Белки часто используются для маркировки членистоногих для исследований рассеивания. Продемонстрированы методы введения внутренних и внешних белковых меток членистоногим. Также проиллюстрированы методы обнаружения белковых меток с помощью непрямого или сэндвич-ферментного иммуноферментного анализа (ИФА).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Администрирование и обнаружения меток белка на членистоногих для разгона исследований
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мониторинг движения членистоногих часто требуется, чтобы лучше понять динамику популяции, связанные, разгон модели, предпочтения растений-хозяев, и другие экологические взаимодействия. Членистоногие, как правило, отслеживаются в природе помечая их с уникальным знаком, а затем повторно собирать их в пространстве и времени, чтобы определить их возможности расселения. В дополнение к реальным физическим тегов, таких как цветной пыли или краски, различные виды белков оказались очень эффективными для маркировки членистоногих экологических исследований. Белки могут быть введены внутри и / или снаружи. Белки могут быть обнаружены на пойманных членистоногих с белком конкретных иммуноферментного анализа (ELISA). Здесь мы опишем протоколов внешне и внутренне пометки членистоногих с белком. Два простых экспериментальные примеры продемонстрированы: (1) внутренний знак белок представлен насекомого путем предоставления содержанием белка, обогащенного и (2) внешний знак белка местноpplied к насекомым с использованием медицинской распылитель. Мы тогда связать шаг за шагом руководство бутерброда и косвенных методов ELISA, используемых для обнаружения белка знаки на насекомых. В этой демонстрации, различные аспекты приобретения и обнаружения белковых маркеров на членистоногих для марки-релиз-повторной поимки, марки-захвата и типы самостоятельной знак захвата исследований обсуждаются, наряду с различными способами, что процедура immunomarking Был адаптированы к широкий спектр задач исследования.
Введение
Отслеживание перемещений членистоногих вредителей, естественных врагов (паразитов и хищников) и опылителей в природе имеет важное значение для лучшего понимания, как улучшить экосистемные услуги. Ключевым компонентом для большинства типов разгона исследований, имеющих надежный способ, чтобы отметить членистоногих (ы) интересов. Разнообразие материалов (например, краски, красители, цветные пыли, теги, редкие элементы, белки) были использованы, чтобы отметить членистоногих, чтобы оценить их динамику народонаселения, разгон возможности, кормление поведения и другие экологические взаимодействия 1,2.
Адекватность используем....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Внутренний Марк, хранения, и порядок обнаружения
- Внутренняя процедура маркировки
- Соберите насекомых интересов (п ≈ 100 человек) из лаборатории колонии выращенных на искусственном диеты или с поля и делятся на две чистые контейнеры выращивания.
- Поставьте обычный 20 мл диеты пакет (без опознавательных знаков негативное отношение управления) в одном из контейнеров. Дополнение второй 20 мл искусственного диеты пакет с 1,0 мл 1,0 мг / мл куриного IgG / решения IgY, тщательно перемешать и поместить его в другую емкость.
Примечание: Если насекомое интерес не имеют искусственный рацион, знак может быть помещен на или в какой-л....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Внутренняя маркировка:
Результаты теста внутренней удерживания знак, показаны на рис 2А. Рассчитанная ИФА критический порог значение было 0,054. В целом (все четыре даты образец в сочетании), насекомые, обработанные без белка дали последовательно низкие значения ELISA (X = 0,038 ± 0,002, N = 80). С другой стороны, все насекомые подается белок, обогащенный диеты дали п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Порядок immunomarking членистоногих белок был впервые описан почти четверть века назад 9. С тех пор, эта процедура была приспособлена для изучения расселения модели широкого спектра членистоногих, использующих и внутренне и внешне управляемые IgG / IgYs. Эти белки оказались стойких маркеров для широкого спектра видов насекомых проверенных сих пор. Тем не менее, как упоминалось выше, главное ограничение на использование IgG / IgYs том, что они очень дороги. Следовательно, IgG / IgYs полезны только для МРТ и са.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Упоминание торговых наименований или коммерческих продуктов в данной публикации исключительно в целях обеспечения конкретной информации и не подразумевает рекомендацию или одобрение со стороны Министерства сельского хозяйства США. Министерство сельского хозяйства США равные возможности и работодателем.
