Методическая статья

Инициирование дифференциация в увековечена МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ ушные клетки-предшественники

DOI:

10.3791/53692

⸱

2 января 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Cell Biology & Neuroscience, Rutgers University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описаны современные протоколы для поддержания иммортализованных мультипотентных клеток отического предшественника (iMOP) и отической дифференцировки. Выделены условия культивирования и молекулярные маркеры, указывающие на дифференцировку в сенсорный эпителий и спиральные ганглиозные нейроны (SGN).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSC) или эмбриональных стволовых клеток (ESC) для клеточной заместительной терапии имеет большие перспективы. Несколько ограничений, включая низкую урожайность и гетерогенные популяции дифференцированных клеток, препятствуют прогрессу терапии стволовыми клетками. Была создана ограниченная судьбой линия клеток мультипотентного отического предшественника (iMOP) для обеспечения эффективной дифференцировки большого количества функциональных волосковых клеток и спиральных ганглиозных нейронов (SGN) для заместительной терапии клеток внутреннего уха. На основе диссоциированных культур одиночных iMOP-клеток были описаны протоколы, способствующие выходу из клеточного цикла и дифференцировке за счет отмены основного фактора роста фибробластов (bFGF). Значительное снижение пролиферирующих клеток после отмены bFGF было подтверждено с помощью анализа пролиферации клеток EdU. Одновременно со снижением пролиферации успешная дифференцировка приводила к экспрессии молекулярных маркеров и морфологическим изменениям. Иммуноокрашивание Cdkn1b (p27KIP) и Cdh1 (E-кадгерин) в отосферах, полученных из iMOP, использовалось в качестве индикатора для дифференцировки в сенсорный эпителий внутреннего уха, в то время как иммуноокрашивание Cdkn1b и Tubb3 (нейрональный β-тубулин) использовалось для идентификации нейронов, полученных из iMOP. Использование клеток iMOP является важным инструментом для понимания решений о судьбе клеток, принимаемых нейросенсорными предшественниками внутреннего уха, и поможет разработать протоколы для создания большого количества волосковых клеток, полученных из iPSC или ESC, и SGN. Эти методы ускорят усилия по созданию глазных клеток для заместительной терапии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Органы внутреннего уха, улитка, утрикула, мешочек и три полукружных канала, опосредуют способность слышать и удерживать равновесие. В улитке волосковые клетки преобразуют звуки в электрические сигналы, которые передаются на спиральные ганглиозные нейроны (SGN). SGN активируют потенциалы действия для распространения нейронных сигналов по слуховой цепи. Генетические мутации, ототоксичные препараты и воздействие громких звуков способствуют гибели волосковых клеток и SGN, что приводит к потере слуха1-4. После утраты эти элементы не заменяются. Использование iPSC и ESC для генерации зарождающихся волосковых клеток или SGN имеет большие перспективы для заместительной терапии клеток внутреннего уха5-8. Стремительный прогресс показал, что плюрипотентные стволовые клетки и предшественники, полученные из внутреннего уха, могут дифференцироваться в волосковые клетки и SGN на различных стадиях зрелости. Эмбриональные стволовые клетки млекопитающих (ЭСК) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) могут быть использованы для получения функциональных волосковых клеток и SGN9-11. Также было показано, что стволовые клетки и клетки-предшественники, полученные из внутреннего уха млекопитающих, образуют волосковые клетки и нейроны со свойствами их клеточных аналогов in vivo 12-16.

Использование ИПСК или ЭСК-прогениторов для замены утраченных волосковых клеток и СГН требует эффективной дифференцировки. Неправильная дифференцировка или продолжающаяся пролиферация привитых стволовых предшественников во внутреннем ухе может усугубить функцию внутреннего уха и создать опухолевый риск, такой как образование тератом во внутреннем ухе17. Существует очевидная потребность в разработке условий культивирования и понимании дифференциации отических предшественников. Одной из стратегий разработки этих методов является повторение решений о судьбе клеток, принимаемых нейросенсорными предшественниками во время развития внутреннего уха. Протоколы, которые предотвращают пролиферацию и направляют отических предшественников в волосковые клетки или SGN, помогут повысить безопасность, а также эффективность заместительной терапии.

