$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Процедуры, которые включают предметы животных были одобрены Уходу за животными и Комитетом по утилизации, Академии Синика, Тайбэй, Тайвань.
1. Подготовка экспериментального решения и оборудование для многоэлектродная регистрирующей
- Готовят искусственную спинномозговую жидкость (ACSF, 124 мМ NaCl, 4,4 мМ КСl, 1 мМ NaH 2 PO 3, 2 мМ MgSO 4, 2 мМ CaCl 2, 25 мМ NaHCO 3, и 10 мМ глюкозы, продувают 95% O 2 и 5% СО 2).
- Используйте два типа MEA зондов: 6 х 10 плоскостную MEA и 8 х 8 МЭС. Первый зонд охватывает область, которая включает в себя кору мозга, полосатое тело и таламус. Последний зонд покрывает только область коры головного мозга.
- Используйте усилитель 60-канальный с полосового фильтра, установленного в диапазоне от 0,1 Гц до 3 кГц при 1200 усиления. Приобретать данные с частотой дискретизации 10 кГц.
- Поместите два AgCl Покрытые серебряные провода внутри MEA камеры для DCS. Используйте AgCl-покрытие серебряные провода для производства электрических полей, которые создаются с помощью изолированной стимулятора.
- Поместите вольфрамовый электрод (диаметр, мкм 127; длина, 7,62 см, 8 ° AC конический наконечник; сопротивление, 5 МОм) для стимуляции таламуса, и поместить электрод сравнения в MEA камере. Deliver токи вольфрамового электрода, используя изолированный стимулятор, который управляется генератором импульсов.
2. Мозг Кусочек Приготовление
- Используйте мужские C57BL / 6J мышей, 4-8 недель. Дом животных в кондиционируемом помещении (21-23 ° C, 50% влажности; 12 ч / 12 ч цикл свет / темнота, включение света в 8:00) со свободным доступом к пище и воде.
- Возьмите 250 мл аликвоты ACSF, который был подготовлен в шаге 1.1, и поместите его в стакан, который содержит лед. В то же время, бесперебойного газоснабжения , который состоит из 95% O 2 и 5% CO 2.
- Хирургия
- Обезболить животное с 4% изофлуран в стаканекоробка в течение примерно 3 мин. После того, как животное достигает хирургической глубины анестезии (обозначается отсутствием ответа на носок щепотку), поместите его на мелком лоток, который наполнен дробленым льдом, и снимите головку с помощью ножниц.
- Выставляют череп, и обрезать оставшиеся мышцы. Далее, с помощью кусачек, отслаиваться дорсальную поверхность черепа от головного мозга. Срежьте боковые части черепа с помощью кусачек. Стерилизовать все хирургических инструментов с 75% -ным раствором этанола.
- С помощью шпателя, обрежьте обонятельные луковицы и нервные соединения вдоль вентральной поверхности мозга, и удалить мозг. После декапитации, быстро перевести мозг в химический стакан, наполненный охлажденным льдом насыщенной кислородом ACSF.
- Получение медиального таламуса (MT) -ACC мозга Кусочек
Примечание: Подготовьте кусочки , которые содержат путь от МТ к ACC 13. - Вырезаются вручную блок мозга с двумя сагиттальной порезов 2,0 мм сбоку от средней линии в каждом полушариидля отображения подкорковых анатомии. Затем сделайте две угловые пропилы. Сделайте первый перекрестное параллельно видимой волоконного тракта в стриатуме.
- Сделайте второй поперечный разрез от связи между мозжечком и зрительной коры к средней точке между передней спайки и зрительного тракта, которые являются вентральной и параллельно thalamocingulate пути.
- Прикрепите блок мозга к угловой пластине (~ 120 °) с цианакриловым клеем, и сделать разрез чуть выше точки поворота пути. Откиньте пластину, распрямите ее и приклеить ее на сцену камере vibratome.
- Сделать медиальной таламуса-ACC срезах мозга (500 мкм), а затем погружают их в ледяном кислородсодержащих aCSF.Transfer ломтики в записи камеры, и держать при температуре 32 ° С при непрерывной перфузии (12 мл / мин) с окисленной ACSF для 1 ч.
3. Подготовка перфузии камеры для многоэлектродная регистрирующей
- подготовкаперфузионной палаты
- Поместите MEA зонд на систему многоканальной, и использовать два отдельных полиэтиленовых труб для подключения зонда к перистальтического насоса. Используйте одну трубку для направления ACSF в MEA камеру и с другой трубкой, чтобы направлять ACSF из камеры. И, наконец, постоянно заливать препарат с теплой (29-30 ° С), насыщенной кислородом ACSF (8 мл / мин).
- Передача срез мозга в СМЭ. Удерживая срез мозга на СМЭ, используя влажную ватным тампоном. Тщательно перемещайте кусочек мозга, чтобы обеспечить АКК ориентирован над электродами.
- Используйте срез якорные наборы и прижимы нажать на срез мозга. Этот шаг обеспечивает хорошее электрическое соединение между электродами и срезе.
4. Генерация электрических полей с помощью DCS
Примечание: Определение ориентации электрического поля основывалась на направлении axodendritic оси в АСС. Ориентации дендритов и сомы отсеков былиподтверждено с помощью Гольджи окрашивания 12.
