044/225-02111http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
40% раствор акриламидаBio Rad161-0140http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
2% раствор Bis BioRad161-0142http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31-
879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
параформальдегидSigma158127http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU
мочевинойMerck Millipore66612http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N',N'-tetrakis (2-гидроксипропил) этилендиаминMerck Millipore821940http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100Merck Millipore648462http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
сахарозыSigmaS0389http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU
серотониновое антителоMerck MilliporeAB938http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
козье антитело против кролика IgG (H+L) вторичное антитело, Alexa Fluor® 594 конъюгатLife Technologies  A-11012https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
многофотонный микроскопLeicaLeica TCS SP5 MP STEDhttp://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/

Ссылки

  1. Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways. J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).
  2. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Struct Funct. 215 (3-4), 159-186 (2011).
  3. Sorkin, L. S., McAdoo, D. J., Willis, W. D. Raphe magnus stimulation-induced anti-nociception in the cat is associated with release of amino acids as well as serotonin in the lumbar dorsal horn. Brain Res. 618 (1), 95-108 (1993).
  4. Rivot, J. P., Chiang, C. Y., Besson, J. M. Increase of serotonin metabolism within the dorsal horn of the spinal cord during nucleus raphe magnus stimulation, as revealed by in vivo electrochemical detection. Brain Res. 238 (1), 117-126 (1982).
  5. Hentall, I. D., Pinzon, A., Noga, B. R. Spatial and temporal patterns of serotonin release in the rat's lumbar spinal cord following electrical stimulation of the nucleus raphe magnus. Neuroscience. 142 (3), 893-903 (2006).
  6. Bullitt, E., Light, A. R. Intraspinal course of descending serotoninergic pathways innervating the rodent dorsal horn and lamina X. J Comp Neurol. 286 (2), 231-242 (1989).
  7. Jones, S. L., Light, A. R. Termination patterns of serotoninergic medullary raphespinal fibers in the rat lumbar spinal cord: an anterograde immunohistochemical study. J Comp Neurol. 297 (2), 267-282 (1990).
  8. Marlier, L., Sandillon, F., Poulat, P., Rajaofetra, N., Geffard, M., Privat, A. Serotonergic innervation of the dorsal horn of rat spinal cord: light and electron microscopic immunocytochemical study. J Neurocytol. 20 (4), 310-322 (1991).
  9. Morrison, S. F., Gebber, G. L. Axonal branching patterns and funicular trajectories of raphespinal sympathoinhibitory neurons. J Neurophysiol. 53 (3), 759-772 (1985).
  10. Barman, S. M., Gebber, G. L. The axons of raphespinal sympathoinhibitory neurons branch in the cervical spinal cord. Brain Res. 441 (1-2), 371-376 (1988).
  11. Martin, G. F., Cabana, T., Ditirro, F. J., Ho, R. H., Humbertson, A. O. Jr Raphespinal projections in the North American opossum: evidence for connectional heterogeneity. J Comp Neurol. 208 (1), 67-84 (1982).
  12. Bowker, R. M., Westlund, K. N., Coulter, J. D. Origins of serotonergic projections to the lumbar spinal cord in the monkey using a combined retrograde transport and immunocytochemical technique. Brain Res Bull. 9 (1-6), 271-278 (1982).
  13. Watkins, L. R., Griffin, G., Leichnetz, G. R., Mayer, D. J. Identification and somatotopic organization of nuclei projecting via the dorsolateral funiculus in rats: a retrograde tracing study using HRP slow-release gels. Brain Res. 223 (2), 237-255 (1981).
  14. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  15. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  16. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  17. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  18. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  19. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  20. Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  21. Ertürk, A., Bradke, F. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO). Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).
  22. Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends Cogn Sci. 17 (12), 596-599 (2013).
  23. Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. NeuroImage. 101, 625-632 (2014).
  24. Ando, K., et al. Inside Alzheimer brain with CLARITY: senile plaques, neurofibrillary tangles and axons in 3-D. Acta Neuropathol. 128 (3), 457-459 (2014).
  25. Zhang, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
  26. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 781(2015).
  27. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  28. Rosset, A., Spadola, L., Ratib, O. OsiriX: an open-source software for navigating in multidimensional DICOM images. J Digit Imaging. 17, 205-216 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CLARITY
Визуализация Серотонинергической волокон в спинном мозге мышей Использование Четкость / КУБИЧЕСКИЙ Техника
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.