Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Новые Метрики к характеризации эмбриональных Удлинение нематоды

5.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53712

⸱

28 марта 2016 г.

 ,  , 
1Department of Chemistry, Pharmaqam, Université du Québec à Montréal

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы подробно описываем протоколы, специально разработанные для мониторинга морфогенных дефектов, возникающих на ранних и поздних стадиях эмбриональной элонгации нематоды Caenorhabditis elegans. В конечном счете, эти протоколы предназначены для идентификации генов, которые регулируют эти фазы, и для характеристики их дифференциальных потребностей вдоль передне-задней оси эмбриона.

Аннотация

Анализ сигнальных путей, которые контролируют изменение морфогенных процессов во время эмбрионального развития, требует надежных и чувствительных метрик. Эмбриональное удлинение нематоды Caenorhabditis elegans представляет собой позднюю стадию развития, состоящую из удлинения эмбриона вдоль его продольной оси. Эта стадия развития контролируется межклеточной коммуникацией между гиподермальными клетками и нижележащими мышцами стенки тела. Эти сигнальные механизмы контролируют морфологию гиподермальных клеток путем ремоделирования цитоскелета и межклеточных соединений. Измерение эмбриональной летальности и остановки развития на личиночных стадиях, а также изменение цитоскелета и структур межклеточной адгезии в гиподермальных и мышечных клетках являются классическими фенотипами, которые используются уже более 25 лет для анализа этих сигнальных путей. Недавние исследования потребовали разработки новых показателей, специально нацеленных на раннюю или позднюю элонгацию и характеризующих морфогенные дефекты вдоль передне-задней оси эмбриона. Здесь мы предоставляем подробные протоколы, позволяющие точно измерить длину и ширину удлиняющихся эмбрионов, а также длину синхронизированных личинок. Эти методы представляют собой полезные инструменты для идентификации генов, контролирующих элонгацию, для оценки того, контролируют ли эти гены как ранние, так и поздние фазы этой стадии и требуются ли они равномерно вдоль передне-задней оси эмбриона.

Введение

В течение почти 50 лет нематод Caenorhabditis Элеганс зарекомендовал себя как мощная модель для изучения важных вопросов в области развития, нейробиологии, эволюции, хозяин-патоген взаимодействий и т.д. 1 Сила этой модели в изучении развития заключается в: его короткого жизненного цикла от 3-х дней; легкость, с которой эти животные могут быть генетически изменены; его прозрачность, что позволяет наблюдать клетки перемещения и морфологии в живых животных и его развития, что в основном внематочная. Стадии развития нематоды включают эмбриогенеза и четыре личиночной стадии (L1 до L4), а затем во взрослую жизнь. Во время эмбрионального развития, эпидермальный морфогенез привлек значительное внимание на его способность дать возможность лучше понять, как эпителиальные клетки мигрируют в качестве группы, как они реорганизовать их соединений и изменять свою индивидуальную морфологию, а также их взаимное расположение в пределах функционального эпителия.Эпидермальный морфогенез делится на четыре этапа: спинной интеркаляции, состоящий в реорганизации спинные эпидермальных клеток, называют гиподермой; вентральной корпус, заключающийся в миграции брюшных гиподермальных клеток по направлению к вентральной срединной линии, таким образом, герметизирующей эмбриона в эпителиального клеточного монослоя; раннего и позднего Удлинение трансформации фасолевидных эмбриона в червеобразный личинок. Вслед за морфогенез, эмбрион люк и личинки начинают питаться L1 с использованием имеющихся бактерий в их непосредственном окружении.

Поэтому эмбриональных удлинение является поздней стадии эмбрионального развития. Она состоит из расширения зародыша вдоль его продольной оси, и уменьшение его поперечного диаметра. Это предполагает значительное изменение формы гиподермальных клеток. Удлинение делится на ранний и поздний фазы. Ранняя фаза начинается на стадии разделителями и заканчивается , когда стенки тела мышцы начинают договаривающиеся в 1,75 раза стадии шИСД типа (вес) эмбрионов - эмбрионов , соответствующие которые являются 1,75 раза в длине по сравнению с не-удлиненная эмбрионов. Морфогенетические процессы , происходящие на этой стадии, в основном за счет сокращения нитевидных актина пучков (FBS) , расположенных на апикальном полюсе гиподермальных клеток , которые управляют их удлинение вдоль передне-задней оси эмбриона 2. Сужение FBs является контроль с помощью фосфорилирования миозина свет цепи тремя киназ LET-502 / ROCK, MRCK-1 и ПАК-1 5. Поздняя стадия удлинения, начинается, когда стенки тела мышцы становятся функциональными и начинают сокращаться. Она включает в себя сигнализацию механотрансдукция от стенки тела мышц к спинному и брюшные гиподермальных клеток и заканчивается , когда животные люк 3.