Благодарности
Финансирование было предоставлено USDA КРИС 5347-22620-021-00D и, в частности, по сельскому хозяйству и продовольственной исследовательская инициатива конкурентной грант №. 2011-67009-30141 от USDA Национальный институт продовольствия и сельского хозяйства. Мы благодарны за техническую поддержку Johanna Нассиф. Мы также поблагодарить Пола Бейкер, Дэвид Хортон, Диего Ньето, и Фрэнсис Sivakoff для обеспечения некоторых изображениях, используемых на рисунке 3.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Контейнер для хранения пищи (для разведения насекомых) | Rubbermaid/Tupperware | Различные размеры | Различные производители и продавцы. Сетчатая ткань вклеивается в окошко |
| Небулайзер малого объема (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Доступен в Интернете и в магазинах медицинских товаров. Другие бренды тоже подойдут. |
| Микроцентрифужные пробирки, 1,6 мл с крышкой | Continental Lab Products | 4445.X | Подойдет любой подобный тип. Мы отдаем предпочтение брендам, которые имеют легко открывающиеся крышки. |
| Ящик для хранения микроцентрифужных пробирок из пенополистирола (сетка 5x20) | RPI Corp. | 145746 | Этот дизайн хорош тем, что он не перегружает трубы. |
| Диспенсер, репитер | Eppendorf | 4982000322 | Что-либо подобное поможет ускорить выдачу. |
| Пестики, пластиковые одноразовые измельчители для салфеток, 1,5 мл | Kimble Chase | 749521-1500 | Доступны у различных поставщиков. Пестики можно чистить и автоклавировать для повторного использования. |
| Планшеты BD Falcon ELISA, 96-луночные (плоскодонные) | Пипетка BD | 351172 | |
| Ovation, ручная (20-200 &; l) | VistaLab | 1057-0200 или 1070-0200 | Подойдет любой похожий тип. Данная модель отличается эргономичностью. |
| Резервуары, стерильный реактив | VistaLab | 4054-1000 | Подойдет что-нибудь подобное. |
| Электронный пипетка, 8-канальный (50-1 200 &; l) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | Если бы вам пришлось выбрать одну электронную модель, этот размер был бы наиболее полезен. |
| Электронный пипетка, 8-канальный (10-300 &; l) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Что-нибудь подобное подойдет. |
| Коллекторная, многолуночная пластинчатая шайба (8-позиционная, прямая) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Что-то подобное подойдет и для ручного мытья тарелок. |
| Микропланшетный ридер с детекцией поглощения | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Подойдет что-нибудь подобное. |
| Курица IgG/IgY | Соединенные Штаты Биологический | I1903-15R | Также доступен из других источников |
| Яичные белки | в продуктовом магазине | " Все белые», « Взбиватели для яиц", etc. | Смешайте 5 мл с 95 мл dH2O для получения 5% раствора |
| Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2,42 г/л для производства TBS |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29,22 г/л для получения TBS и 8,0 g/ L для PBS |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1,14 г/л для PBS |
| Калийфосфат одноосновной (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0,2 г/л для PBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0,2 г/л для PBS |
| Tween 20, EIA марки | Sigma-Aldrich | P1379 | Добавляйте 0,5 мл на л в PBS после растворения солей. |
| PBS с 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 пакетик в 1 л dH2O |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (цельная молекула) антитело, полученное у кролика (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µ l в 50 мл TBS |
| сухого молока, сухого или свежего молока (1%) | Продуктовый магазин | Смешайте 10 г с 1 л dH2O для получения 1% раствора | |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (цельная молекула)-пероксидазное антитело, вырабатываемое у кролика (1:10,000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 &m; l в 1 л 1% молочного |
| антитела против куриного яйца альбумина, вырабатываемые у кролика (1:8,000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilut 125 &микро; l в 1 л PBS-BSA |
| козий конъюгат против кролика IgG пероксидаза (1:2,000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Разведите 0,5 мл в 1 л PBS-BSA, затем добавьте 1,3&nbл; ml Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77) сополимер кремния и полиэфира | Lehle Seeds | VIS-01 | Добавить в качестве последнего ингредиента |
| TMB Microwell Однокомпонентный пероксидазный субстрат | SurModics | TMBW-1000-01 |
Ссылки
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- Lavandero, B. I., Wratten, S. E., Hagler, J. R., Jervis, M. A. The need for....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
