Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение CD 90+ фибробластов / Миофибробласты от человека замороженные желудочно-кишечного тракта образцов

9.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53691

⸱

31 января 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Surgery, University of Texas Medical Branch, 2Internal Medicine, University of Texas Medical Branch, 3Molecular Genetics and Microbiology, University of New Mexico

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен протокол выделения и создания первичных культур фибробластов/миофибробластов (МФ) из замороженных желудочных, небольших кишечных и толстых тканей клеток с фенотипом MF. Эти клетки экспрессируют CD90, α-SMA и виментин. МФ могут использоваться для различных функциональных анализов, включая ферментативную активность и выработку цитокинов.

Аннотация

Фибробласты / миофибробласты (МФС) были набирает все большее внимание на их роли в патогенезе и их вклад в обоих заживления ран и продвижения микросреды опухоли. В то время как в настоящее время существует много методов для выделения МП от желудочно-кишечных (GI) тканей, этот протокол вводит новый элемент изоляции этих стромальных клеток из замороженной ткани. Замораживание И. образцов тканей не только позволяет исследователю получить образцы из мира сотрудников, биобанках и коммерческих поставщиков, это также позволяет задержки обработки свежих образцов. Описанный протокол будет последовательно дают характерные веретенообразные клетки с фенотипом MF, которые выражают маркеры CD90, α-SMA и Виментин. Поскольку эти клетки получают из клинических образцов, использование первичных клеток также дает преимущество в тесном имитирующих МЖ от болезненных состояний, а именно рака и воспалительных заболеваний кишечника. Этот метод имеет пчелап утверждена в желудка, тонкой кишки, толстой и MF поколения основной культуры. Первичные культуры MF могут быть использованы в широкий спектр экспериментов в течение нескольких прохода и их чистота оценена как иммуногистохимии и проточной цитометрии анализа.

Введение

Миофибробласты / фибробласты (МЖ) представляют собой обильные популяции клеток в желудочно-кишечном (GI) слизистой оболочки. Эти клетки стромы расположены непосредственно под эпителием и образуют взаимосвязанную сеть в собственной пластинке слизистой оболочки в кишечнике. МЖ не отвечает только за осаждения внеклеточного матрикса, а через паракринной регулирования могут влиять на транспорт электролита, реституции, и барьерную функцию прилегающей эпителия 1, 2. Кроме того, МЖ, как было показано, играют ключевую роль в воспалении и ткани реконструкции 3, 4. Миофибробласты являются важной частью микросреды опухоли, где они также известный как рак, связанный фибробластов, и способствовать росту опухолевых клеток и служить нишей для раковых стволовых клеток 3. Новые данные свидетельствуют о том, что МЖ может также служить в качестве местных антиген-представляющих клеток. Кроме того, функция МЖ, как важные регуляторы врожденной и адаптивной иммунных реакций, произвоCing различные цитокины и факторы роста 5.

У здоровых лиц, MFS клетки, как полагают, отличить от мезенхимальных стволовых клеток и выразить их клеточной поверхности, мезенхимной маркера, CD90 3, 5. Эти клетки также положительно для виментина, но отрицательный для эпителиальных и гемопоэтических маркера клеток, ЕрСАМ и CD45 соответственно. Миофибробласты предложены, чтобы быть активированной формы фибробластов и можно отличить от неактивированных фибробластов по экспрессии a-SMA 5.

За последние десять лет, множественные подходы к изоляции миофибробластов из слизистой оболочки толстой кишки человека были опубликованы в основном-на основе метода, впервые описанной Mahida др. 5-8. Хотя отдельные исследования сообщают процедуры изоляции из различных слизистой кишечника, не универсальный протокол для изоляции МЖ из нескольких областей желудочно-кишечного тракта (например, желудка, малого и лАРГЕ слизистая оболочка кишечника) была опубликована. Протокол, представленные здесь, была испытана и успешно использован для всех трех типов ткани, упомянутых выше. , Кроме того, не сообщалось процедуры выделения МЖ из замороженных слизистой оболочки ЖКТ.

