Методическая статья

Непосредственное определение характеристик гидратированных белков в воде SALVI и TOF-SIMS

DOI:

10.3791/53708

⸱

15 февраля 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Fundamental & Computational Sciences Directorate, Pacific Northwest National Laboratory, 2Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа представляет собой протокол для жидкого обработки и ввода пробы для микроканале для на месте времени пролета вторичной ионной масс-спектрометрического анализа белковых биомолекул в водном растворе.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа демонстрирует Непосредственное определение характеристик белковых биомолекул в водном растворе при помощи системы для анализа на жидкостные вакуумные интерфейса (SALVI) и времени пролета вторичной ионной масс-спектрометрии (TOF-SIMS). Фибронектин белок фильм был иммобилизован на нитрид кремния (SiN) мембраны, которая формирует зону обнаружения SALVI. При анализе ToF-SIMS, были проведены три режима анализа в том числе высокое пространственное разрешение масс-спектрометрии, двумерный (2D) изображений, и глубине профилирования. Масс-спектры получали в положительных и отрицательных режимах. Деионизированную воду также анализировали качестве образца сравнения. Наши результаты показывают, что фибронектин пленка в воде имеет более четкие и сильные воды кассетные пики по сравнению с водой в одиночку. Характерные пики фрагментов аминокислотных также наблюдаемая в гидратированном белка спектров ToF-SIMS. Эти результаты показывают, что адсорбция молекула белка на поверхности могут быть изучены DynamicaLLY использованием SALVI и TOF-SIMS в жидкой среде впервые.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гидратация имеет решающее значение для структуры, 1 конформации, 2 и биологической активности 3 белков. Белки без молекул воды вокруг них не было бы жизнеспособных биологических активностей. В частности, молекулы воды взаимодействуют с поверхностью и внутренней структуры белков, а также различные гидратации состояния белков сделать такие взаимодействия различны. 4 Взаимодействие белков с твердыми поверхностями является фундаментальным явлением с последствиями в области нанотехнологий, биоматериалов и тканевой инженерии процессов. Исследования уже давно показали, что конформационные изменения могут происходить как белок обна....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Очистка и Стерилизация Микроканал SALVI

  1. Стерилизация Микроканал в SALVI
    1. Draw 2 мл 70% этанола водный раствор в шприц, соединить шприц с входным концом SALVI, и медленно вводят 1 мл жидкости за 10 мин. Удалите шприц в конце инъекции. Затем подключите вход и выход из SALVI помощью полиэфирэфиркетоновой (PEEK) союз. С другой стороны, использовать шприцевой насос, чтобы провести ту же процедуру. Например, установить скорость потока при 100 мкл / мин.
    2. Хранить SALVI микроканал заполненную 70% -ным раствором этанола при комнатной температуре в течение 4 ч.
  2. Представьте деионизированной (ДИ) воды в SALVI
    1. Draw 2 мл ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пару представительных результатов представлены для демонстрации преимущества предлагаемого протокола. При использовании микрожидкостных интерфейс SALVI, первичный ионный пучок (Bi 3+) может непосредственно бомбардируют на гидратной фибронектина фильма в ДИ воды. Таким образом, молекулярная химическая отображение поверхности жидкости может быть успешно достигнута.

Рисунок 1a и 1b

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SALVI является Микрожидкостных интерфейс, который позволяет динамически поверхность жидкости и анализ раздела жидкость-твердое вещество на основе вакуумных приборов, таких как ToF-SIMS и сканирующей электронной микроскопии (SEM). Благодаря использованию малых отверстий подвергать жидкость непосредственно в вакууме, SALVI подходит для многих хорошо сфокусированные спектроскопии и визуализации методов без каких-либо модификаций; 22 портативность и универсальность микрофлюидики сделать его истинным мультимодальн.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны фонду LDRD Инициативы по химической визуализации Тихоокеанской северо-западной национальной лаборатории (PNNL) - Лабораториям направленных исследований и разработок (CII-LDRD) и Синтеза и моделирования материалов в масштабах (MS3) LDRD. Инструментальный доступ был предоставлен в рамках научного тематического предложения Лаборатории молекулярных наук об окружающей среде W. R. Wiley (EMSL). EMSL является национальным научным пользовательским объектом, спонсируемым Управлением биологических и экологических исследований (BER) в PNNL. Авторы благодарят г-на Сяо Суя, г-на Юаньчжао Дина и г-жу Цзюань Яо за корректуру рукописи и полезные отзывы. PNNL ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ToF-SIMSIONTOFTOF. Разрешение SIMS 5: >10 000 м/и дельта; m для разрешения по массе; >4 000 м/&дельта; m для высокого пространственного разрешения 
Система анализа на границе раздела жидкостных вакуумов (SALVI)Тихоокеанская северо-западная национальная лабораторияN/ASALVI — это уникальный, автономный, портативный аналитический инструмент, который впервые позволяет использовать вакуумные научные приборы, такие как времяпролетная масс-спектрометрия вторичных ионов (ToF-SIMS), для анализа поверхностей жидкостей в их естественном состоянии на молекулярном уровне.
PEEK UnionValcoZU1TPKдля подключения входного и выходного отверстия SALVI
5 Axes Sample StageIONTOFN/AStage изготовлен самостоятельно для установки SALVI в
систему очистки воды ToF-SIMS Barnstead Nanopure Water Purification SystemThermo Fisher ScientificD11921ROpure LP Модуль фильтрации обратного осмоса (D2716)
ШприцBD3096591 мл
ПипеткаThermo Fisher Scientific21-377-821Диапазон: от 100 до 1,000 мл
Наконечник для пипеткиNeptune2112.96.BS1,000 &; l
Центрифужная пробиркаCorning43079115 мл
фибронектинSigma-AldrichF11411 мг/мл
этанолThermo Fisher ScientificS25310A95% денатурированный
Gibco PBSThermo Fisher Scientific10010-023pH 7,4

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
  2. Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding? Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
  3. Chaplin, M.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи