Методическая статья

Иммунофлуоресценции Анализ эндогенные и экзогенные Центромера-кинетохор Белки

DOI:

10.3791/53732

⸱

3 марта 2016 г.

 , 
1Center for Childhood Cancer and Blood Diseases, Nationwide Children's Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы сообщаем о протоколах обнаружения эндогенных и экзогенных центромер-кинетохорных белков в клетках человека и количественно оцениваем эти уровни белков в центромер-кинетохорах путем непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием фиксации (фиксация параформальдегида, ацетона или метанола).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Центромеры" и "кинетохоры" относятся к участку, где хромосомы связываются с веретеном во время деления клетки. Прямая визуализация центромер-кинетохорных белков в течение клеточного цикла остается фундаментальным инструментом в исследовании механизма(ов) этих белков. Передовые методы визуализации во флуоресцентной микроскопии обеспечивают замечательное разрешение центромер-кинетохорных компонентов и позволяют непосредственно наблюдать специфические молекулярные компоненты центромер и кинетохор. Кроме того, методы непрямого иммунофлуоресцентного (IIF) окрашивания с использованием специфических антител имеют решающее значение для этих наблюдений. Однако, несмотря на многочисленные сообщения о протоколах IIF, мало кто подробно обсуждал проблемы специфических центромер-кинетохорных белков. 1-4 Здесь мы сообщаем об оптимизированных протоколах окрашивания эндогенных центромер-кинетохорных белков в клетках человека с использованием фиксации параформальдегида и окрашивания IIF. Кроме того, мы сообщаем о протоколах по обнаружению помеченных флагом экзогенных белков CENP-A в клетках человека, подвергшихся фиксации ацетоном или метанолом. Эти методы полезны для обнаружения и количественного определения эндогенных центромер-кинетохорных белков и белков CENP-A с мечкой Flag-метка, в том числе в клетках человека.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Центромеры" были классически определены как области подавленной мейоза рекомбинации в области генетики, а затем признается в качестве первичной перетяжки митотических хромосом, который играет существенную роль в точной сегрегации хромосом во время митоза. "Кинетохоры" были описаны как многослойными структурами, которые связываются с микротрубочками на поверхности центромеры, как показали с помощью электронной микроскопии; "Кинетохоры" позже были определены как макромолекулы комплекс, который локализуется на центромеры митотических хромосом. Несмотря на драматическое дивергенции центромерных ДНК-последовательностей среди позвоночных, структура и состав кинетохора высоко консервативны. Динамическое взаимодействие между микротрубочек веретена и кинетохорах необходим для верной сегрегации хромосом во время митоза, а также дефекты в центромерно-кинетохорной функции приводят к анеуплоидии и тем самым рака.

Центромеры в большинстве эукариотне имеет определенной последовательности ДНК, но состоит из больших массивов (0,3-5 Мб) повторяющейся alphoid ДНК, состоящей из 171 пар оснований α-сателлитной ДНК. За исключением почкующихся дрожжей, идентичность центромеры достигается не с помощью ДНК - последовательности , но при наличии специального нуклеосом , который содержит вариант гистона H3 CenH3 (центромерно Белок A [CENP-А] в организме человека). 5 нуклеосом CENP-A локализуются в внутренняя пластина кинетохоров млекопитающих 7 и связываются с 171 п.о. α-сателлитной ДНК. Активные центромеры требуют CENP-А-содержащий нуклеосомы направить набор конститутивного центромерной-ассоциированной сети (CCAN) и кинетохорных белков, которые вместе регулируют прикрепление хромосом к митотического веретена и последующей прогрессии цикла через контрольно-пропускной пункт шпинделя.

В свете приведенного выше доказательства, CENP-А было предложено быть эпигенетическое знак центромеры 8; Тем не менее, процесс, посредством которого CENP-А включена INto центромерная ДНК и факторы, ответственные за это включение еще не были хорошо охарактеризованы. Короткий центромерно таргетирования домен (CATD) находится в гистона раза область CENP-A, и замена соответствующей области H3 с CATD достаточно прямой Н3 к центромеры. 9 Несколько исследований предложили функциональные роли для пост-трансляционной модификация (PTM) из CENP-A 12-16; Однако, молекулярные механизмы этих PTMs из CENP-А в наборе к центромерах до сих пор не выяснены. Ранее мы сообщали , что лигазная активность CUL4A-RBX1-COPS8 E3 требуется для CENP-A K124 убиквитилирования и локализации CENP-А к центромеры. 17