Удлинение дефекты, как правило, характеризуются процент животных, умирающих эмбрионов (эмбриональной летальности; Emb) и те, арестовывая их развития как личинок L1 (фенотип личинок арест; Lvа) и быть значительно короче , чем вес. Определение стадии развития требует ареста микроскопического наблюдения мертвых эмбрионов и арестовал личинками 3-6.

Недавно было показано , что некоторые гены, такие как регулятор Cdc42 / Rac и эффекторной PIX-1 и пак-1, контролировать процессы морфогенные как во время раннего и позднего удлинения 3,7. Недавно мы также показали , что морфогенетические процессы отличаются вдоль передне-задней оси эмбрионов на ранних стадиях удлинения 3 7. Эти результаты побудили разработку новых показателей, конкретно ориентированных на ранних или поздних стадий удлинения и другие показатели, позволяющие характеристику морфологии эмбрионов вдоль их передне-задней оси во время раннего удлинения.

Эти новые методы состоят в измерении длины эмбрионов в начале и в конце раннего удлинения, а также ширины их онобъявления и хвосты. 7 Два протоколы были разработаны для измерения длины только что вылупившихся личинок, синхронизированный на L1 стадии 7.

В скорлупа из эмбрионов защищают их от щелочной обработки гипохлоритом в то время как личинки, взрослые и бактерии, присутствующие в культуральной среде растворены обработкой. Эта процедура затем используется для очистки эмбрионов из несинхронизированной населения , содержащей большинство сытых взрослых 8. Ограничение еды используется для синхронизации только что вылупившихся личинок. Измерение длины этих личинок затем используется для обнаружения дефектов удлинения. Это измерение предпочтительнее измерения задержанных в развитии личинок на культуральных планшетах, так как личинки, которые вылупляются из не полностью удлиненные эмбрионы могут восстановить до "нормальной длины" при кормлении, но будет поддерживать их уменьшенные размеры при задержании при отсутствии пищи.

Здесь мы приводим подробные протоколы, позволяющие измерение леngth из удлиняя эмбрионов, а также ширину их головы и хвоста, используя замедленную DIC микроскопии и анализа изображений (Протокол 1). Мы также предоставляем подробные протоколы для измерения длины синхронизированной личинок с использованием анализа изображений (Протокол 2) и проточной цитометрии (протокол 3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Характеристика раннего Дефекты Растяжимость в WT и мутантных животных

