Высокое разрешение Количественное кристаллической целлюлозы Накопление в Arabidopsis Корни для мониторинга Тканеспецифическая клеточной стенки Модификации

Summary

Кристаллическая целлюлоза является важным компонентом клеточной стенки растения. Тем не менее, его количественная оценка при клеточном разрешении является технически сложной задачей. В данной работе мы сообщаем об использовании технологии поляризованного света и корневых сечений для получения информации о составе клеточной стенки с пространственно-временным разрешением.

Abstract

Растительные клетки окружены клеточной стенкой, состав которой определяет их окончательный размер и форму. Клеточная стенка состоит из сложной матрицы, содержащей полисахариды, в состав которых входят целлюлозные микрофибриллы, образующие как кристаллические структуры, так и целлюлозные цепи аморфной организации. Ориентация целлюлозных волокон и их концентрация диктуют механические свойства клетки. Для определения уровня кристаллической целлюлозы используется несколько методов, каждый из которых имеет как преимущества, так и ограничения. Некоторые могут различить долю кристаллических областей в общей целлюлозе. Тем не менее, они ограничены анализами всего органа, в которых не хватает пространственно-временной информации. Другие, полагающиеся на живую визуализацию, ограничены использованием неточных красителей. В данной работе мы сообщаем о чувствительной системе на основе поляризованного света для специфической количественной оценки относительного замедления света, представляющей накопление кристаллической целлюлозы в поперечных срезах корней Arabidopsis thaliana. В этом методе сохраняется клеточное разрешение и анатомические данные, что позволяет проводить прямые сравнения между различными тканями, составляющими растущий корень. Этот подход открывает новое аналитическое измерение, проливая свет на связь между составом клеточной стенки, клеточным поведением и ростом всего органа.

Introduction

Стенка растительной клетки является динамической структурой. Растущие клетки окружены первичной клеточной стенки, организация, которая позволяет клеткам расширяться. Клетки, которые перестают расти депозит более жесткую вторичную стенку, которая повышает механическую поддержку завода. Обе клеточные стенки состоят из микрофибрилл целлюлозы , внедренных в матрицу из полисахаридов различной структуры (например, гемицеллюлоза и пектин) , которые различаются по различным стадии развития и тканей ^1,2. Целлюлоза синтезируется в виде цепочек (1,4) & beta; -D-глюкана, которые тесно выровнены с образованием микрофибрилла кристаллической структуры. Аморфная целлюлоза относится к регионам, где менее упорядоченные глюкана цепи. Соотношение между кристаллическими и аморфными областями является одним параметром считается, влияет на механические свойства клеточной стенки, обеспечивая механическую прочность и вязкоупругой характеристику, соответственно ^3. Несколько методовразработана для обнаружения и количественного определения двух форм расположения целлюлозы, в том числе рентгеновской дифракции и кросс - поляризационной / магический угол спиннинг твердотельный ЯМР ^4. Рентгеновской дифракции может быть использован для определения доли кристаллических по сравнению с аморфными областями целлюлозы в образце ^5. Альтернативный метод использует фракционирование содержания клеточной стенки в нерастворимый в кислоте и кислотно-растворимого материала, чтобы проводить различие между кристаллической и аморфной целлюлозы или других полимеров, соответственно. При таком подходе, включение меченой глюкозы ^([14 C] глюкоза) используется для количественного определения ^6,7 целлюлозы. Эти методы требуют больших объемов растительного материала для анализов целых органов, в лучшем случае, и, следовательно, являются недостаточно чувствительны к изменению тканесецифического в структуре клеточной стенки. Визуализация микрофибрилл целлюлозы на клеточном разрешение может быть достигнуто в исследованиях живых изображений в сочетании с флуоресцентными красителями ^8,9, который может идентифицировать изменения вориентация микрофибрилл целлюлозы. Тем не менее, эти красители не используются для количественной оценки, они не являются специфическими для кристаллической целлюлозы и может помешать нормальной структуры клеточной стенки ^8. Polscope является метод визуализации , который зависит от способности кристаллической целлюлозы , чтобы разделить световые лучи и замедлить часть света ^10. Свет отсталость является самым сильным для микроволокон, которые лежат перпендикулярно к направлению распространения света. Для получения микроволокон с аналогичной ориентации, тем выше степень кристалличности, чем больше света retardance ^11. Следовательно, polscope используется для изучения как относительные уровни и ориентации микрофибрилл целлюлозы.