Здесь мы представляем оптимизированную метод, который основан на ферментативной пищеварения и одновременно позволяет для выделения человеческого слизистой кишечника МЖ для культуры и проточной цитометрии анализа свежих переваривается, одноклеточных, слизистых препаратов. Этот метод дает надежно первичных культур с фенотипа MF. Кроме того, одни и те же методы могут быть использованы для выделения МЖ из замороженных образцов желудочного и тонкого кишечника, а также тканей. Выделение миофибробластами из свежих GI ткани было описано ранее; Однако, использование замороженные образцы представляет множество преимуществ. А именно, исследователи смогут собирать и хранить ткани из любого количества сотрудников по всему миру, которые имеют capabiмируемости грузить образцы замороженной ткани. Кроме того, исследователи могут найти коллекцию отбрасываются ткани от операционной и / или эндоскопического кабинета и немедленной обработки ткани для изоляции к конфликту с их нынешним графиком экспериментов. Кроме того, из-за непредсказуемого характера операции, закупки ткани может произойти в самом конце дня, который будет ограничивать время, оставшееся для обработки ткани. Замораживание ткани для последующей обработки будет улучшить эти проблемы.

Наконец, эти методы были успешно использованы в изоляции толстой, желудка и тонкого кишечника миофибробластами в болезненных состояний, таких как карциномы и колоректального воспалительных заболеваний кишечника.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол для получения отбрасываются человеческую ткань из хирургических больных и создание первичных культурах был утвержден в университете Техаса медицинского отделения и Университет Нью-Мексико институциональный обзор советов. Общие требования к закупке образцов тканей человека описано ниже. Отметим, что поскольку МЖ могут быть выделены из замороженной ткани, биобанках и коммерческих поставщиков также жизнеспособные варианты.

1. Получить тканей человека

  1. Разместить протокол для получения человеческого ткани толстой кишки в институциональной наблюдательный совет для утверждения.
  2. Установление сотрудничества с общими хирургами и / или колоректальных хирургов, чтобы получить человеческую ткань для исследования. Сотрудничество с отделом патологии также является обязательным, как они будут определении ткань, которая не требуется для диагностики и может быть предназначенный для исследования.
  3. Посоветуйте патологоанатом, чтобы обеспечить ткани из опухоли, а затем grosslу нормальной слизистой, по крайней мере в 5 см от опухоли. Сразу поместите образцы в ледяной мыть массовой информации и разместить на льду. Патологоанатом будет определять количество ткани, которые можно безопасно данной для исследований. Минимальный ткани требуется для изоляции MF 1,5 мм 2.
  4. Использование полученной ткани или непосредственно установить первичных культур или заморозить и место при -80 ° С для последующего выделения.
    1. Если замораживание для последующего выделения, вырезать ткань в приблизительно 1 - 2 мм 2 части, поместить в криогенной трубки с 1 мл замораживания средств массовой информации (см ниже), и хранить при температуре -80 ° C. Примечание: Используя этот протокол, успешное выделение МЖ из ткани, замороженные более 4 лет наблюдается.

2. Подготовка реагентов

  1. Для раствора коллагеназы: Подготовка 100 ед / мл коллагеназы I, II и IV в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS) с Са 2+ / Mg 2+ (см табл материалы ). ВНИМАНИЕ: коллагеназы концентрация активного блока и чистота может варьироваться от поставщика к поставщику, которые могут привести к снижению эффективности переваривания ткани и / или сохранности эпитопа на поверхности слизистых клеток. Для предотвращения этих потенциальных ловушек, использовать коллагеназы с высокой степенью чистоты (≥95%) и подготовить исходный раствор, основанный на концентрации активного единиц.
  2. Готовят на водной основе ДНКазы маточного раствора с концентрацией 10 мг / мл (3,55 UA / мг).
  3. Подготовка Wash СМИ: (MEM: 89 мл, к антибиотикам противогрибковые, 100x: 1 мл; термоинактивировали ФТС: 10 мл)
  4. Подготовьте роста фибробластов СМИ: MEM: 500 мл бутылка; L-глутамин (200 мМ): 5 мл; MEM несущественные аминокислоты, 100x решение: 5 мл; ципрофлоксацин НСl (10 мг / мл): 570 мкл; Антибиотик-противогрибкового, 100x решение: 10 мл; пирувата натрия (100 мМ): 5 мл; инактивированной нагреванием ФТС: 50 мл
  5. Подготовка Заморозить СМИ: фибробластов СМИ роста (реагент 2.4) с добавлением 10% диметилсульфоксида (ДМСО), затем отфильтровать-СТЕРЕОilize с 0,22 мкм фильтр.