Во время развития внутреннее ухо начинается с утолщения поверхностной эктодермы в ограниченной области между ромбомерами 5 и 6, чтобы стать отическим плакодом. По мере того, как атический плакод инвагинирует с образованием отической чашечки, совокупность клеток в передней области глазной чашечки дает начало нейросенсорно-компетентному домену (NSD), который содержит предшественники волосковых клеток и нейронов внутреннего уха18. Исследования по картированию судьбы мышей, куриц и рыбок данио, развивающих внутреннее ухо, позволяют предположить множественные популяции нейросенсорных предшественников, которые дают начало сенсорным волосковым клеткам, окружающим поддерживающим клеткам и глазным нейронам19-22. Фактор транскрипции группы высокой подвижности, Sox2, был вовлечен в спецификацию сенсорных клеток и использован в качестве маркера для предшественников внутреннего уха23,24. Гипоморфные мутации, снижающие уровень экспрессии Sox2 во внутреннем ухе, приводят к потере волосковых клеток, поддерживающих клеток и SGN в улитке25,26.

Для изучения клеток-предшественников отики, принимающих решения о судьбе, ранее была создана линия иммортализированных мультипотентных отических предшественников (iMOP) с ограниченной судьбой из предшественников улитки Sox2, экспрессирующих улитку. Клетки iMOP первоначально были получены из эмбриональной улитки E12.5-13.5 и инфицированы ретровирусом c-Myc27. Клетки iMOP могут непрерывно пролиферировать в виде колониеобразующих клеток, известных как отосферы, и обладают способностью дифференцироваться в волосковые клетки, поддерживающие клетки и SGN27. Понимание способности клеток iMOP дифференцироваться в различные отические линии позволяет применять эти результаты для эффективного создания iPSC или ESC-волосковых клеток и SGN. Эффективные протоколы дифференцировки откроют новые возможности для клеточной заместительной терапии заболеваний внутреннего уха, которые не поддаются традиционному лечению. Важнейшим вопросом при создании клеток оболочки с помощью клеточной культуры in vitro является наличие маркеров дифференцировки, которые помогают определить, подвергаются ли клетки дифференцировке. Cdkn1b (p27KIP) широко используется в качестве раннего маркера дифференцировки при развитии внутреннего уха, однако экспрессия Cdkn1b в клетках iMOP и то, как она коррелирует с дифференцировкой, не рассматривались. В данном исследовании описаны современные условия культивирования и то, как экспрессия Cdkn1b коррелирует с другими маркерами дифференцировки iMOP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Поддержание самообновления клеток в ППМН