Корни демонстрируют линейный рост, в ходе которого клетки , происходящий в ниши стволовых клеток, на кончике корня, претерпевают ряд клеточных делений, прежде чем они быстро расширяться ^12. Клетки, содержащие корень расширения в однонаправленном (анизотропной)манера, как это диктуется малых гормонов сигнальной молекулы , которые влияют на свойства клеточной стенки ^13. Дифференциальная реакция на гормоны, во времени и пространстве, служат средством обеспечения роста ¹⁴ сбалансированный орган. Следовательно, высокое разрешение анализ структуры клеточной стенки может предоставить важную информацию, необходимую, чтобы лучше понять связь между ответами типа специфических клеток для всего роста органов. Здесь мы сообщаем о реализации polscope для изучения тканеспецифичную накопление кристаллической целлюлозы в Arabidopsis корни, как это наблюдается в высококачественных анатомических участках. Этот метод недавно обнаружили типоспецифической клеток накопление кристаллической целлюлозы в ответ на пространственное возмущение гормональной активности ^15.

Protocol

1. Рост растений

1. Поверхностный простерилизовать семена.
   1. Стерилизовать семена (до 30 мг) путем влажного или сухого способа. В качестве примера, для сухого способа стерилизации, добавляют 1 мл лед ной 37% HCl в 50 мл хлорной извести, в стеклянном стакане в закрытом эксикаторе в течение по меньшей мере 4 ч и до ночи. Выполните этот шаг в химической капот.
2. Распространение стерильных семян на чашки с 0,8% агаром завода в 0,5 × Мурашига и Скуга (MS) среде. Оберните плиты с Parafilm или пористой лентой и накрыть алюминиевой фольгой.
3. Хранить пластины при температуре 4 ° С в течение 1 - 4 дней, чтобы способствовать равномерное прорастание.
4. Перенос пластины в камере роста , пригодных для выращивания Arabidopsis рассады. Место пластин вертикально, чтобы поддерживать рост корней на верхней части агаровой среды и для предотвращения проникновения.
5. Передача рассады до фиксатив 7 дней после появления всходов (DAG).

2. Закрепление

1. Приготовьте 50 мл Ричардсона SOLUTIOп путем объединения равных объемов 1% буры (буферный агент), 1% метиленового синего и 1% Лазурное (гистологические красители) в бидистиллированной воде. Фильтруют через шприцем, приводимым ПВДФ Фильтрующий блок 0,22 мкм перед его использованием.
2. Приготовьте 50 мл фиксаторе: 1,25% глутарового альдегида в 0,05 М какодилата натрия (буферный агент).
   Примечание: Эти материалы являются токсичными и должны быть обработаны в химической капотом.
3. Добавляют 100 мкл раствора Ричардсона (см 2.1) к решению фиксации (см 2.2), чтобы получить окончательное решение фиксации.
4. Отметьте каждую лунку 6-луночного планшета с соответствующим именем образца.
5. 2 место - 3 мл конечного раствора фиксации (см 2.3) в лунки, так что сеянцы, когда-то переданы, будут полностью покрыты жидкостью.
6. Тщательно передачи, с помощью пинцета, до 10 саженцев в каждую лунку. Уплотнение пластин с помощью парафином. Хранить при температуре 4 ° С, в темноте, в течение по крайней мере одну ночь, и в течение одной недели.

3. Обезвоживание

<литий> Дегидрировать рассаду. Передача их между скважинами новых 6-луночные планшеты, содержащие возрастающие концентрации этанола, как указано здесь: 10% этаноле в течение 15 мин; 30% этаноле в течение 15 мин; 50% этаноле в течение 15 мин; 70% этаноле в течение 15 мин; 85% этаноле в течение 15 мин; 95% этаноле в течение 15 мин; 95% -ного этилового спирта при температуре 4 ° С, в течение ночи, как минимум. Ручка рассаду, осторожно схватив их за семядолей, предпочтительными с пластиковыми щипцами.

4. Проникновение

1. Подготовка инфильтрации среды. Смешайте содержимое мешка 1 комплекта активатора historesin с 50 мл базового комплекта смолы жидкости в маленькой стеклянной бутылке. Перемешать с магнитом в течение 20 мин. Проникновение среда может храниться при температуре 4 ° С в течение нескольких недель.
2. Марк каждую лунку новой 6-луночный планшет с соответствующим именем образца и заправить 2 - 3 мл среды инфильтрации.
3. Передача рассаду из 95% раствора этанола к инфильтрации среде с помощью щипцов. Убедитесь, что сеянцы фуLLY покрыты средой.
4. Хранить при температуре 4 ° С в течение по крайней мере 4-х дней, чтобы обеспечить максимальное проникновение в ткани растений.