3. Ферментативно Дайджест тканей человека

  1. Если ткань была заморожена в сублимационной СМИ, место криопробирку в теплой (~ 37 ° C) водой до ткани и СМИ не оттаивают.
  2. Для 4 - 5 2 мм 2 штук ткани, мыть ткани в два раза с 10 мл HBSS без Ca 2+ / Mg 2+.
  3. После того, как ткань урегулирован тяжести, тщательно отбросить супернатант, не спиннинг образца.
  4. Добавить 10 мл раствора коллагеназы в пробе и переносят смесь ткани раствора в стерильной ДНКазы / РНКазы трубки со встроенным роторов для образца диссоциации. Использование коллагеназы отделить внеклеточный матрикс, который окружает базальную сторону эпителиальных клеток и образует непористые фракцию слизистой собственной пластинки.
  5. Плотно закрыть трубу и прикрепите его с ног на голову на рукав диссоциатора (например, GentleMACs). Если лаборатория не имеет доступа к тон вышеупомянутого оборудования, увеличить время каждого шага пищеварения, чтобы получить сопоставимые результаты.
  6. Запустите h_tumor_01 программы, предварительно настроенного профиля в комплекте с машиной (общей продолжительностью 36 сек, с прерывистыми импульсами в диапазоне от 1000 - 4000 оборотов в минуту, с 268 выстрелов в перспективе).
  7. После окончания программы, отсоедините трубку от диссоциации.
  8. Инкубируйте образца в течение 45 мин при 37 ° С при непрерывном вращении на шейкере при 140 оборотах в минуту. Примечание: различные количества образцов ткани, время переваривания может быть пропорционально уменьшена или увеличена (т.е. большее количество ткани могут потребовать дополнительного времени).
  9. Прикрепите трубку с ног на голову на рукав диссоциатора.
  10. Выбрать и запустить h_tumor_02 программы (общая продолжительность 37 сек, с прерывистыми импульсами, начиная с 1000 - 4000 оборотов в минуту, 235 выстрелов в перспективе).
  11. После окончания программы, отсоедините трубку от диссоциации.
  12. Добавьте 50 мкл ДНКазы маточного раствора, Используйте ДНКазу отделить / удалить мертвые клетки и ДНК фракции клеточного мусора, что приводит к клеточной слипания.
  13. Инкубируйте образца в течение 30 мин при 37 ° С при непрерывном вращении на шейкере при 60 оборотах в минуту.
  14. Прикрепите трубку с ног на голову на рукав диссоциатора снова.
  15. Выбрать и запустить h_tumor_03 программы (общая продолжительность 37 сек, с прерывистыми импульсами, начиная с 1000 - 4000 оборотов в минуту, 168 выстрелов в перспективе).
    Примечание: Если ткань не полностью переварили, центрифуге при 250 × г в течение 10 мин при 20 ° С, отбросить супернатант, ресуспендируют в 2 мл раствора для диссоциации клеток и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
  16. Передайте клеточной суспензии через сито стерильной 70 мкм клеток.
  17. Центрифуга клеточной суспензии при 250 х г в течение 10 мин при 20 ° С. Аспирируйте супернатанту полностью.
  18. Промыть осадок клеток дважды 25 мл HBSS без Ca 2+ / Mg 2+ и отбросить супернатант.
  19. До последнего былоч, рассчитывать количество клеток с использованием автоматизированной системы подсчета клеток, доступные в лаборатории или вручную с помощью гемоцитометра. Для MF поколения первичной культуры проводили в течение шага 3.19.1, для анализа или сортировки МЖ с помощью проточной цитометрии проводили в течение шага 3.19.2.
    1. Для выделения и роста чистого MF культуры (рис 1), отбросить супернатант от последнего центрифугирования, ресуспендируют осадок клеток в соответствующем количестве изоляции фибробластов сред, необходимых для семян до 4 × 10 6 клеток в 3 мл среды на лунку в 6 хорошо, культуры клеток, обработанные пластины. Перейдите к шагу 3.20.
    2. Для анализа или сортировки МЖ с помощью проточной цитометрии, разместить до 2 х 10 6 в 2 мл изоляции фибробластов СМИ в 24 хорошо, с низким уровнем связывания пластины и инкубировать O / N при 37 ° С с 5% СО 2. Это восстановление клеточной поверхности эпитопы, которые могут быть затронуты ферментативной процедуры. Затем соберите клеточной суспензии и рассчитывать восстановленные клетки и приступитьдля иммуноокрашивания и проточной цитометрии анализа 8.
  20. Рост клеток при 37 ° С с 5% СО 2. Измените СМИ каждые 2 - 3 дня до образования ~ 80% сливной MF монослоя (рис 1D-E).
  21. Прохождение клетки в колбы Т25 с с 6-луночного планшета в соотношении 1: 1 и расти ~ 10 - 14 дней в ростовой среде фибробластов для достижения 80 - 100% слияния.