  1. Подготовка ИМОП питательных сред: DMEM / F12, 1X B27 дополнения, 25 мкг / мл carbenecillin и 20 нг / мл оФРФ. Сделайте 50 мл культуральной среды ИМОП используя стерильные реагенты. Разминка 49 мл DMEM / F12 в 50 мл конической в ​​водяной бане при 37 °.
    1. Оттепели 50X В27 добавки и стерилизованным фильтрацией 100 мг / мл аликвоты carbenecillin в течение 5 мин на водяной бане при 37 ° C. Оттаять 100 мкг / мл аликвоты оФРФ при комнатной температуре. Добавить 1 мл 50Х В27, 10 мкл 100 мкг / мл и 12,5 оФРФ мкл 100 мг / мл carbenecillin в DMEM / F12.
  2. Используйте 3 мл СМИ в 60 мм блюдо культуры ткани для культивирования клеток ИМОП. Добавить свежие средства массовой информации культур каждый день, удвоив объем средств массовой информации. Убедитесь, что концентрация оФРФ не опускается ниже 5 нг / мл.
    1. Культура ИМОП клетки при 37 ° C с 5% CO 2. Прохождение клеток через 5 - 7 дней в культуре, перечисленных ниже в шагах. Передача культуры в 15мл коническую помощью пипетки на 10 мл.
  3. Сделать 1 мМ ЭДТА в HBSS при разбавлении 0,1 мл 0,5 М ЭДТА рН 8,0 в 50 мл HBSS. Предварительно теплой 1 мМ ЭДТА в HBSS сделал в С на водяной бане 37 °.
  4. Урожай клетки под действием силы тяжести седиментации или центрифугирования при 200 мкг в течение 5 мин. при комнатной температуре. Для осаждения тяжести, поместите конический 15 мл, содержащий культуру в 37 ° C инкубаторе в течение 5 - 10 мин. По истечении этого времени, необходимо соблюдать otospheres собирают в нижней части 15 мл коническую.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное центробежная сила может привести к повреждению клеток.
  5. Тщательно аспирата провел носитель с помощью 2 мл аспирационных пипетки, не нарушая клеточный осадок. Добавить 0,5 мл подогретого раствора 1 мМ ЭДТА HBSS в осадок клеток. Использование P1000 пипетки, осторожно пипеткой вверх и вниз 2 - 3 раза. Поместите коническую при 37 ° С и выдержать в течение 5 мин <облегчения диссоциации на отдельные клетки.
  6. Аккуратно водоворот решение клеток, чтобы определить, otospheres диссоциируют. Если нет OTOСферы осадок на дно конической клетки диссоциируют. Время инкубации может изменяться.
    Примечание: длительной инкубации с ЭДТА приведет к чрезмерному гибели клеток.
  7. Удалить из клетки 37 ° C, добавить 2 мл среды для нейтрализации и разбавления ЭДТА. Собирают клетки центрифугированием при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирацию из разбавляют ЭДТА с использованием 2 мл аспирационной пипетки и добавить мыть клетки 5 мл 1X PBS.
  8. Спин клетки вниз на 200 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и аспирата из 1X PBS с использованием 2 мл аспирационной пипетки. Ресуспендируют клеток с использованием пипетки P1000 в 0,5 мл культуральной среды ИМОП осторожно пипеткой вверх и вниз 2 - 3 раза.
  9. Граф клеток с использованием микрожидкостных счетчика частиц с соответствующими кассет 28. Конфлюэнтную пластина ИМОП клеток будет содержать ~~~HEAD=iobj 6 x10 6 клеток. Развести клеток 1: 100 в среде и добавляют 75 мкл раствора клеточной в кассету для подсчета. Пластина 1 х 10 6 клеток в 6 см блюдо в ИМОП cultuRe сред (~ 1: 10 разбавление). Прохождение iMOPs каждые 5 - 7 дней.
    Примечание: Клетки, которые формируют большое otospheres или прикрепить к нижней части блюдо культуры ткани будет дифференцироваться. Клетки также умереть, если Культуры над сливной.

2. замораживание и оттаивание ППМН Клетки

  1. Подготовьте синтетическая среда замерзания оттаиванием и уравновешивания раствора до 4 ° С перед клеток замораживанию.
  2. Сбор клеток из сливной 6 см блюдо ИМОП клеток. Использование пипетки 10 мл и передачи ячейки (~ 6 - 8 × 10 6 клеток) в 15 мл коническую.
  3. Урожай клетки под действием силы тяжести седиментации или центрифугирования при 200 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Если otospheres малы, клетки не будет урегулировать под действием силы тяжести седиментации. Дополнительно: Граф клеток с использованием шаг 1,9, чтобы определить общее число клеток.
  4. Аспирируйте провел СМИ, используя 2 мл пипетку аспирационной оставляя свободную осадок клеток позади.
  5. Добавить 0,25 мл синтетических средах замораживания ресуспендировать CEзаполняет при плотности ~ 5 х 10 5 до 3 × 10 6 клеток / мл. Аккуратно пипетки клетки с P1000 пипетки. Передача клеточной суспензии до криогенных флаконах с использованием P1000 пипетки 1 мл отфильтрованных чаевые.
  6. Поместите флаконы в спиртовом контейнера свободный замерзания и поместить в контейнер замерзания при -80 ° С для снижения температуры на 1 ° C в минуту, пока температура не достигнет -80 ° С.
  7. Для длительного хранения клеток, передачи флаконов в паровой фазе жидкого азота резервуара. Для оттаять клетки культуры, равновесие криогенной флакона замороженных клеток при -80 ° С.
  8. Предварительно теплой ИМОП культура СМИ в С на водяной бане 37 °.
  9. Оттепель замороженных флакон быстро крутятся на дно флакона в С на водяной бане 37 °. Добавить 1 мл подогретого ИМОП культуры СМИ талых клеток, как только в прошлом кристаллов льда исчезает. Передача клеток в 15 мл коническую и добавить дополнительные 4 мл культуральной среды ИМОП
  10. Спин 15 мл сотрудничестваическая в течение 5 мин. при 200g и аспирации затраченные средства массовой информации. Ресуспендируют клеток в 2 мл ИМОП питательных сред и пластины клеток в чашку диаметром 6 см. Инкубируйте культур при 37 ° С с 5% СО 2 в течение расширения.