Обнаружение и определение характеристик кинетохорных белков привели к новому пониманию о расхождении хромосом. 18 Более 100 компонентов кинетохор были идентифицированы в клетках позвоночных различными подходами. 19,20 недостаточномустоя , как Кинетохоры сборки и функция также исходит из характеристики клеточных функций каждого центромерной-кинетохора белки и белок-белок сети в клетках. 19 прямой визуализации и передовые визуализации методы флуоресцентной микроскопии обеспечивают замечательную разрешение центромерных-кинетохора компонентов и позволяют непосредственное наблюдение конкретных молекулярных компонентов центромер и кинетохор. Кроме того, методы косвенного иммунофлуоресцентного (ИМФ), окрашивание с использованием специфических антител имеют решающее значение для этих наблюдений. Тем не менее, несмотря на многочисленные сообщения о протоколах IIF, немногие подробно обсуждаются проблемы конкретных центромерных-кинетохора белков. 1-4 Таким образом, разработка и методы IIF окрашивания и количественного анализа IIF отчетности конкретно анализировать каждую центромер-кинетохора белок является чрезвычайно важным. В IIF окрашивания, следует исходить с протоколом окрашивания, чтобы избежать потери белка, представляющего интерес, илиостальная часть клетки. Тем не менее, фиксация разрушает антигенные сайты время от времени, а также различные комбинации антитело-антиген плохо работают с одним фиксирующим средством , но очень хорошо с другим, 21 и выборе закрепителя зависит в значительной степени от белка (белков) , представляющих интерес. Таким образом, различные методы закрепляющие играют решающую роль в IIF окрашивания центромерных-кинетохора белков.

Разработаны Здесь Оптимизированные методы косвенного иммунофлуоресцентного (IIF) окрашивания и анализе для устранения локализации эндогенных центромерных-кинетохора белков, в том числе Флаг-меченых экзогенных белков CENP-A CENP-А и и количественному этих белков в клетках человека. Эти методы могут быть применены к анализу центромерных-кинетохора белков у других видов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культура клеток и трансфекция

  1. Поместите покровное стекло (22 мм х 22 мм) в полистирольной пластины 6-луночного. Необязательно пальто защитное стекло с поли-L-лизин, 0,1% вес / объем, в воде (см Перечень материалов / оборудования), чтобы держать делящихся клеток на покровного стекла, выполнив следующие действия:
    Примечание: Оптимальные условия должны быть определены для каждой строки и применения клеток.
    1. Консерванта пальто культуры поверхность с поли-L-лизин, 0,1% вес / об, в воде (0,4 мл / лунку 6-луночного полистирола пластины). Rock осторожно, чтобы обеспечить равномерное покрытие поверхности культуры.
    2. Через 5 мин раствор удалить с помощью аспирации и тщательно промыть поверхность стерильным ткани сорта культуры воды.
    3. Сухой, по меньшей мере 2 ч до введения клеток и среды.
  2. Семенной HeLa клетки или HeLa 17 Tet-Off клетки 17,22 на покровное стекло (22 мм х 22 мм) положить в 6-луночный полистирола пластины. Убедитесь , что плотность клеток составляет 5,4 × 10 5 на лунку. культуры клетокв среде DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина.
    Примечание: Для получения оптимальных результатов, эмпирически определить плотность клеток для использования в посеве.
  3. Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% CO 2 в течение 18 часов.
    Примечание: В случае HeLa Tet-Off клеток, транскрипции экзогенного гена активен в отсутствие индуктора (т.е. тетрациклин / доксициклин) поэтому культура клетки без тетрациклина / доксициклин и трансфекцию скоротечно с сверхэкспрессией вектором pTRM4 (таблица 2 ), чьи транскрипции регулируется промотором TRE (см ниже).
  4. Восемнадцать часов после посева, трансфекции клеток следующим образом:
    1. Сделать раствор А путем смешивания 1,5 мкл миРНК олиго (20 мкМ отожженной запаса; Таблица 1) и / или 2,0 мкг плазмидной (Таблица 2) в 50 мкл восстановленного сыворотки среды (см Перечень материалов / оборудования), и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин ,
      Примечание: В этом анализе,СА-UTR миРНК (смесь 5 'и 3' UTR миРНК; Таблица 1) котрансфицируют для использования в протоколах 3 и 4 (см обсуждение).
    2. Сделать раствор B путем смешивания 0,75 мкл реагента для трансфекции I (см Перечень материалов / оборудования) в 50 мкл восстановленных сыворотки среду, и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
      Примечание: Необязательный шаг является добавление 1,0 мкл реагента для трансфекции II (см Перечень материалов / оборудования).
    3. Смешать растворы А и В вместе, и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин.
    4. Промыть культивируемые клетки один раз PBS, а затем добавляют 500 мкл уменьшенные сыворотки среды в каждую лунку 6-луночного полистирола пластины. Добавьте смесь растворов А и В (т.е. РНК и / или ДНК-липидный комплекс) непосредственно к каждому из отдельной скважины.
      Примечание: Конечная концентрация составляет 3,3 мкг / мл (плазмида); 50 нМ (миРНК).
    5. Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% CO 2 в течение 4,5 ч. Изменение среды с высоким содержанием глюкозы DMEM остроумияч 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина.
    6. Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% CO 2 в течение 48-72 ч после трансфекции.
      Примечание: Для получения оптимальных результатов, инкубационный период для роста клеток, прежде чем фиксации должны быть определены эмпирически, и истощение белка и / или выражение должно быть подтверждено с помощью Вестерн-блот-анализа (см Протокол № 6).
    7. Если анализ митотических клеток представляет интерес, добавьте паклитаксел (10 нМ) в культивируемых клетках через 24 часа до того фиксации, или добавить TN16 (0,5 мкМ) в культивируемые клетки 2,5 ч до того фиксации.

2. Cell Фиксирование и Иммунофлуоресцентного Окрашивание для обнаружения эндогенного Центромера-кинетохор Белки (параформальдегид Фиксации)

  1. Приготовление фиксаторов, буферы и реагенты.
    1. Свеже готовят 50 мл 4% -ного раствора параформальдегида в PBS, рН 7,4.
      1. Добавить 40 мл 1 × PBS в стеклянный стакан на мешалке в вытяжном шкафу. Тепло в то время как stirrinг до приблизительно 60 ° С. Добавьте 2 г параформальдегида порошка в нагретом PBS.
      2. Повышение медленно рН путем добавления 1 мл 1 N NaOH в общей сложности, потому что порошок не сразу растворяются.
        Примечание: Решение очищает после добавления NaOH.
      3. После того, как параформальдегид растворится, остудить и профильтровать раствор.
      4. Доводят рН с 1 N HCl до рН 7,4 и объем раствора с 1 × PBS до 50 мл.
        Примечание: Порции раствора могут быть заморожены или хранить при температуре 2-8 ° С в течение до тех пор, как 1 неделя. Раствор должен быть ледяным или хранили при 4 ° С до тех пор, пока не будет использоваться.
    2. Приготовьте 50 мл буфера KB1, который состоит из 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5; 150 мМ NaCl, 0,5% БСА; и 0,5% Тритон Х-100.
      Примечание: БСА должен быть свеже добавлен.
      Примечание: Буфер KB серии основаны на буфере KB , описанной в предыдущих докладах 1,2,4.
    3. Приготовьте 50 мл буфера KB2, который состоит из 10 мМ Трис-HCl,рН 7,5; 150 мМ NaCl, и 0,5% БСА.
      Примечание: БСА должен быть свеже добавлен.
    4. Подготовить 1 мл буфера, содержащего KB3 DAPI (50 нг / мл).
    5. Подготовьте 100 мл монтажной среды, которая состоит из 1 мг / мл п-фенилендиамин; 10% PBS и 90% глицерина.
      1. Доводят рН 1 × PBS до 9,8 с помощью 1 N NaOH, растворить п-фенилендиамин в растворе, а затем добавляют глицерин.
      2. Магазин 1 мл аликвоты при -80 ° С. Защита от света.
  2. Удалить культуральную среду путем аспирации через 48-72 ч после трансфекции (см Протокол 1) для фиксации клеток. Промойте клетки один раз PBS. Нанести PBS в сторону лунки с культурой, чтобы не мешать поверхности клеток.
    Примечание: Оптимальная точка времени для фиксации клеток должна быть определена эмпирически.
  3. Зафиксировать клетки, в 4% параформальдегид в PBS в течение 30 мин при температуре 4 ° С. Промойте клетки дважды буфера KB2 в достаточной мере удаления остаточного 4% параформальдегида.
  4. Permeabiатрических образцы в буфере KB1 в течение 30 мин при комнатной температуре. Промыть клетки один раз буфером KB2, и добавить буфер KB2 в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы дополнительный блок участков неспецифического связывания.
    Примечание: Буфер KB1 также в значительной степени способствует блокированию.
  5. Снимите защитное стекло (22 мм х 22 мм) из полистирола пластины 6-а с помощью щипцов. Используя гидрофобный барьер пера (см Перечень материалов / оборудования), нарисуйте бледно-зеленый квадрат или круг, чтобы сформировать гидрофобный барьер вокруг каждого образца покровного стекла. Не трогайте и не слишком близко к клеткам с гидрофобным барьерного пера. Поместите крышку стекла в новом 6-луночного полистирола пластины.
  6. Развести первичного антитела к центромеры или кинетохор белок (коэффициент разбавления 1: 100 до 1: 200, см также перечень материалов / оборудования) и либо анти-CENP-B антитела (коэффициент разбавления 1: 400) или анти- центромеры антител (АСА) (коэффициент разбавления 1: 2000) в качестве центромеры местоположение указателя буфере KB2.
    Примечание: Для получения оптимальных результатов, окончательный Concentraние первичного антитела в этом растворе должно быть определено эмпирически.
  7. Нанесите достаточный объем (приблизительно 30 мкл) разбавленного первичного антитела , чтобы погрузить образец клеток. Выдержите образец клеток в течение 1 ч при 37 ° С. Промойте клетки 3 раза буфером KB2.
  8. Использование буфера KB2, разбавленные флуорофор-конъюгированные вторичные антитела (коэффициент разбавления 1: 100 до 1: 200), направленный против каждого первичного антитела.
    Примечание: Для получения оптимальных результатов, конечная концентрация вторичного антитела в этом растворе должно быть определено эмпирически.
  9. Нанесите достаточный объем (падение примерно 30 мкл на покровного стекла) разбавленного вторичного антитела погрузить образец клеток. Выдержите образец клеток в течение 1 ч при 37 ° С. Прополощите клетки 5 раз буфером KB2 в течение периода 30 мин (пять 6 мин моет).
    Примечание: Для получения оптимальных результатов (т.е. для минимальной потери клеток), оптимальное условие стирки должно быть определено EmpiricaLLY.
  10. Нанесите достаточный объем буферной KB3, содержащей DAPI (50 нг / мл), чтобы погрузить образец клеток. Выдержите клеточного образца в течение 5 мин при комнатной температуре. Прополощите клетки 1-2 раза с буфером KB2.
  11. Установить защитное стекло, которое содержит образец клеток на микро слайд.
    1. Поместите каплю монтажа среды в центре микро слайд.
    2. Удалить жидкость из образца клеток и, с помощью рук или пинцета, поместить образец в центре микро слайд. Избегайте пузырьков воздуха.
    3. Удалите излишки монтажной среды с бумажным полотенцем.