5. Блок подготовки

1. Поместите небольшие этикетки, карандаш, отмеченные именем образца, внутри каждой лунки встраивания пресс-форм.
2. Готовят вложение среды путем добавления 1 мл отвердитель до 15 мл инфильтрации среды (4.1). Не пытайтесь приготовить объемом меньше 15 мл, чтобы избежать проблем полимеризации.
3. Заполните половину каждой лунки в пресс-форме с 200 мкл среды и вложению покрытия с верхним пленочного ЧАСТЕЙ к форме пресс-формы, но до размера 1 мм больше с каждой стороны. Инкубируют при комнатной температуре в течение по крайней мере 2 ч, чтобы обеспечить полимеризацию. Не следует превышать 5 часов.
4. Приготовьте дополнительную порцию вложение среды (см 5.2) и держать на льду, чтобы избежать полимеризации в то время как кончики корней которые могут быть размещены в пресс-форме.
5. Разрежьте каждый кончик корня под областью рассекает с помощью скальпеля и очень осторожно позиции ят: вертикально для поперечных сечений или горизонтально для продольного сечения, при температуре около 2 - 3 мм от периферии пресс-формы. Заполните форму полностью блокирующим раствором и накрыть верхним пленкой. Обратите внимание, что блокирующий раствор сократится незначительно, как только она полимеризуется.
6. Хранить при комнатной температуре в течение 2 ч, при минимальном уровне.
7. Сушить блоки, поместить в коробку с сухим силикагелем и оставляют при комнатной температуре в течение ночи, при минимальном уровне.

6. Секционирование

1. Подготовьте стеклянные ножи из стеклянных палочек с ножом производителя. Используйте стеклянные ножи для секционирования ткани. Вырезать стеклянного стержня в квадрат, а затем разрезать квадрат по диагонали, чтобы произвести два ножа, с помощью алмазного инструмента подсчета очков.
2. Раздел блоков в 2 - 3 мкм шириной срезов, используя секционирования машину. Место ломтики на стекле, на верхней части дистиллированных капель воды и поместить слайд на нагревательный блок установлен на слабом огне (50 - 60 ° C), пока вода не испарится.

7. Slide Подготовка к поляризационный микроскоп

1. Разбавленный раствор Ричардсон (см 2.1) до 0,2% от исходного раствора и используют 1 мл ее, чтобы покрыть ломтики. Поместите на блок тепла в течение 5 секунд, а затем промыть дистиллированной водой.
2. Сушат слайд на горячей плите. Соблюдайте под рассекает сферу и отметить заднюю часть слайда с маркером, чтобы указать положение срезов, представляющих интерес, чтобы облегчить их последующую идентификацию под микроскопом.
3. Добавьте 100 мкл среды и монтажной крышки с крышкой скольжения.

8. Получение изображения

1. Поместите покрытый слайд , содержащий корневую директорию секции под световым микроскопом , оборудованного системой Polscope подходящей для получения информации retardance и поляризатор / интерференция оптический фильтр (рис 1 AD).
2. Выберите увеличение , что позволяет четкую визуализацию всего образца (например, 40Х в данном исследовании) и сфокусировать микроскопе на пустом поле, содержащее блок-секцию, но не корневой раздел. Попробуйте найти чистый регион без каких-либо дефектов. Используйте эту область, чтобы установить фон.
3. Установите систему формирования изображения и параметров программного обеспечения: Установите диапазон до 17 нм. Применить "Автоматическая установка экспозиции» и получить фоновое изображение из пустого поля (см 8.2). Один фоновое изображение используется в эксперименте.