  1. Монтаж Эмбрионы для Normarski DIC микроскопии
    1. Подготовьте следующие питательные среды и материалы:
      1. М9 Буфер, растворить 12,8 г / л Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 3 г / л KH 2 PO 4, 5 г / л NaCl, 0,25 г / л MgSO 4 • 7H 2 O в дистиллированной воде и автоклав для стерилизации.
      2. NGM пластины, растворить 3 г / л NaCl, 16 г / л агара, 2,5 г / л bactopeptone в DDH 2 O. Автоклав и добавляют 1 мМ MgSO 4, 1 мМ CaCl 2, 1 мМ фосфатного буфера и 5 мкг / мл холестерина. Налейте 6 мл NGM за 60 мм блюд. Дайте среда затвердеть в течение 24 ч при комнатной температуре. Добавьте несколько капель насыщенного культуры Е. палочки OP50 бактерии выращивали в бульоне Лурия (LB). Пусть бактерии растут в течение 48 ч и хранить пластины при температуре 4 ° С.
      3. Для создания червя писк, крепление платиновой проволоки "диаметром 0,01 на короткий пипетки Пастера. Закрепите платиновый провод к оконечности стеклянной пипеткой путем нагревания этого конечность с бензольным горелкой. Свести оконечность проволоки, чтобы создать своего рода лопату.
    2. Grow штамм червя на 60 мм NGM пластин с OP50 при 20 ° C.
      Примечание: Термочувствительные аллели могут потребовать выращивания животных на непермиссивной температурах до 25.5 ° C. Плиты должны содержать много молодых людей, и еще много пищи для того, чтобы проводить протоколы.
    3. Поместите стекло микроскопа между двумя распорными горок , покрытых двумя слоями липкой лентой (Рис . 1А)
    4. Приготовьте 3% раствор агарозы (вес / объем) в буфере M9 путем растворения 0,6 г агарозы порошка в 20 мл M9 буфера путем нагревания в микроволновой печи в течение 30 сек. Дайте раствору остыть в течение 5 мин.
      Примечание: раствор агарозы может быть использован в течение нескольких дней после плавления в микроволновой печи. Этотакже могут быть аликвоты и хранили при температуре 4 ° С в течение нескольких недель.
    5. Поместите каплю горячей 3% раствора агарозы на предметном стекле, расположенный между двумя проставкой слайдами. Избегайте образования пузырьков.
    6. Быстро покрывают агарозы с другой слайд , как показано на рисунке 1В и нажмите вниз осторожно. Верхний слайд будет выравниваться агарозы капли и создать площадку с толщиной двух слоев липкой лентой.
    7. Разрешить агарозы, чтобы затвердеть в течение не менее 1 мин при комнатной температуре, или пока эмбрионы готовы к переходу на площадку.
    8. Использование червя выбор, передачи от 20 до 30 хорошо кормили молодых людей из NGM пластины в микро-центрифужную пробирку, содержащую 400 мкл буфера M9.
    9. Разрешить червей для осаждения под действием силы тяжести в течение приблизительно 5 мин и удалить супернатант с помощью микропипетки. Этот шаг призван устранить максимум бактерий отборных с нематодами.
    10. Добавьте 200 мкл буфера M9 в каждую пробирку.
    11. Использование пип ПастераEtte, передавать содержимое тубы (буфер и нематоды) на часовом стекле.
    12. Используйте один или два 25G 5/8 "иглы, чтобы отрезать животных на участке середины тела (между сперматекой и вульвы).
      Примечание: скальпелем также может быть использован в качестве альтернативы иглы (ов). Делайте это по плаванию нематод и может потребовать некоторой практики. Идея заключается в том, чтобы использовать иглы, как ножницами или ножом в зависимости, как используются много игл. После того, как животные разрезают, гермафродиты освободить их эмбрионов в буфер.
    13. Концентрат эмбрионов в центре часового стекла посредством создания кругового вихря в жидкости.
    14. Удалить большинство М9 с часового стекла с помощью микропипетки. Оставьте примерно 30 мкл M9 с эмбрионами.
    15. Удалить слайд , охватывающий агарозном площадку (рис 1B), сдвинув его с клавиатуры.
    16. Разрежьте площадку с лезвием бритвы для того, чтобы быть в состоянии полностью покрыть ее покровным (Рисунок 1C).
    17. С помощью пипетки Пастера перенести все эмбрионы (и червяк мусор) на агарозном площадку.
    18. Группа эмбрионы в центре площадки, используя ресничку приклеенный на конце наконечника, используемого для 200 мкл микропипетки.
    19. Медленно поместите покровное на площадку, избегая образования пузырьков и запечатать его.
      Примечание: Несколько шпатлевки можно использовать. Мы используем рисунок резинки найти в художественных и ремесленных магазинов (как правило, используется в качестве маскировки резинки для акварелью картины). Эта резинка используется, так как она является гидрофильным и застывает достаточно быстро и не токсичен для червей. Слайды также могут быть запечатаны с лаком для ногтей или VALAP (смесь из вазелина, ланолин и Парафиновые воска).
    20. Разрешить рисунок сухой резинки в течение примерно 15 мин.
  2. Запись Раннее Удлинение с использованием четырехмерных Normarski DIC микроскопии
    Примечание: Цель этого шага заключается в записи раннего удлинения от запятой до начала позднего удлинения- Определяется как момент, когда стенки тела мышцы начинают сокращаться. Мы также стремимся записать более одного эмбриона в то время. Восемь часов записи, как правило, требуется для записи раннего удлинения для группы несинхронизированных эмбрионов.
    1. Поместите смонтированный-слайд на сцене микроскопа. Убедитесь в том, что микроскоп оснащен 10X и 60X целей, а также DIC линзы, призмы, камеры и программное обеспечение захвата, позволяющих замедленную микроскопию и поколение Z-стеки (автоматизированная Z-платформы).
      Примечание: убедитесь, что температура постоянна от 20 до 23 ° С в помещении микроскопии. Камера нагрева охлаждения может потребоваться на столике микроскопа, особенно при использовании термочувствительных мутантов.
    2. Определить группу эмбрионов на стадии предварительного морфогенеза с использованием цели 10X.
    3. После обнаружения, соскальзывать цели 10X и добавить каплю масла погружения на слайде.
    4. Использование цели 60X, определить верхнюю и нижнюю часть еmbryos для настройки параметров обработки изображений Z-стека.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не стесняйтесь, чтобы установить Z-стек больше, чем толщина эмбрионов. Установите расстояние между двумя соседними плоскостями, как 0,8 мкм. Это позволит охватить полную глубину эмбрионов в 35 до 50 Z-планов.
      Примечание: Если микроскоп содержит автоматизированную платформу ху, эмбрионы, расположенных в разных местах площадки могут быть записаны одновременно. Для этого, запись ху координаты каждого места на площадке, который вы хотите проанализировать в ходе эксперимента. Убедитесь в том, чтобы выбрать ху при установке параметра записи и следить за остальными протокола, как указано. Тонкий Z-секционирование эмбриона во время записи не обязательно требуется для измерений, описанных в данном протоколе. Запись эмбриональное развитие и вес мутантных животных с максимальным разрешением, однако , хорошая практика, чтобы построить библиотеку записей , способных поддерживать дополнительные анализы.
    5. Задаватьвверх по прошествии времени с интервалом 2 мин между двумя приобретениями продолжительностью 8 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции будет зависеть от интенсивности света, установленного для микроскопа. Движение клеток во время раннего удлинения происходит очень медленно; воздействие времени может быть примерно один кадр в секунду или меньше. Если эмбрионы на ранних стадиях морфогенеза (спинные интеркаляционных, вентральный корпус), раннее удлинение будет регистрироваться в течение 1 часа. Убедитесь, что оптический затвор закрыт между каждым приобретением.
    6. Запустите приобретение и сохраните его.
  3. Измерение ранних дефектов Растяжимость с использованием анализа изображений
    1. Открытое программное обеспечение Фиджи-ImageJ ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
    2. В меню выберите Анализ / Set Измерения, выберите Периметр. Для каждого эмбриона, отрегулировать Z-шкалу масштаба , чтобы сосредоточиться на глотке эмбриона , как показано на рисунке 2А. Это будет гарантировать, что вы сосредоточены на центре эмбриона.
    3. Для измерения длины эмбриона, отрегулируйте шкалу масштаба времени , чтобы зародыш интерес в начале раннего удлинения (стадия запятой; Рисунок 2А). Обратите внимание на время ( "Time-начало").
    4. Выберите инструмент сегментированный линии. Draw сегментированный линию от кончика рта зародыша до кончика хвоста после средней линии эмбриона (фиг.2А). С помощью вкладки меню Analyze / Measure, получить длину нарисованной линии ( "длина начало").
    5. Повторите это измерение для того же самого эмбриона в конце раннего удлинения (момент, когда мышцы начинают сокращаться). Обратите внимание на время ( "Time-конец") и измерить длину эмбриона ( "Длина-конец") , как описано выше (рис 2В).
    6. Рассчитать продолжительность (D) раннего удлинения и увеличения длины (L) на этой стадии выглядит следующим образом:
      D = "Время-конец" - "Время-начало"
      & #160; L = "Длина-конец" - "Длина-начало"
    7. Для измерения ширины головы, отрегулируйте масштаб времени бар, чтобы эмбрион на стадии интереса (1,2-кратном стадии или в конце раннего удлинения). Выберите инструмент прямолинейный. Нарисуйте поперечная (спинно-вентральной оси) средней линии головы. Этот раздел является массивная часть зародыша (рис 2С). С помощью меню Analyze / Measure, получить длину линии, соответствующей ширине головки.
    8. В то же время точки, повторите этот шаг, рисуя поперечной средней линии хвоста (средней линии между кишечном клапаном и кончик хвоста; Рисунок 2C) и измерить его , чтобы получить ширину хвоста.
      Примечание: Используйте это измерение для сравнения эмбрионов на той же стадии через различные фенотипы. Для обеспечения воспроизводимости этого измерения, убедитесь, чтобы найти место, расположенный вокруг средней линии хвоста животного, которое может быть легко признан от одного животного кругой.
    9. Для расчета головы отношение ширины хвост, разделите ширину головки по ширине хвоста.

2. Характеристика позднего Растяжимость дефектов с использованием анализа изображений

  1. Синхронизация L1 Личинки с использованием щелочной гипохлорита Лечение
    1. Из не-голодали мм пластины 60, содержащей много Gravid взрослых, собирать все черви в микро-центрифужные пробирки путем промывки нематод от пластины с 1 мл буфера M9 с помощью пипетки Пастера.
    2. Засыпные нематоды при 3500 х г в течение 3 мин при комнатной температуре и удалить супернатант с помощью микропипетки, не мешая червячное гранулу.
    3. Добавьте 1 мл раствора гипохлорита в каждую пробирку (0,4 М гипохлорита, 0,5 М NaOH) и встряхивают в течение 3 мин.
      Примечание: щелочной раствор гипохлорита должны быть свежеприготовленной и эмбрионы в этом растворе следует осторожно перемешивают, но непрерывно оптимизировать растворение взрослых и оксигенации EMBRYos. Через 3 мин перемешивания, большинство взрослых должны освободить свои яйца в раствор.
    4. Спин при 3500 х г в течение 3 мин при комнатной температуре и быстро удалить супернатант с помощью микропипетки, не нарушая гранул.
    5. Промыть четыре раза по 1 мл буфера M9 с последующим центрифугированием при 3500 х г в течение 3 мин.
    6. После четвертой промывки удалите супернатант и ресуспендируют яйца в 700 мкл буфера M9 без пипетированием яйца (как яйца будут прилипать к пластику наконечника).
    7. Лента трубку на орбитальном шейкере 3 мм помещают в термостат при соответствующей температуре роста и встряхивают при 600 оборотах в минуту в течение ночи.
  2. Измерение длины синхронизированных Личинка
    1. Центрифуга задержанных в развитии личинок L1 при 3500 х г в течение 3 мин при комнатной температуре и удалить супернатант. Ресуспендируют личинок в 100 мкл буфера M9 и передавать их на агарозный площадку с помощью пипетки Пастера (агарозном колодки следует подготовитьd, как описано в разделе 1.1.2 к 1.1.8). Поместите покровное на площадку.
      Примечание: Прокладка не должна быть уплотнены резинку для этого эксперимента, который включает в себя короткий приобретение.
    2. Используйте 10X объективную и фазового контраста освещения для измерения длины личинок, если используется камера с высоким разрешением. Увеличение интенсивности света , чтобы иметь возможность захвата изображений в течение нескольких миллисекунд и , следовательно , получить четкую картину личинок (рис 2D).
      Примечание: В то время как плавательные Trashes личинок уменьшаются на агарозном площадку, они все еще движется. Таким образом, быстрая запись имеет важное значение для получения четкого изображения.
    3. Откройте Фиджи-ImageJ и повторите шаг 1.3.1. Для измерения длины личинок, выберите инструмент сегментированный линии. Draw сегментированный линию от кончика головы до кончика хвоста ниже средней линии личинок (рис 2D, правая панель).
    4. Использование меню Analyze / Measure, получить длину изнарисованная линия, соответствующая длине личинок в микрометр.

3. Характеристика позднего Растяжимость Дефекты Использование проточной цитометрии

  1. Синхронизировать личинок
    1. Очищают эмбрионов с использованием щелочной обработки гипохлорита, как описано в разделе 2.1 из полных 100 мм пластин сытых молодых людей, и пусть эмбрион люк и арест L1 в буфере M9 в течение 16 до 24 часов при 20 или 25,5 ° C в зависимости от штамма проанализированы.
      Примечание: Одна полная тарелка сытых взрослых на штамм является достаточным для анализа, описанного ниже.
  2. Калибровка Worm сортировщик
    Примечание: проточный цитометр, используемый здесь большой поток частиц цитометре (далее, шнекового сортировщик). Червь сортировщик включает в себя 670 нм красный лазерный диод, который находится в передней части детектора исчезновения. Червь сортировщик также содержит аргонового лазера многострочный для флуоресцентного возбуждения. В standard инструменты имеют три фотоумножители (ФЭУ) флуоресцентных детекторов, используемых для обнаружения выбросов флуоресценции в зеленых, желтых и красных областях спектра. В протоколе, описанном здесь, TOF, будет использоваться для измерения размеров личинок, красный канал будет использоваться для идентификации мертвых червей, которые будут окрашиваться пропидия йодида (PI). GP (общего назначения) Высокая флуоресценция управления Частицы используются для калибровки прибора и в качестве внутреннего контроля в нашем эксперименте проявлять высокую флуоресценцию в зеленый, желтый и красный. Они будут единственными объектами в анализируемом образце с высокой эмиссии, обнаруженного в зеленом канале и впоследствии будут определены на основе этой характеристики.
    Примечание: живые животные идентифицированы на основании отсутствия флуоресценции в канале зеленого и красного цвета, а также на ТОФ. Autofluorescent излучение из кишечника личинок не обнаруживается на стадии L1.
    1. Включите лазерный блок, компьютер, компрессор сd Червь сортировщика инструмент. Нажмите кнопку START на открытом сортировщик программного обеспечения червя, как указано в инструкции по эксплуатации прибора.
    2. Обратите внимание на всплывающее окно управления аргонового лазера. Выберите режим RUN и ждать, как лазерные силы достигают 10 ± 1 мВт. Выберите ГОТОВО в окне управления лазером.
    3. Установите оболочку и образец давления до 5.10 ± 0,02 и 5,51 ± 0,01 соответственно. Дайте давление уравновешиваться в течение не менее 15 мин и нажмите OK ДАВЛЕНИЕ флажок.
      Примечание: Скорость потока зависит от оболочки, и образец давления.
    4. Убедитесь в том, чтобы устранить все пузырьки, присутствующие в канальцах канале потока между чашкой образца и анализируемой камеры. Для этого нажмите Приобретать и аккуратно вылить трубочку, пока ни один пузырь не усваиваются (как видно в окне приобретения).
    5. Настройка всех параметров для люминесцентных ламп и TOF измерения и обнаружения следующим образом:
      1. Установите весы для TOF, Ext, зеленый, желтый и красный к256. усиления Установить , как описано в таблице 1. Набор PMT управления на 700 для зеленых и желтых тонов и до 900 для красного цвета.
        Примечание: Два фильтра возбуждения доступны (488 нм и 514 нм) и могут быть использованы для возбуждения либо зеленый флуоресцентный белок (GFP) или желтый флуоресцентный белок (YFP) или любой флуорохромии, возбуждаемые на этих длинах волн с многострочной аргонового лазера. Соответствующие фильтры должны быть вставлены в камеру фильтра оборудования. Мы использовали 488 нм фильтр для следующего эксперимента.
    6. Для калибровки червя сортировщик, выберите "Выполнить частицы управления" в меню инструментов. Поместите 20 мл 1x GP (общего назначения) высокой флюоресцентностью контроля частиц в чашке (эти частицы являются флуоресцентные частицы точного размера, проданные производителем цитометрии для калибровки их инструмент).
    7. Нажмите на кнопку, чтобы начать ACQUIRE оболочку и поток пробы.
      Примечание: Ожидать среднее связанное с распределением контроля частиц 21 ± 6 и переменном токеoefficient вариации вокруг этого среднего значения (CV) ≤11. Если CV является> 11 и среднее значение> 27 попытаться очистить канальцы, нажав несколько раз на кнопку чистой или щелкая канал потока.
  3. Приобретение TOF животных
    Примечание: Свет рассеивает, когда объект переходит в проточную кювету между лазерным источником и детектором экстинкции. Время, необходимое для света, чтобы быть рассеянной летающего объекта (время полета, TOF) используется для измерения осевой длины объекта. Степень света замаскированного объекта (угасание, EXT) используется в качестве меры его непрозрачностью / оптической плотности.
    1. Поместите 10 мкл синхронному дикого типа (вес) L1 в часовом стекле и оценить процент мертвых-яиц с использованием рассекает микроскопом.
      Примечание: Синхронное L1 отображения изображения с высоким Emb (выше 20%) в вес не следует использовать для дальнейшего анализа.