- Поместите электрод AgCl (определенный как анод) проксимальнее АКК, и поместить другой электрод (определенный в качестве катода) дистального к АСС. Запишите напряженность поля, которое создается двумя ориентациях поля (параллельно и перпендикулярно к axodendritic волокон АКК) по МЭС, и доставить токи электрических полей с использованием стимулятора.
- Закрепить расстояние электродов AgCl (около 1,5-2 см), а также настроить силу тока стимулятора, чтобы сделать DCS от 0,5 до 2 мА.
5. Электрически наведенные Ответы Кортикальная Synaptic
Примечание: индуцируют синаптические реакции в АКК электрической стимуляцией в МТ, в котором программируемый электрический генератор стимул производит прямоугольные двухфазные импульсы тока.
- Повторите раздел 3 выше.
- Поместите вольфрамовым электродом в МП, и выдавать импульсы от стимулятора к ТалеAMIC область срезов через биполярные вольфрамовые электроды.
- Используйте различные силы тока для определения порога, которое вызывает ответ ACC. При этом используют интенсивность ± 150 мкА и длительность 200 мкс, который стимулировали максимальный ответ 80% в АКК в большинстве срезов.
- Перемещение вольфрамового электрода вдоль thalamocingulate пути (от МТ к мозолистого тела) в срезе MT-ACC, чтобы получить оптимальные профили отклика.
- Сделайте 10-20 зачисток ответов АКК, и использовать программное обеспечение для автоматического усреднения всех АЦТ вызванной MT стимуляции. В результате ISS синаптических ответов в АКК, индуцированных с МТ стимуляции МТ-ACC пути.
6. Электрические индуцированный припадков, как активность
Примечание: припадков, как активность, индуцированный применением 4-аминопиридина (4-AP, 250 мкМ) и бикукуллин (5 мкМ). Предыдущие исследования времени контроля показали, что максимальные и стабильные ответы появились2-3 ч после применения препарата 14.
- Повторите Раздел 5 выше.
- Добавить наркотики в перфузионный раствор. С помощью 4-AP (250 мкМ) и бикукуллин (5 мкМ). Смешайте препараты равномерно, и продолжают перфузии в течение 2-3 ч.
- Для того, чтобы облегчить судорожный-подобную активность, поддерживать перфузионного насоса при относительно высокой скоростью перфузии (8 мл / мин), что также может помочь предотвратить нарастание градиента рН.
- Поместите вольфрамовым электродом в МП, и поставлять электрическую стимуляцию (150 мкА, 200 мкс длительность), чтобы получить профили отклика ACC.
- Сделайте 10-20 тралов и усреднить ответов.
- Заменить перфузионного раствора со свежим ACSF промывать наркотики. Повторите шаг 6.5.
7. Тестирование Влияние DCS на Вызванные корковых Ответы
- Повторите разделы 3 и 4. Убедитесь, что однородные электрические поля генерируются путем пропускания тока между двумя параллельными AgCl покрытыми серебряными проводами, которые расположены внутри МEA камеры. Если нет проблем, то DCS остается от 0,5 до 2 мА.
- Выключите DCS, и поместите вольфрамовый электрод для стимуляции таламуса (± 150 мкА, 200 мкс длительность). Для получения максимальных синаптические реакции в АКК, сделайте 10-20 тралов и усреднить ответов.
- Одновременно включите DCS (2 мВ / мм прочность DCS) и таламуса стимуляции (350 мкА, 200 мкс длительность). Оценить изменения амплитуды таламуса стимуляции-вызванной реакции ACC во время DCS.
- Выключите DCS, и добавить 4-AP (250 мкМ) и бикукуллин (5 мкМ) в перфузионный раствор. Затем подождите 2-3 ч. Когда наркотики влияют на срез мозга, срез производит корковых ответов припадков.
- Сделайте 10-20 зачисток АКК ответов, а затем измерить амплитуду и длительность электрических вызванных корковых ответов об изъятиях.
- После шага 7.5, одновременно включите DCS (2 мВ / мм DCS прочности) и таламуса стимуляции (150 мкА, 200 duratiна мксек). Оценка изменения амплитуды и длительности вызванных корковых реакций приступов во время применения DCS.
- Заменить перфузионного раствора со свежим ACSF промывать наркотики, и повторите шаги 7.2 и 7.3.
- Соберите все записи данных, и сгруппировать данные в различных экспериментальных условиях. Оценить амплитуду и длительность корковых ответов приступов при различных экспериментальных условиях.
Анализ 8. Данные
- С помощью программного обеспечения (например, MC Rack программное обеспечение) для автоматического усреднения записанных ответов, а также экспортировать исходные данные в электронную таблицу. Проанализировать амплитуду и длительность исходных данных и генерировать цветные рисунки.
- Для обнаружения колебательные судорожные события, используют программное обеспечение для измерения исходного значения и стандартные отклонения (SD). 3 Набор SD уровня шума в качестве порогового значения. Амплитуды пиков во время события колебаний, превосходящие этот порог автоматически обнаруживатьредактор
- Провести статистический анализ с использованием трет -TEST Стьюдента.
- Экспресс измерения и один из способов анализа дисперсии (ANOVA) результатов в тексте как среднее ± SE, с п указанием количества срезов изучили 12.