3. Дифференциация клеток в линии ППМН сенсорного эпителия

  1. Подготовьте 50 мл ИМОП сенсорного эпителия дифференцировки: DMEM / F12, 1X В27 дополнения, 25 мкг / мл carbenecillin. Сделайте 50 мл ИМОП сенсорного эпителия дифференцировки. Разминка 49 мл DMEM / F12 в 50 мл конической в ​​водяной бане при 37 °. Оттепели 50X В27 добавки и 100 мг / мл аликвоты carbenecillin в течение 5 мин. в С на водяной бане 37 °. Добавить 1 мл 50X B27 и 12,5 мкл 100 мг / мл carbenecillin в DMEM / F12.
  2. Для сбора, диссоциируют, ресуспендируют и рассчитывать клетки повторить шаги 1.4-1.9
  3. Пластина 1 х 10 6 клеток в 6 см блюдо в день -3 помощью ИМОП культуральной среды. На день 0, культуры передачи с использованием 10 мл пипетки в 15 мл коническую. Соберите ОТОсферы по тяжести седиментации, как указано в шаге 1.6. Аспирацию из истощенных средах с помощью 2 мл аспирационных пипетки и оставить otospheres на дне конической.
  4. Аккуратно добавить в 2 мл сенсорного эпителия дифференцировки. Передача otospheres чтобы чашку диаметром 6 см, используя большое отверстие 10 мл пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Механическое сдвига от резкой пипетки может отделить клетки от otospheres.
  5. Добавить 2 мл свежего сенсорного эпителия дифференциации средств массовой информации культур каждый день. При необходимости клетки могут быть собраны путем гравитационного осаждения и средств массовой информации заменен.
  6. Соберите otospheres на 10 день путем передачи в 15 мл конической и позволяя otospheres в осадок, как указано в шаге 1.6.Aspirate потраченные средства массовой информации, используя 2 мл пипетку аспирационные и оставить в покое otospheres.
  7. Исправление otospheres путем инкубации в 4% формальдегиде в 1X PBS в течение 15 мин при комнатной температуре. Удалить раствор формальдегида, мыть otospheres промывочным буфером (PBS 1X, содержащий 0,1% Тритон-100) перед инкубацией в блокирующем буфере (PBS, содержащий 1X 10% нормальной козьей сыворотки и 0,1% Triton X-100) в течение 1 ч.
    1. Замените буфер и инкубировать образцов в блокирующем буфере с разбавленной антитела. Инкубируйте при 4 ° С. Образцы промыть с 1X PBS, содержащий 0,1% в зависимости Тритон Х-100 в otosphere иммунным 27. Передача otospheres в 1X PBS и место otospheres в монтаже СМИ на стекло с помощью пипетки. P1000 Поместите покровное по образцу и позволяет монтировать носитель высохнуть при 4 ° С.
  8. Приобретение эпифлуоресцентной изображений с использованием инвертированного установки микроскопа, снабженного 16-битных ПЗС-камеры и либо 20X 0,75 воздухом или 40X 1,3 NA масло иммерсионный объектив. Сбор флуоресценции от различных цветовых каналов, используя перечисленные (возбуждение и излучение) длины волн: голубой (377 ± 25 нм / 447 ± 30 нм), зеленый (475 ± 25 нм / 540 ± 25 нм), красный (562 ± 20 нм / и 625 ± 20 нм) и инфракрасной (628 ± 20 нм / и 692 ± 20нм).

