HSV-опосредованной Transgene экспрессия химерных конструктов для изучения поведенческой Функция GPCR гетеромеров у мышей

Галлюциногены, такие как ЛСД, псилоцибин и мескалин вызывают значительные изменения в сознании человека, познания и эмоций ^7-9. Инактивация серотонина 5-HT _2A рецепторов сигнализации либо генетических или фармакологических подходов вызывает заметно ослабляется поведенческие реакции на галлюциногены в обеих моделях грызунов ^3,10 и человека ^11. Несмотря на то, галлюциногены связывает другие подтипы рецепторов ^8, рецептор _2A 5-НТ считается необходимым для уникальной поведенческой активности этих химических веществ.

Группа II метаботропных глутаматных рецепторов (то есть., MGlu2 и mGlu3) стали объектом пристального внимания в отношении молекулярного механизма галлюциногенов и их интегральной роли , лежащей в основе психоз ^12. Ранее было показано, что у мышей, не имеющие экспрессии белка mGlu2 (mGlu2-KO мышей) не чувствительны к клеточных и поведенческих эффектов HALlucinogens ^5. Кроме того , было предложено , что 5-НТ _2А и mGlu2 рецепторы образуют специфический гетеромерных комплекс , через который серотонин и глутамат лиганды модулировать образец сочетания белков G в живых клетках ^1,2.

Конструктивно, трансмембранный (ТМ) домены 4 и 5 mGlu2 играют фундаментальную роль в формировании гетеромерного с 5-HT _2A рецепторов ^5. Кроме того, дальнейшее исследование показало , что три остатка , расположенных на внутриклеточном конце TM4 из mGlu2 необходимы для формирования 5-HT _2A -mGlu2 гетерокомплекса рецепторов в живых клетках ^6.

Основываясь на этих выводах , наблюдаемых в гетерологичных системах экспрессии, здесь мы опишем использование HSV-опосредованной экспрессии дикого типа mGlu2 и mGlu2 / mGlu3 химерных конструкций в лобной коре мышей mGlu2-KO , чтобы проверить , является ли гетеромерные образование между 5-HT _2A и mGlu2 необходимо дляповедение головы подергивание , индуцированный галлюциногенными агонистов рецептора _2A 5-HT.

Примечание: Все процедуры для животноводства и заботами были проведены в соответствии с регламентом Institutional Animal Care и использование комитета (IACUC) из Икан школы медицины на горе Синай. Обязательно используйте стерильные перчатки на протяжении всей процедуры.

1. Наркомания и Вирус Подготовка

1. Лекарственный препарат
   1. Готовят 15,0 мл кетамина / ксилазина анестезию путем растворения 1,35 мл 100 мг / мл кетамина и 0,75 мл 20 мг / мл ксилазина в 12,9 мл 0,9% физиологического раствора. Тщательно перемешать раствор.
2. Подготовка Вирус
   1. Клонирование mGlu2 и mGlu2ΔTM4N строит в бицистронный вирус простого герпеса (ВПГ) вектора следующие стандартные протоколы описаны ранее ^6. Пакет вирусных частиц , как описано ранее ^6,13,14. Замена остатков Ala-677 ^4.40, Ала-681 ^4,44 и ^4,48 Ala685 в mGlu2 для Ser686 ^4.40, PhE690 ^4,44 и Gly-694 ^4,48 в mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) были описаны ранее ^6.
      Примечание: Ранее было показано , что химерный конструкт HA-mGlu2ΔTM4N выражается в плазматической мембране с неповрежденными G белок-зависимой сигнализации ^6.
   2. Храните вирусные векторы в -80 ° C, когда он не используется. Оттепели вирусный вектор на льду, а затем аликвоту в 10 мкл аликвоты. Для хирургической процедуры, держать на льду.