  22. Expand культуру пересева клеток из T25, чтобы T75 клеток в соотношении 1: 2. После достижения слияния клетки, используют один сосуд для анализа изолированной MF чистоты с помощью с помощью проточной цитометрии, как описано ранее 5. Замораживание или проход другой T75 колбу MF культуры в соотношении 1: 3.
    Примечание: При анализе с помощью проточной цитометрии, как ожидается, слизистой ЖКТ стромальных МП мезенхимального происхождения при выращивании в культуре будет иметь следующий фенотип: EpCAM-, CD31-, CD45-, виментин +, a-SMA +, CD90 +.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя этот протокол ферментативной пищеварение, мы последовательно удалось изолировать и вырастить MF население кишечника CD90 + слизистой стромальных клеток из GI хирургических образцов и биопсии (Рисунок 1). Видимый MF колонии распространение можно было наблюдать на 2 день - 5 после посева одноядерные клеточные суспензии в 6-луночные планшеты (1А-В). Основными культурами MF достигать ~ 50 - 70% слияния на 7 день - 11 (рис 1С-D).<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Хотя этот протокол был разработан для исследования применения только в свете растущей критическую важность стромальных клеток в качестве потенциального рака прогностических биомаркеров и терапевтической мишени, способность заморозить "функциональные" biospecimens для последующего использования предлагает значительное преимущество. Это представляет собой уникальное преимущество для создания клинической biorepository, которые могут служить в качестве дополнительных инструментов служит для продвижения развития пе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) и Институтом трансляционных наук медицинского отделения Техасского университета, а также премией в области клинических и трансляционных наук (8UL1TR000071).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
MEM, 1xCorningMT-10-010-CV
Сбалансированный солевой раствор ХэнксаSigma-AldrichH6648
пируват натрияSigma-AldrichS8636
антибиотик-антимикотик, 100xGibco15240-062
ципрофлоксацин HClCorning61-277-RF
L-глутамин, 100xCorning25-005-CI
MEM Заменимые аминокислотыCorning25-025-CI
Диметилсульфоксид (ДМСО) Hybri-MaxSigma-AldrichD2650
DL-раствор дитиотреитола (DTT)Sigma-Aldrich646563
0,5 М ЭДТА, pH 8,0Cellgro46-034-CI
DNAseWorthingtonLS002139
Коллагеназа из  Clostridium histolyticum, тип ISigma-AldrichC1639
Коллагеназа из  Clostridium histolyticum, тип IISigma-AldrichC1764
Коллагеназа из Clostridium histolyticum, тип IVSigma-AldrichC5138
Accumax раствор для диссоциации клетокSigma-AldrichA7089
gentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235
Countess Automated Cell CounterInvitrogenC10227
Клеточный фильтр (70 & микро; m)Corning352350
PE Мышь против человека VimentinBD Biosciences562337Клон RV202
FITC Моноклональный антиактин, &альфа;-гладкие мышцыSigma-AldrichF3777Клон 1A4
APC Мышь против человека CD90BD Biosciences559869Клон 5E10

Ссылки

  1. Yamaguchi, H., et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485(2014).
  2. Mullan, N., Hughes, K. R., Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
  3. Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. Annu Rev Physiol . 73, 213-237 (2011).
  4. Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
  5. Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
  6. Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
  7. Roncoroni, L., et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7 (40), (2009).
  8. Pinchuk, I. V., et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798(2013).
  9. Pinchuk, I. V., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
  10. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
  11. Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
  12. Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
  13. Gargus, M., Niu, C., Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215(2015).
  14. Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611(2013).
  15. Schiller, J. H., Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
  16. Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
  17. Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
  18. Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
  19. Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CD90
Выделение CD 90+ фибробластов / Миофибробласты от человека замороженные желудочно-кишечного тракта образцов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.