9. Polscope Анализ Целлюлоза микрофибрилла ориентации

1. Анализ продольных сечений.
   1. Поместите слайд, содержащий продольные разрезы под микроскопом и получить retardance изображение его. Сфокусируйте микроскоп на корневой секции интересов. Укажите новое имя файла.
   2. Захват abrio изображения (с запаздыванием информации) через "Live Abrio" окна. Убедитесь , чтобы захватить участок , который включает клеточную стенку, которая может быть идентифицирована с помощью окрашенного целлюлозы , проходящей по периферии клетки, как показано на фиг.2С.
2. Анализ изображений.
   1. Дважды щелкните по соответствующему изображению в стеке изображений. Выберите "Ориентация Псевдо цвета" на вкладке "Настройки дисплея".
   2. Для того, чтобы оценить угол микрофибрилла целлюлозы, соответствует соответствующий оттенок клеточной стенки в том, что в цветовом круге.
      Примечание: Колесо цвета на рисунке 2C отражает медленную ось света , лежащей вдоль микрофибрилла , который указывает направление вдоль длинной оси микрофибрилл. Угол микрофибрилл целлюлозы угол обозначен цветом и длинной оси клетки. Например, удлиняя ячейка на врезке показывает голубой цвет, наклоненной приблизительно на 90 ° по отношению к продольной оси клетки.
   3. Для количественной оценки среднего угла микрофибрилла в клеточной стенке, используйте "Retardance и Азимут Stamp" инструмент на панели инструментов программного обеспечения. При выборе инструмента, точку и нажмите на область интереса в полученном изображении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это Вильл результат на дисплее углов (азимут) в градусах (рис 2С).
   4. В открытом доступе поляризованного света программного обеспечения для анализа изображений альтернативной, обед "Pol-анализатор" плагин из меню плагинов. В новом открывшемся окне выберите вкладку "двулучепреломления" и откройте, а затем сохранить фоновый файл и файл изображения.
   5. В окне изображения, выберите "Спецификации". и настроить 'ROI размер пикселя "(использование 5 пикселей для этого исследования). В "Спекуляции". окно, выберите "Показать значения в таблице результатов".
   6. С помощью инструмента Polygon, чтобы отметить интересующую область в окне изображения. Выберите "ориентация линий", чтобы получить ориентацию микрофибрилла целлюлозы.
      Примечание: Это приведет к отображению углов (азимутов) в градусах.
      Примечание: Средний угол рассчитывается по одной из двух методов должен быть затем нормализованы к позиционированию корневого сечения вдоль каретки. Для коррекции отклонения отгоризонтальное расположение корневой секции всей вдоль каретки, количественно средний угол микрофибрилла клеточной стенки фланкирующих ячейки вдоль его длинной оси (то есть перпендикулярно к секции и вдоль оси роста корней, фиг.2с). Этот угол равен 180 °, когда секция корень точно позиционируется вдоль слайда. Для вычисления угла микрофибрилла, вычесть среднее значение измеренного угла микрофибрилла фланкирующей клеточной стенки от 180 °. Добавьте в результате разницы в среднем измеренный угол микрофибрилл клеточной стенки, которая лежит плашмя на слайде.

10. Polscope анализ кристаллической целлюлозы Накопление

1. Используйте (поперечные) поперечные сечения. Следует отметить, что накопление кристаллическую целлюлозу можно сравнить только между клетками при их микрофибрилл целлюлозы выровнены по аналогичным углом (как это определено в 9).
2. Дважды щелкните по соответствующему изображению в стеке изображений. Выберите "Pseudo цвет "на вкладке" Настройки дисплея ".
3. Для измерения retardance. Штобы на изображении. Выберите "Регион" и отметьте все регионы, представляющие интерес. Перейдите к вкладке "измерения" и "Копировать в буфер обмена" все значения.
   1. Передача данных в Excel и извлекать необходимую информацию (имею в виду область retardance). Осуществить нормировку данных.
      Примечание: Для того, чтобы учесть различия в толщине между ломтиков, выражают значения относительно конкретного края клеточной стенки в слайде. Для нормализации, поделить среднюю retardance, соответствующую клеточной стенки интерес средним retardance другого клеточной стенки в том же изображении. Например, наружная стенка эпидермальных клеток нормализовали к внутренней кортикальной стенки клеток в нашем исследовании.
4. Повторить измерения по меньшей мере, 3-х секций на корень, но не менее 3-х корней на выборку.

Results

Мы изучаем влияние ответов типа конкретных клеток к брассиностероидов (BRS), используя корень Arabidopsis в качестве модели органа ^15-17. Когда BRI1 рецептора BR ориентирован, на фоне BRI1 мутанта, к подгруппе эпидермальных клеток , называемых не-волосковые клетки (рис 2А, В), он ингибирует однонаправленное расширение клеток соседних клеток, а также рост целого корня ^15. Анализ Polscope было проведено с целью выявить механизм, лежа...

Discussion

Здесь мы представляем метод для определения накопления кристаллической целлюлозы в различных тканях , образующих корни Arabidopsis, сохраняя при этом анатомической информации. Таким образом, он обеспечивает дополнительный шаг к пониманию процессов роста в растениях на клеточном разрешении. Этот метод может быть также применен для изучения дополнительных видов и органов растений.

Ряд точек необходимо учитывать при применении метода. Во-первых, кристаллическая целлюлоза накопление в д...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Мурасигэ и Skoog (MS)	Duchefa	M0221
Borax	LOBA CHEMIE	6038
Метиленовый синий	Sigma	M-9140
Azure	Sigma	861065
Шприц с приводом 0,22 мм PVDF Фильтр	MILLEX-GV
Глутаральдегид	EMS	16220
Какодилат натрия	Sigma	C-0250
Leica набор historesin	Leica	7022 18 500
встраиваемые формы	Agar Scientific	AGG3530
пленка 100 &микро; P.P.C.			накладная пленка
Knivemaker	LKB	7800
Ultratome III	LKB	8800	Ultratome
Shandon immumount			Термо 9990402 крепление микроскоп среднего
света	Nikon Eclipse	80i
Abrio	Система		CRI
Программное обеспечение Abrio V2.2	CRI	Abrio V2.2
для анализа изображений поляризованного света в открытом доступе	OPS	OpenPolScope	http://www.openpolscope.org/