3. Cell Фиксирование и Иммунофлуоресцентного Окрашивание C-концевой Flag-меченый CENP-A Белки (Ацетон Фиксации)

  1. подготовка
    1. Приготовьте ледяной 75% ацетона.
    2. Свеже готовят 50 мл PBS (рН 7,4), содержащем 0,5% обезжиренного молока и 0,5% бычьего сывороточного альбумина.
    3. Свеже готовят 50 мл PBS (рН 7,4), содержащего 0,1% обезжиренного молока и 0,1% бычьего сывороточного альбумина.
    4. Подготовить 1 мл PBS (рН 7,4), содержащий DAPI (50-100 нг / мл).
    5. Подготовьте 100 мл монтажной среды, как описано в 2.1.5.
  2. Удалить культуральную среду путем аспирации через 48-72 ч после трансфекции (см Протокол 1) для фиксации клеток. Промойте клетки один раз PBS. Применить PBS к стороне культуральную лунку, чтобы не мешать поверхности клеток.
    Примечание: Оптимальная точка времени для фиксации клеток должна быть определена эмпирически.
  3. Зафиксировать клетки в охлажденном на льду 75% ацетона, и инкубировать клетки в течение 10 мин при -20 ° С. Сухие клетки на покровного стекла в вытяжном шкафу в течение 30-60 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Для получения оптимальных результатов, продолжительность времени, необходимого для фиксации и клеточной сушки должна быть определена эмпирически.
  4. Используя гидрофобный барьер пера (см Перечень материалов / оборудования), нарисуйте бледно-зеленый квадрат или круг, чтобы сформировать гидрофобный барьер вокруг каждого образца покровного стекла. Не трогайте и не слишком близко к клеткам с гидрофобным барьерного пера.
  5. Блок nonspecIFIC сайты связывания на клетках добавлением PBS, содержащего 0,5% обезжиренного молока и 0,5% бычьего сывороточного альбумина в течение 5 мин при комнатной температуре.
  6. С помощью PBS, содержащего 0,1% обезжиренного молока и 0,1% бычьего сывороточного альбумина, разбавленные антитела анти-Flag (1: 1000 коэффициент разбавления) и либо анти-CENP-B-антитела (соотношение при разбавлении 1: 200) или ACA (соотношение 1: 2000 разбавление ) в качестве центромеры местоположения маркера.
    Примечание: Для получения оптимальных результатов, конечная концентрация первичного антитела в этом растворе должно быть определено эмпирически.
  7. Нанесите достаточный объем (приблизительно 30 мкл) разбавленного первичного антитела , чтобы погрузить образец клеток. Выдержите образец клеток в течение 1 ч при 37 ° С. Прополощите клетки 5 раз с блокирующим буфером в течение периода 30 мин.
    Примечание: Клетки могут быть промыты PBS. Для получения оптимальных результатов (то есть, чтобы избежать потери клеток), оптимальные условия промывки должны быть определены эмпирически.
  8. Развести флуорофора-конъюгированные вторичные антитела (коэффициент разбавления 1: 100 до 1: 200), направленный противЕАП первичное антитело в PBS, содержащем 0,1% обезжиренного молока и 0,1% бычьего сывороточного альбумина.
    Примечание: Для получения оптимальных результатов, конечная концентрация вторичного антитела в этом растворе должно быть определено эмпирически.