    2. Передача синхронизированы L1 от микроцентрифуге (аpproximately 700 мкл М9, содержащей L1) в 15 мл коническую пробирку. Добавить пропидий йодида (PI) в конечной концентрации 10 мкг / мл (разведение 1/100 от 1 мг / мл маточного раствора) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.
      Примечание: Мертвые яйца и личинки будут окрашивали PI и детектируется как высоко флуоресцирующих объектов с использованием красного канала.
    3. Добавьте 10 мл буфера для разбавления М9 запятнанные популяции. Возьмите 5 мл разведенной населения и развести их в четыре раза, добавляя 15 мл M9. Поместите это разбавление в чашку для образца.
    4. Запуск потока пробы, нажав ACQUIRE и наблюдать скорость потока.
      Примечание: Для того, чтобы иметь точные измерения, скорость потока должна оставаться между 15 и 25 объектов / сек.
    5. При необходимости, регулировать количество животных в чашке для достижения желаемой скорости потока.
      Примечание: Воля скорость потока зависит от давления (оболочка и образец), которые являются постоянными, как указано в пункте 3.2.3 и концентрации личинок Iп чашка. Если скорость потока превышает 25 объектов / сек добавить буфер в чашку. Если она ниже, чем 15 объектов / сек Добавить концентрированную L1 (от этапа 3.3.3) в чашке.
    6. После того, как соответствующая концентрация объекта достигается, оценить объем в чашку и добавить 1/4 тыс этого объема в растворе с высокой флуоресценцией GP управления Частицы 4x.
    7. Регулировка стробирования и параметров сортировки. Для этого нажмите кнопку "Создана память" в меню и выберите "TOF" vs. и "зеленых". Нажмите на ссылку "Сортировка" в меню и выберите "TOF против" и "красный". Gating и сортировочных графика будет выглядеть , как показано на рисунке 3А.
      Примечание: Это позволит визуализировать частиц управления (излучение в зеленый и красный), мертвые животные окрашивали PI и пузырьков (излучения в красном и не зеленый) и живых животных (без выбросов в ни зеленых , ни красных каналов) (рис 3A ).
    8. Запустите эксперимент, нажав AcqUIRE.
      Примечание: Для того, чтобы определить небольшие различия в размерах между личинками, анализировать около 10000 объектов, поэтому около 8000 животных. Остановить эксперимент и экспортировать данные в формате .txt, нажав на магазинных.
  4. Измерение относительного размера живых животных в синхронном группах населения
    1. Откройте файл .txt с помощью программного обеспечения, способного управлять большими таблицами данных.
    2. Из анализируемых объектов извлечения значения TOF, связанные с частицами управления, которые характеризуются излучением в зеленом канале выше, чем 100 условных единиц (это значение зависит от параметров, установленных в разделе 3.2.5). Создайте новый столбец и назовите его "частицы управления". Создайте столбец, содержащий все остальные объекты, за исключением частиц контрольных называемых "образец". Примечание: флуоресцентное излучение новых потребностей пакетных частиц необходимо проверить перед началом приобретения. Это позволит установить люминесцентную порог, позволяющий идентификациючастицы контроля над L1s.
    3. Для каждого анализируемого штамма идентифицировать часть эксперимента, в котором скорость потока был изменен (в связи с наличием вилки яиц, например). Для этого:
      1. Постройте TOF из "частиц управления" для каждого образца в качестве фактора времени (рис 3B).
      2. Нарисуйте линейную линию тренда с помощью инструмента трендовой линии и отобразить уравнение на графике.
        ПРИМЕЧАНИЕ: TOF частиц управления должно быть постоянным в течение долгого времени (горизонтальная линия, фигура 3В). Рассматривая уравнение линейного тренда , построенную на данных у = ах + Ь, убедитесь , что 'а' значение ниже, чем 10 -4. Все измерения, сделанные в пределах временных участков, отображающих разрыв в створе контрольной частицы должны быть удалены из анализа.
    4. Удалить мертвых эмбрионов и пузыри (эмиссия выше 15 в красный цвет), а также небольшие обломки и большие яичные пробки (TOF ниже 10 и высокаяэр чем 70 соответственно) от измерения 'образца'.
    5. Участок распределения частиц 'управления' для каждого штамма анализируемого. Как видно на рисунке 3С эти распределения должны перекрывать почти идеально. Это гарантирует, что измерения TOF, полученные для различных штаммов можно сравнить. Примечание: нормализация выборочных элементов TOF над частицами управления могут быть использованы, если распределения частиц контрольных в образце не накладывать с этим контрольных образцов. Нормализованная TOF вычисляются как следует:
      1. Нормализация TOF для генотипа G = (образец TOF для G) / (среднее 'управления' частиц TOF для G) х ( в среднем 'частиц управления' TOF для масс) , где вес является контрольным образцом.
    6. Участок распределение Личинки TOF для каждого штамма в том числе контрольного образца, в нашем случае вес животных (рис 3D). Измерение среднего значения и стандартная ошибка среднего (SEM) для каждой популяции ( Рисунок 5А и В).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Глава-, задка и Head / Хвост ширине прочны Метрики.

