Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Высокая пропускная способность анализа, чтобы изучить яйцекладка предпочтений отдельных

7.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53716

⸱

24 марта 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurobiology, Duke University, 2Department of Pharmacology, Duke University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает высокопроизводительный анализ для проверки предпочтений Drosophila melanogaster в отношении откладывания яиц с разрешением для одного животного. Этот анализ обеспечивает простую, эффективную и масштабируемую платформу для идентификации генов и компонентов схем, которые контролируют простой процесс принятия решений.

Аннотация

В последнее время откладки яиц предпочтение дрозофилы стала генетически послушный модель для изучения нейронной основы простых процессов принятия решений. При выборе места для нанесения яйца, женщины-мухи способны ранжирования относительную привлекательность их вариантов и выбор "больше из двух товаров." Тем не менее, большинство яйцекладущие предпочтений анализы не практично, если кто-то хочет принять системный подход генетический скрининг для поиска схемы основе, лежащей в основе этого простого процесса принятия решений, так как они являются популяционном и трудоемкий в настройке. Чтобы увеличить пропускную способность изучения яйцекладущим предпочтений отдельных женщин, мы разработали специальные камеры, которые каждый из них может одновременно анализа яйцекладущие предпочтения до тридцати личности мух, а также протокол, который обеспечивает каждая самка имеет высокую скорость откладки яиц (так, что их предпочтения легко различимы и более убедительно). Наш подход прост для выполненияи производит очень стабильные результаты. Кроме того, эти камеры могут быть оснащены различными насадками, чтобы позволить видеозапись яйцекладки животных и поставить свет для исследований оптогенетика. В этой статье представлены чертежи для изготовления этих камер и порядок подготовки мух для анализа в этих камерах.

Введение

Drosophila melanogaster - это мощный генетический модельный организм для изучения нейронной основы поведения. Быстрое развитие генетических инструментов для целенаправленного манипулирования нейронами и появление сложных инструментов поведенческого анализа значительно улучшили нашу способность анализировать механизмы цепей, лежащие в основе процессов сенсомоторной трансформации нескольких врожденных и приобретенных форм поведения.

Откладывание яиц дрозофилой является подходящей моделью для изучения нейронной основы простых процессов принятия решений. В частности, было показано, что самки дрозофилы обладают способностью сравнивать и ранжировать свои варианты, прежде чем «принять» отложить яйцо на данный вариант4-8. Например, при получении только простого (без сахарозы) субстрата или только субстрата, содержащего сахарозу, самки с готовностью принимают любой вариант откладывания яиц. Однако, когда представлены оба варианта, самки устойчиво отторгают субстрат сахарозы в некоторых контекстах7,9,10. Тем не менее, относительно мало известно о нейронных механизмах, которые позволяют женщинам «выбирать большее из двух благ». Основным препятствием является отсутствие эффективного метода анализа предпочтений яйцекладки, который позволил бы использовать систематический генетический скрининг для изучения этой проблемы.

В этом отчете мы описываем разработанный нами протокол, который позволяет анализировать предпочтения самок в отношении яйцекладки с разрешением одного животного и со значительно улучшенной производительностью и согласованностью по сравнению с предыдущими методами. В частности, мы предоставляем чертежи для строительства камер, которые мы спроектировали, протокол подготовки самок к тому, чтобы каждая из них была готова отложить много яиц, и протокол использования камер.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка Мухи к быть проанализирован

  1. Культура летит на стандартных мелассы / кукурузной муки медиа в инкубатор при 25 ° C и 65% влажности. Будьте осторожны, чтобы не загромождать чаш. Например, положить 8 женщин и 6 мужчин в узкий флакон пищи.
    Примечание: "узкий флакон пищи", используемый здесь, имеет внутренний диаметр 2,3 см. Как правило, мы распределяли около 10 мл зольной пищи в каждый флакон. Рецепт муха пища, которую мы использовали описано здесь: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html.
  2. 2 - 3 дня после того, как самки Eclosion, готовят флаконы с добавлением свежего дрожжевого теста , как показано на рисунке 1E. Сделать свежие дрожжи, пасты путем смешивания 6 г активных дрожжей с 10 мл 0,5% -ного пропионовой кислоты. С помощью шпателя, чтобы применить дрожжевой пасты на боковине пищевых флаконов. Соберите 30 - 35 eclosed самки вместе с 20 - 25 мужчин в ампулах.
    1. В общем, собирать мужчин из тех же флаконах, где собираются самки(Так, чтобы сэкономить время и усилия). Тем не менее, если есть опасения по поводу фертильности мужчин, использование WT самцов вместо этого. Кроме того, дрожжи паста имеет важное значение для стимулирования производства яиц, поэтому готовить его свежий ежедневно.
  3. Поддерживать собранные самок / самцов, при 25 ° C, 65% влажности, если мухи не чувствительны к температуре.
  4. После ~ 4 - 5 дней, проверьте чаш, чтобы увидеть, если самки готовы к яйцекладущим экспериментов. Они готовы , когда поверхность пищевого среды мокрая от личинок активно роющему в пище (см рис 1E - F).
    Примечание: Женщины обычно удерживать откладывают яйца, как только еда поверхность становится влажной и кишит личинками. Этот шаг гарантирует , что женщины будут готовы выложить много яиц , когда они сталкиваются субстратов с желаемой текстуры (например., ~ 1% агарозы).

2. Камера Строительство, монтаж, настройка Анализ

  1. Есть машина магазин построить акриловые яйцекладка камеры (Fiфигура 1А - D). Инженерный чертеж различных частей были показаны в дополнительном рисунке 1. - 3 фотографии высокого разрешения можно найти здесь (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
  2. Вставьте пластиковые листы в погрузочной (сверху) части камеры , как показано на рисунке 1C. Это служит нижней поверхности во время загрузки летит в отдельных яйцекладущим аренах.
  3. Обезболить самок на CO 2 площадки и загружать их по отдельности в каждом яйцекладки арене. Разрешить ~ 30 мин для мух , чтобы оправиться от CO 2 и стать приспособились к новой среде.
  4. Подготовка агарозном субстратов.
    1. Для удобства держать Premade бутылку растопленного 1% агарозы в C водяной бане при 55 °.
    2. Добавьте необходимое количество раствора сахарозы запас (2 М) в 50 мл коническую пробирку, и смешивают его с соответствующим количеством агарозы. Например, для получения 150 мМ субстрата сахарозу, PLACE 750 мкл 2 М раствора сахарозы в пробирку, а затем заполнить трубку с агарозой до отметки 10 мл.
    3. Подготовьте обычную подложку таким же образом, но добавляют дистиллированную воду вместо раствора сахарозы.
      Примечание: Конечная концентрация агарозы в этом протоколе немного меньше, чем на 1%. По нашему опыту, точная концентрация агарозы не имеет значения, до тех пор пока она находится под контролем, чтобы быть в пределах ~ 0,9 - 1,1%, и что две подложки имеют одинаковую агарозном концентрации.
  5. Возьмем субстрат (нижняя) часть камеры и пипеткой 1000 мкл агарозном субстрата в каждую желобом , как показано на рисунке 1D.
  6. Разрешить агарозном затвердевать в течение ~ 30 мин.
  7. После агарозном субстраты и мухи будут готовы, собрать все три части камеры откладки яиц, а затем вынуть пластмассовые листы.
  8. Поместите камеры в золе инкубаторах.
    Примечание: Длина яйцекладущим экспериментов может варьироваться в зависимости от EXPErimental потребности. Как правило, мы запустить эксперимент O / N (14 - 16 ч). Кроме того, не наблюдалось значительного влияния циркадного времени на яйцекладущим предпочтений.
  9. Обезболить женщин путем введения CO 2 в камеру. Разберите камеру, удалите анестезированных мух в морге мух (то есть., Пустой кофе может заполнены с некоторыми кукурузного масла). Сфотографируйте результатов для ведения записей (см рисунок 2).
  10. Подсчитайте количество яиц вручную и вычислить привилегированные показатели для анализа. Вычислить индекс предпочтения как (N A - N б) / (N A + N б) где N а и N B представляют количество яиц на участке площадью по сравнению с сайта B, соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Яйцекладки камеры состоят из нескольких частей: подложку (нижний) кусок, разделитель (средний) часть, погрузочную (сверху) часть и 2 раздвижные двери (рис 1A - D). Эти части используются для установки независимо друг от друга мух и основы перед яйцекладущим экспериментов. Рисунок 1F показывает , как пузырьки должны выглядеть , когда женские мухи готовы к яйцекладки. Когда мухи дают выбор между простой подложкой и содержащей сахарозу субстрат, самки энерг...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Камеры и протоколы, описанные здесь, имеют ряд усовершенствований по сравнению с предыдущими яйцекладущим анализов. Во-первых, они повышают пропускную способность опробование предпочтения одиночных животных значительно. Каждая камера может пробирной 30 одиночных самок, и это занимает меньше часа, чтобы установить. Во-вторых, они повышают согласованность яйцекладущим предпочтений по сравнению с предыдущими методами. Стандартизация размеров арены, размер яйцекладущим подложек, а также расстояние между подложками облегчает...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Duke Physics Shop, особенно Фила Льюиса, за помощь в создании поведенческого аппарата и приспособлений, а также за создание рисунка. Эта работа финансируется Национальными институтами здравоохранения в рамках гранта No R01GM100027.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ультрачистая агароза Invitrogen16500-500
СахарозаSigmaS0389
Водяная баня Веб-камера Fisher15-462-6Q
LifeCam Cinema Веб-камераMicrosoftH5D-00013
Красные светодиодыCreeC503B-RAN-CA0B0AA1
Камеры для яйцекладкиИзготовленные
держатели для камерИзготовленные
на заказ держатели светодиодовИзготовленные на заказ
флаконы для мух (узкие)Генесея32-116 гг. до н.э
на заказ.

Ссылки

  1. Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
  2. Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
  3. Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
  4. Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
  5. Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436(2011).
  6. Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910(2012).
  7. Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
  8. Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
  9. Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335(2015).
  10. Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
  11. Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
  12. Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432(2015).
  13. Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
  14. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
  15. Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Drosophila
Высокая пропускная способность анализа, чтобы изучить яйцекладка предпочтений отдельных
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.