2. хирургия

1. хирургия Подготовка
   1. Взвесьте мышь и впрыснуть мышь с соответствующей дозой кетамин / ксилазина коктейль (подробнее см 1.1.1).
   2. Проверьте мышь, чтобы увидеть, если правильно наркозом, выдавить ногу и хвост для ответа боли, если не в состоянии вызвать ответ, мышь правильно наркозом.
   3. Бритье головы мыши от основания черепа до кончика носа с помощью машинки для стрижки. Применить офтальмологических гель на аф мышиterward, чтобы предотвратить слепоту мыши.
   4. Загрузите каждый шприц на стереотаксической рамы. Затем наклонить перпендикулярную часть каждого плеча стереотаксической рамы таким образом, что они находятся на 10 градусов от нормали. Убедитесь, что оружие, наклонены таким образом, что иглы обращены друг к другу.
   5. Очистите каждый шприц, заполнив иглу с 70% этанола. Заполните иглу, по крайней мере три раза, чтобы убедиться, что шприц чист.
   6. После того , как игла была очищена, промойте иглу, заполнив иглу с двойным дистиллированной H ₂ O. После того, как покраснел, заполнить каждую иглу с 1,3 мкл бидистиллированной H ₂ O. Поверните поршень шприца , чтобы выпустить 0,3 мкл бидистиллированной H ₂ O. Если шарики воды на кончике иглы, тщательно вытереть воду. Если ничего не выходит из шприца, толкать поршень полностью вниз, а затем повторить чистку шприца.
   7. После заполнения водой, а затем подтянуть шприц, заполняющий шприц с0,5 мкл воздуха.
   8. После того, как воздух и вода в шприц, аккуратно заполнить шприц с 1,3 мкл раствора вируса. В этот момент убедитесь, что общий объем в шприце составляет 2,8 мкл. Снова скрутить кончик шприца, чтобы выпустить 0,3 мкл вируса. Если жидкость попала в шарики на острие иглы, тщательно вытрите жидкость. Если ничего не выходит из шприца, толкать поршень полностью вниз, а затем повторить чистку шприца.
2. Хирургия
   1. Подключите мышь к стереотаксической рамы, убедившись в том, чтобы настроить стереотаксической рамы, так что череп ровную горизонтальную поверхность. Применение povodine-йод на открытую кожу головы. Используя скальпель, сделайте сагиттальный разрез по средней линии черепа в открытой бритой области. Затем прикрепите Buret зажимы к коже в месте надреза, чтобы убедиться, что череп остается открытой.
   2. Используйте H ₂ O ₂ для растворения надкостницу , чтобы выставить швами из самыхчереп. Теперь, когда брегма и швы видны, не забудьте настроить стереотаксической рамы, чтобы убедиться, что череп является уровень.
   3. Совместите иглы кончики шприцы с темени и записывать координаты темени. Вычислить координаты, где иглы будут вставлены.
      1. Для плоскости Ростральная-Cauldal (RC), добавьте 1,6 мм к записанным координатам RC темени (+1.6 от брегмы). Для плоскости Спинной-вентральной (DV), вычесть 2,4 мм из записанных DV координат темени (-2,4 от брегмы).
      2. Наконец, для плоскости медиальной боковой (ML), добавьте 2,6 мм к записанным координатам ML темени (+2.6 от брегмы). Для всех координат не забудьте записать обе левые и правые координаты, так как это является двусторонним инъекции.
   4. Принесите иглы до нужных координат. Отметьте места, где иглы будут вставлены и с дрелью просверлить отмеченных областях.
   5. При помощи ватного наконечника аппликатора Wiпэ прочь любой избыток крови или костного фрагмента.
   6. Принесите иглы к черепу, где кончики игл прикасаясь к поверхности мозга. Затем опустите иглы до нужных координат медленно опуская их.
   7. После того, как иглы в нужных координат, медленно вводят содержимое шприца путем скручивания на поршень иглы 0,1 мкл в минуту в течение 5 мин (всего 0,5 мкл).
   8. После того, как инъекция была сделана оставить шприц в коре головного мозга в течение еще 5 мин.
3. Заделывая / Уход
   1. Удалите иглы из коры головного мозга мыши постоянно и медленно. Затем удалите мышь от стереотаксической рамы.
   2. Применяют Цианоакрилат (кожная клей) к базовым лоскутов кожи от разреза, а затем с пинцетом захватить лоскуты кожи и поместить их вместе.
   3. Дайте цианакриловый высохнуть. Поместите мышь в клетке над грелку (грелку не является обязательным, если Surgскую люкс выдерживают при комнатной температуре 37 ° С - в противном случае нет необходимости). Обязательно поместите мышь на бумажное полотенце, чтобы убедиться, что постельное белье не прилипает к операционному полю.
   4. В зависимости от продолжительности хирургической процедуры, убедитесь, что мышей из анестезии в течение 30 - 60 мин после процедуры. После операции животное помещают в его собственную клетку и контролировали, пока она не станет сознательным, прежде чем вернуться к своей комнате, чтобы восстановить. Нет анальгетики не используются после операции, так как они могут изменить результаты наших экспериментов, изменяя некоторые из мозговых биохимических путей. Тем не менее, животные контролируются, пока они не будут восстановлены после анестезии в день операции и ежедневно после операции на признаки инфекции и оценки боли / дистресса.