4. Опробование EDU Включение

  1. В день -3, пластина 1 × 10 6 клеток в ИМОП чашку диаметром 6 см. Три дня спустя в день 0, урожай, отделить, ресуспендируют и рассчитывать клетки, повторяя шаги 1.4-1.9.
  2. Тарелка 2,5 х 10 5 клеток в ИМОП медиакультуры и 5 x10 5 клеток в сенсорном эпителии дифференцировки в разных скважинах блюдо 6 а.
  3. Определить процент клеток в S фазе путем включения ОБР на 3 день с помощью анализа инкорпорации ОБРАЗОВАНИЕ
    1. Добавить ОБРАЗОВАНИЕ запас непосредственно к ИМОП культур, чтобы получить конечную концентрацию 1 мкМ ОБР в культуральной среде.
    2. Выдержите EDU в ИМОП культур в течение 2 ч и инкубируют при 37 ° С с 5% СО 2. Урожай, диссоциируют и собирать клетки повторите шаги 1.4-1.9. Добавить в 4% формальдегиде в 1X PBS в течение 15 мин. при комнатной температуре, чтобы исправить клеток. Урожай клетки центрифугированием при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалить раствор формальдегида и properlу распоряжаться.
    3. Этикетка ядер клеток с Hoechst и включены EDU с зеленым флуоресцентным красителем азида в соответствии с протоколом производителя.
      Примечание: Все Все типы сделаны с 1X PBS, 3% BSA и 0,1% Твин 20. промыть клетки с 1X PBS дважды.
    4. Mount клетки на слайде с помощью реагента antifade и поместите 1,5 покровного стекла по образцу. Приобретение флуоресцентные изображения меченых клеток с использованием эпифлуоресцентной микроскопии.