Описанные здесь протоколы были успешно использованы для характеристики функции регуляторов и эффекторов Rho GTPases PIX-1, пак-1 , и пусть-502 во время раннего удлинения 7. Пикс-1 и пак-1 код ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает новые метрики, чтобы охарактеризовать ранние и поздние фазы эмбрионального удлинения.

В разделе 1, важным шагом является потенциальное присутствие бактерий на площадке. Эмбрионы герметично заключены между колодкой и покровного во время захвата изображения. Уплотнительная слайд требуется, чтобы избежать высыхание животных во время приобретения, которая длится более двух часов. Насколько нам известно, ни один из пломбировочных материалов, используемых для крепления агар...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами от Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) Канады и Канадского фонда инноваций. Спасибо доктору Полу Мэйнсу (Университет Калгари, Калгари, Канада) за штамм let-502(sb118ts). Некоторые из штаммов были предоставлены Генетическим центром Caenorhabditis, который финансируется Управлением программ исследовательской инфраструктуры NIH (P40 OD010440).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Агар BioShopAGR001.500
AgaroseBioshopAGA001.500
CaCl2 (Хлорид кальция)Bio Basic Inc.CT1330
CholesterolSigma-aldrichC8667
Чистящее средство union Biometrica300-5072-000
Стеклянные покровные стеклаFisherbrand12-542B
Стеклянные стеклаFisherbrand12-552-3
Высокофлуоресцентные контрольные частицыunion Biometrica310-5071-001
K2HPO4 (фосфат калия, двухосновный)Bio Basic Inc.PB0447
K2HPO4 (фосфат калия, одноосновный)Bio Basic Inc.PB0445
MgSO4 (сульфат магния)Sigma-aldrich230391
Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic)Basic Inc.
NaCl (хлорид натрия)Bio Basic Inc.DB0483
Жевательная резинка Pebeo 45  млpé bé oPDG033000любом магазине для творчества и рукоделия
PeptoneBioShopPEP403.500
Буферный союз оболочкиBiometrica300-5070-100
COPAS Biosortunion Biometrica
Bio SDB0487

Ссылки

  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 387-407 (2015).
  2. Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo. Developmental biology. 117, 156-173 (1986).
  3. Zhang, H., et al. A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis. Nature. 471, 99-103 (2011).
  4. Diogon, M., et al. The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis. Development. 134, 2469-2479 (2007).
  5. Gally, C., et al. Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles. Development. 136, 3109-3119 (2009).
  6. Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase. Genetics. 156, 1671-1689 (2000).
  7. Martin, E., et al. pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans. PloS one. 9, e94684(2014).
  8. Sulston, J., Hodgkin, J. Methods. Wood, W. B. , 587-606 (1988).
  9. Andersen, E. C., et al. A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains. G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).
  10. Boulier, E. L., Jenna, S. Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry. Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).
  11. Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function. PLoS genetics. 10, e1004077(2014).
  12. Ramani, A. K., et al. The majority of animal genes are required for wild-type fitness. Cell. 148, 792-802 (2012).
  13. So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).
  14. Dineen, A., Gaudet, J. TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size. BMC developmental biology. 14, 43(2014).
  15. Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).
  16. Yu, Z., Yin, D., Deng, H. The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Таймлапс-микроскопияпроточная цитометрияанализ в ImageJZ-стековая визуализациясортировка червейокрашивание пропидиумйодидомизмерение ширины головыанализ длины личинок
Новые Метрики к характеризации эмбриональных Удлинение нематоды
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.