Эксперимент 3. Руководитель Twitch Response

1. Настроить
   1. Провести все поведенческие тестирование между 10:00 и 2:00 вечера, 2 - 3 дня после stereotaCTIC инъекции вирусных частиц.
   2. Растворите (±) -1- (2,5-диметокси-4-йодофенил) -2-аминопропана гидрохлорид (DOI) в 0,9% -ном солевом растворе до 2,0 мг / кг. Также готовят раствор 0,9% солевой.
   3. Приготовить домашнюю клетку (28 х 18 х 15 см) без каких-либо постельных принадлежностей и используя три-стручка, настроить камеру так, чтобы вид видеокамеры непосредственно над домашней клетки.
   4. Приучить мышей в комнате, по крайней мере 4 часа до начала эксперимента.
   5. Настройка видеокамеры для записи головы подергивание.
2. эксперимент
   1. Установите камеру так, чтобы она находилась непосредственно над домашней клетки. Калибруйте камеру так, чтобы вся домашняя клетка находится в поле зрения.
   2. Взвесьте мышь и впрыснуть мышь внутрибрюшинно с соответствующей дозой либо 0,9% физиологического раствора или DOI (0,01 мл / г). Примечание: Если мышь весит 25 грамм, администрировать дозы до общего объема 0,25 мл.
   3. Поместите каждую мышь обратно в их родной клетке Foг 10 мин. Через 10 минут, место мыши в центре пустого дома клетку и проверить, что нет белых пятен в поле зрения камеры. Нажмите запись на видеокамере. Покинуть комнату.
      Примечание: движения мыши и различные поведенческие реакции в них (... Голова дергаться, ухо царапин и т.д. Пожалуйста , обратитесь к справочной таблице 1 данных из Gonzalez-Maeso и др 2007 для полного списка поведенческих реакций , индуцированных DOI) ^3, будет записываться в течение 30 минут. Поэтому, важно нет белых пятен в поле зрения записано.
   4. Через 30 мин остановки записи на видеокамере и место мыши обратно в оригинальной домашней клетке. Повторите этот процесс для каждой мыши.
3. Обзор
   1. У каждого обзора рефери ленты закрывать глаза на экспериментальных условиях мыши (то есть., Лекарственные средства , используемые во время головы дергаются эксперимент или вирус , используемый при внутричерепной инъекции)). Ручная запись каждого голова дергается через вХаут видео.
      Примечание: Head-подергивание определяется как быстрое движение трясущейся головой, проведенного мыши (дополнительного видео).
   2. Для каждой мыши, в среднем окончательный ответ HTR из трех сумм слепых судей. Тогда группа эти значения условия эксперимента и провести статистический анализ (то есть., Т-критерия или ANOVA).