5. Дифференциация по линии ППМН-Производные Нейроны

  1. Сделайте 50 мл дифференцировки нейронов СМИ: Neurobasal медиа, 1X В27 дополнения, 2 мм L-Глютамин. Оттепели бутылка 50X В27 и 200 мМ L-глутамина в 37 ° C водяной бане в течение 5 мин. Добавить 1 мл 50X B27 и 0,5 мл 200 мм L-глютамин до 48,5 мл Neurobasal СМИ.
  2. Пальто покровного стекла путем размещения 12 мм круглые покровные стекла 1,5 в стерильной 10 см тарелку и добавить 70% этанола к пластине, чтобы стерилизовать и убрать покровные.
  3. Аккуратно агитировать бухтуrslips, чтобы они покрыты в этаноле. Оставьте пластину в течение 10 мин при комнатной температуре. Промыть покровные 3 раза стерильной 1X PBS, чтобы смыть оставшийся этанол. Промойте покровное раз стерильной H 2 0, чтобы смыть оставшийся 1X PBS.
  4. Аспирируйте H 2 0 с помощью 2 мл аспирационных пипетки и пусть покровные сухой. Expose покровные в УФ-свете в капюшоне культуры ткани в течение 15 мин. Магазин покровные в стерильной среде, если он не используется сразу.
  5. Поместите один 12 мм круглый покровное в каждую лунку блюдо 24 а. Встряхнуть тарелку аккуратно, чтобы обеспечить, что покровные лежать на дне колодца.
  6. Оттепели 2 мг / мл поли-D-лизина раствор при комнатной температуре и разбавляют до 10 мкг / мл поли-D-лизина в концентрации 1X PBS. Добавить 0,25 мл 10 мкг / мл поли-D-лизином в лунки. Оставьте пластину в 37 ° C инкубаторе в течение 1 часа.
  7. Вымойте лунки 3 раза стерильной 1X PBS. Оттепели 10 мг / мл маточного раствора ламинин при комнатной температуре и разбавляют до 10 мкг / мл в 1X PBS. Добавить 0,25 мл 10 мкг / мл ламинина рабочего раствора в одну лунку 24 блюдо нескольких скважин. Инкубируйте планшет при 37 ° С инкубатор. Аспирата из ламинин решение, используя 2 мл аспирационной пипетки.
  8. Промыть покровное 3 раза 1X PBS, добавив в 1 мл PBS 1X с P1000 пипетки и удаление 1X PBS путем аспирации с 2 мл аспирационных пипетки. Оставить 1X PBS от последней промывки в скважине, пока клетки готовы быть покрыты. Инициирование дифференцировку нейронов посредством сбора диссоциации и подсчета клеток с шагом 1.4-1.9.Plate 1 х 10 6 клеток в чашку диаметром 6 см в день -3.
  9. На день 0, урожая, отделить и посчитать клетки, повторяя 1,4-1,9. Семена 1 х 10 5 - 1,5 · 10 5 клеток в ИМОП 0,5 мл предварительно нагретой среде для дифференцировки нейронов на лунку в 24-луночный нескольких блюдо. Аспирируйте и добавить подогретого дифференцировки нейронов средства массовой информации культур каждый день.
  10. Исправление ИМОП-производные нейроны в 4% формальдегиде в течение 15 мин.т РТ в День 7. Удалите раствора формальдегида, мыть ИМОП-производные нейроны промывочным буфером (PBS 1X, содержащим 0,1% Тритон Х-100) перед инкубацией в блокирующем буфере (PBS, содержащий 1X 10% нормальной козьей сыворотки и 0,1% Тритон Х-100) в течение 1 часа.
    1. Замените буфер и инкубировать образцов в блокирующем буфере с разбавленной антитела. Инкубируйте при 4 ° С. Образцы промыть с 1X PBS, содержащем 0,1% Triton X-100 при условии клетки иммунной метки 27. Вымойте покровного стекла с 1X PBS до размещения на монтажных средствах массовой информации. Разрешить монтажные средства массовой высохнуть при 4 ° С до приобретения эпифлуоресцентной изображения, как указано в шаге 3.8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

оФРФ Снятие Уменьшает распространение в ППМН клеток

Для уменьшения пролиферативной способности клеток ИМОП и инициировать дифференцировку клеток ИМОП, оФРФ был снят из культур. Чтобы подтвердить, что фактор роста вывод уменьшается пролиферацию, EDU инкорпорация используется в качестве анализа пролиферации. Процент клеток, которые включены EDU с otospheres культивируемых с ИМОП культуральной среде (содержащей о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мониторинг линии ППМН культур