Предыдущие результаты показывают , что руководитель сокращающихся мышиный поведенческую реакцию надежно и энергично вызвавшую галлюциногенами, и он отсутствует в 5-HT 2A мышей -ko 3. Кроме того, было показано , что ответ голова сокращающихся вызванное галлюциногенными 5-HT 2A агонисты DOI и LSD было значительно снижено в mGlu2-KO мышей 5. Тем не менее, хотя предыдущие результаты убедительно показывают , что 5-HT 2A и mGlu2 собираются как гетеромерного комплекса в пробирке в трансфицированных клетках 1,2,15, ведет ли это конструктивное как таковой у живых мышей остались нерешенными. Чтобы полностью понять роль 5-HT 2A -mGlu2 гетерокомплекса рецепторов в психоактивные-подобных эффектов , вызываемых галлюциногенными агонистов рецептора 2A 5-НТ, экспрессия либо mGlu2 или mGlu2ΔTM4N в лобной коре мышей mGlu2-KO изучить ли эта Manipавляет регулирует поведение.

Мыши получали внутри- лобной коры головного мозга инъекции бицистронной HSV, выражающие зеленый флуоресцентный белок (GFP) и либо mGlu2 или mGlu2ΔTM4N или GFP в одиночку. Во- первых, было подтверждено , что вирус чрезмерно выражает mGlu2 или mGlu2ΔTM4N в мышином лобной коре (Фигуры 1А и 1В). Как показано ранее 5, поведение голова сокращающихся индуцируется DOI отсутствовала у мышей mGlu2-KO , инъецированных пустым вектором ВПГ-GFP. Следует отметить, что реакция голова сокращающихся индуцируется галлюциногенном 5-НТ 2А агониста DOI был спасен у мышей mGlu2-KO сверхэкспресирующим mGlu2, но не mGlu2ΔTM4N, в лобной коре по сравнению с таковой у животных , экспрессирующих GFP (фиг.1С). В совокупности эти данные свидетельствуют о том , что 5-HT 2A рецепторный комплекс -mGlu2 в лобной коре имеет решающее значение для регулирования психоз подобных состояний.

<p class="jove_content" fo:keep-together.within-страница = "1">
Рисунок 1. Выражение mGlu2 как рецептор гетерокомплекса. Выражение mGlu2 как рецептор с 5-HT 2A необходим для психозоподобные поведения , вызванных галлюциногенами. (А) представитель образ HSV-опосредованной экспрессии трансгена в лобной коре. HSV-mGlu2, который также выражает GFP, вводили в лобной коре, и экспрессия GFP была обнаружена иммуноцитохимию, масштаб бар, 200-мкм. (B) , ВПГ-опосредованной экспрессии трансгена в лобной коре мыши мышей mGlu2-KO, и анти-mGlu2 реактивность была измерена с помощью Вестерн - блоттинга. Специфичность первичного антитела против рецептора mGlu2 ранее была подтверждена в нокаутных мышей 6. Метаботропных глутаматных рецепторов, являются GPCR, которые образуют ковалентно связанные гомодимеры. Мы измерили иммунореактивность mGlu2 в качестве мономера (100 кДа) 6. (C </stronг>) Вирусный-опосредованной экспрессии mGlu2, но не mGlu2ΔTM4N, в лобной коре мышей mGlu2- KO значительно спасает реакцию головы дергаться, индуцированный галлюциногенного 5-НТ2А агониста DOI (п = 4 в каждой группе). *** Р <0,001; нс, не имеет существенного значения; постфактум тест Бонферрони в одну сторону ANOVA. Усы представляют собой SEM Рисунок был изменен с Морено и др (2012) 6. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Справочная Видео 1. Руководитель Twitch Response. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы загрузить). Мышей CD-1 WT вводили 2,0 мг / кг DOI и помещали в клетку (стена затемненными между двумя клетками) , чтобы вызвать реакцию головы дергаться (поведение вызывало после *).

Авторам нечего раскрывать.