Протокол для поддержания самообновления и продвижение дифференциации нового линии клеток ИМОП описано и дополнительные форматы обшивки включены (таблица 1). Отмечены несколько важных шагов, которые помогут с рутинной расширения и дифференциации клеток ИМОП. Подобно плюрипотентных стволовых клеток культур, ИМОП клетки теоретически имеют неопределенный срок службы. Чтобы убедиться, что клеточные линии надлежащим образом, мониторин...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа была частично поддержана Фондом развития факультета Дункана и Нэнси Макмиллан (K.Y.K.), Грантом биомедицинских исследований Буша (K.Y.K.) и Грантом Рутгерса на развитие факультета (K.Y.K.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CoolCell LX Безспиртовые контейнеры для заморозки клетокBioCisionBCS-405
Криогенные флаконы (2 мл)  Стеклянный430654
толщиной 1,5 мм (круглый 12 мм)Электронная микроскопия72230-01
DMEM/F12Life Technologies11320-082
Нейробазал MediumLife Technologies21103
Фосфатно-солевой буфер (PBS) pH 7,4Life Technologies10010-023
Hank's Сбалансированный солевой раствор (HBSS)Life Technologies14025-092
Добавка B27 (50X) Сыворотка FreeLife Technologies17504-044Хранится в виде 1 мл аликвот
L-глютамин (200 мМ) Life Technologies25030-081Хранение в виде аликвот 5 мл
Natural Mouse LamininLife Technologies23017-015Хранение в виде аликвот 1 мг/мл
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Life TechnologiesC10337
Synth-a-Freeze Криоконсервационный носительLife TechnologiesA12542-01
Prolong Gold Antifade MountantLife Technologies47743-736Хранится в концентрации 10 мг/мл 100 &микро; l aliquots
Moxi Z Mini Автоматизированный счетчик ячеекOrflo MXZ001
Moxi Z кассета типа SOrflo MXC002
Рекомбинантный фактор роста мышиных фибробластов, базовый (bFGF)Peprotech450-33Ресуспендирован в 0,1% BSA в H20 и хранится в виде аликвот 20 мг/мл
Poly-D-лизинSigmaP7886Ресуспендирован в 1X PBS и хранится в дозе 10 мг/мл 100 &микро; l аликвоты
Карбенициллин, Динатриевая сольThermo Fisher ScientificBP2648-1Ресуспендирован в 10 мМ Hepes pH 7,4 и хранится в виде 100 мг/мл аликвоты
5 мл пипетка в индивидуальной упаковке в мягкой обложке (200 / кейс)Thermo Fisher Scientific1367811D
10 мл пипетка в индивидуальной упаковке в мягкой обложке (200 / кейс)Thermo Fisher Scientific1367811E
Обработанная культурой тканей Biolite 24-луночная пластинаThermo Fisher Scientific130188
культурой тканей Biolite 6-луночная пластинаThermo Fisher Scientific130184 
Обработанная культура тканей 6 см ТарелкаThermo Fisher Scientific130181 
EMD Millipore Millex Стерильный шприц PVDF Фильтр Размер пор: 0,22 мкм; mThermo Fisher ScientificSLGV033RS
TipOne фильтрующие наконечники для пипеток 0,1 - 10 мкм; l удлиненный фильтрующий наконечникСША Scientific1120-3810
TipOne фильтр пипетки наконечники 1 - 20 μ l фильтрующий наконечникСША Scientific1120-1810
TipOne фильтр наконечники для пипеток 1 - 200 μ l  фильтрующий наконечникСША Scientific1120-8810
TipOne фильтр наконечники для пипеток 101 - 1000 μ l фильтрующий наконечникСША Scientific1126-7810
15 мл конические пробирки стерильные 20 пакетиков по 25 туб (500 тубСША Scientific1475-0511
конические тубы 50 мл конические тубы стерильные 20 пакетиков по 25 туб (500 туб)США Scientific1500-1211
покровный лист Corning обработанная )

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
  2. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary' noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
  4. Huth, M. E., Ricci, A. J., Cheng, A. G. Mechanisms of aminoglycoside ototoxicity and targets of hair cell protection. Int J Otolaryngol. 2011, 937861-93 (2011).
  5. Brigande, J. V., Heller, S. Quo vadis, hair cell regeneration? Nat Neurosci. 12 (6), 679-685 (2009).
  6. Groves, A. K. The challenge of hair cell regeneration. Exp Biol Med (Maywood). 235 (4), 434-446 (2010).
  7. Okano, T., Kelley, M. W. Stem cell therapy for the inner ear: recent advances and future directions. Trends Amplif. 16 (1), 4-18 (2012).
  8. Ronaghi, M., Nasr, M., Heller, S. Concise review: Inner ear stem cells--an oxymoron, but why? Stem Cells. 30 (1), 69-74 (2012).
  9. Chen, W., et al. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature. 490 (7419), 278-282 (2012).
  10. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. , (2013).
  11. Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).
  12. Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features. J Assoc Res Otolaryngol. 10 (2), 173-190 (2009).
  13. Doetzlhofer, A., White, P., Lee, Y. S., Groves, A., Segil, N. Prospective identification and purification of hair cell and supporting cell progenitors from the embryonic cochlea. Brain Res. 1091 (1), 282-288 (2006).
  14. Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
  15. Martinez-Monedero, R., Yi, E., Oshima, K., Glowatzki, E., Edge, A. S. Differentiation of inner ear stem cells to functional sensory neurons. Dev Neurobiol. 68 (5), 669-684 (2008).
  16. Oshima, K., Senn, P., Heller, S. Isolation of sphere-forming stem cells from the mouse inner ear. Methods Mol Biol. 493, 141-162 (2009).
  17. Nishimura, K., Nakagawa, T., Sakamoto, T., Ito, J. Fates of murine pluripotent stem cell-derived neural progenitors following transplantation into mouse cochleae. Cell Transplant. 21 (4), 763-771 (2012).
  18. Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409(2012).
  19. Jiang, H., et al. Lineage analysis of the late otocyst stage mouse inner ear by transuterine microinjection of a retroviral vector encoding alkaline phosphatase and an oligonucleotide library. PLoS One. 8 (7), e69314(2013).
  20. Sapede, D., Dyballa, S., Pujades, C. Cell lineage analysis reveals three different progenitor pools for neurosensory elements in the otic vesicle. J Neurosci. 32 (46), 16424-16434 (2012).
  21. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132 (7), 1687-1697 (2005).
  22. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134 (24), 4405-4415 (2007).
  23. Neves, J., Parada, C., Chamizo, M., Giraldez, F. Jagged 1 regulates the restriction of Sox2 expression in the developing chicken inner ear: a mechanism for sensory organ specification. Development. 138 (4), 735-744 (2011).
  24. Mak, A. C., Szeto, I. Y., Fritzsch, B., Cheah, K. S. Differential and overlapping expression pattern of SOX2 and SOX9 in inner ear development. Gene Expr Patterns. 9 (6), 444-453 (2009).
  25. Kiernan, A. E., et al. Sox2 is required for sensory organ development in the mammalian inner ear. Nature. 434 (7036), 1031-1035 (2005).
  26. Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing mammalian cochlea. J Neurosci. 30 (2), 714-722 (2010).
  27. Kwan, K. Y., Shen, J., Corey, D. P. C-MYC transcriptionally amplifies SOX2 target genes to regulate self-renewal in multipotent otic progenitor cells. Stem Cell Reports. 4 (1), 47-60 (2015).
  28. Dittami, G. M., Sethi, M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. Determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the Moxi Z mini automated cell counter. J Vis Exp. (64), (2012).
  29. Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
  30. Furue, M. K., et al. Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (36), 13409-13414 (2008).
  31. Lotz, S., et al. Sustained levels of FGF2 maintain undifferentiated stem cell cultures with biweekly feeding. PLoS One. 8 (2), e56289(2013).
  32. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
  33. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  34. Ruben, R. J. Development of the inner ear of the mouse: a radioautographic study of terminal mitoses. Acta Otolaryngol. , Suppl 220. 1-44 (1967).
  35. Matei, V., et al. Smaller inner ear sensory epithelia in Neurog 1 null mice are related to earlier hair cell cycle exit. Dev Dyn. 234 (3), 633-650 (2005).
  36. Lee, Y. S., Liu, F., Segil, N. A morphogenetic wave of p27Kip1 transcription directs cell cycle exit during organ of Corti development. Development. 133 (15), 2817-2826 (2006).
  37. Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. 126 (8), 1581-1590 (1999).
  38. Hasson, T., et al. Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia. J Cell Biol. 137 (6), 1287-1307 (1997).
  39. Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, 33(2011).
  40. Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
  41. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
  42. Kim, W. Y., et al. NeuroD-null mice are deaf due to a severe loss of the inner ear sensory neurons during development. Development. 128 (3), 417-426 (2001).
  43. Liu, M., et al. Essential role of BETA2/NeuroD1 in development of the vestibular and auditory systems. Genes Dev. 14 (22), 2839-2854 (2000).
  44. Ma, Q., Anderson, D. J., Fritzsch, B. Neurogenin 1 null mutant ears develop fewer, morphologically normal hair cells in smaller sensory epithelia devoid of innervation. J Assoc Res Otolaryngol. 1 (2), 129-143 (2000).
  45. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  46. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  47. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  48. Blanchard, J. W., et al. Selective conversion of fibroblasts into peripheral sensory neurons. Nat Neurosci. 18 (1), 25-35 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

iMOPbFGFEdUCdkn1b Cdh1Cdkn1b Tubb3

Похожие статьи