  9. Нанесите достаточный объем (приблизительно 30 мкл) разбавленного вторичного антитела , чтобы погрузить образец клеток. Выдержите образец клеток в течение 1 ч при 37 ° С. Прополощите клетки в 2 раза ФБР, содержащим 0,1% обезжиренного молока и 0,1% бычьего сывороточного альбумина.
    Примечание: PBS в одиночку, также может быть использован, чтобы промыть клетки.
  10. Нанесите достаточный объем PBS, содержащий DAPI (50-100 нг / мл), чтобы погрузить образец клеток. Выдержите клеточного образца в течение 5 мин при комнатной температуре. Прополощите клетки 1-2 раза с PBS.
  11. Установите крышку стекла, содержащего образец клеток на микро слайд, как описано в 2.11.

4. Cell Фиксирование и Иммунофлуоресцентного Окрашивание N-концевой Flag-меченый CENP-A Белки (Метанол Фиксации)

  1. подготовка
    1. Приготовьте ледяной метанола.
    2. Готовят TBS (рН 7,4), содержащего 4% сыворотки козьего.
    3. Подготовка 1 мл TBS (рН 7,4), содержащий DAPI (50-100 нг / мл).
    4. Подготовьте 100 мл монтажной среды, как описано в 2.1.5.
  2. Удалить культуральную среду путем аспирации через 48-72 ч после трансфекции (см Протокол 1) для фиксации клеток. Промойте клетки один раз с TBS. Применение TBS в сторону лунки с культурой, чтобы не мешать поверхности клеток.
    Примечание: Оптимальная точка времени для фиксации клеток должна быть определена эмпирически.
  3. Зафиксировать клетки, в охлажденном льдом метаноле, и инкубировать клетки в течение 6 мин при -20 ° С. Промойте клетки дважды TBS в достаточной мере удаления остаточного метанола.
  4. Используя гидрофобный барьер пера (см Перечень материалов / оборудования), нарисуйте бледно-зеленый квадрат или круг, чтобы создать гидрофобный барьер вокруг каждого образца покровного стекла. Не трогайте и не слишком близко к клеткам с гидрофобным барьерного пера.
  5. Блок неспецифические сайты связывания на КВЖДLs Добавив TBS, содержащим 4% сыворотки козы. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
  6. Развести антитело анти-Flag (1: 1000 разведение) и либо анти-CENP-B антитела (коэффициент разбавления 1: 200) или АСА (1: 2000 Коэффициент разбавления) в качестве центромеры местоположения маркера в TBS, содержащем 4% сыворотки козьего ,
    Примечание: Для получения оптимальных результатов, конечная концентрация первичного антитела в этом растворе должно быть определено эмпирически.
  7. Нанесите достаточный объем (приблизительно 30 мкл) разбавленного первичного антитела , чтобы погрузить образец клеток. Выдержите образец клеток в течение 1 ч при 37 ° С. Прополощите клетки 5 раз с блокирующим буфером в течение периода 30 мин. Для достижения оптимальных результатов (т.е. минимальной потерей клеток), оптимальное условие стирки должно быть определено опытным путем.
  8. Развести флуорофора-конъюгированные вторичные антитела (коэффициент разбавления 1: 100 до 1: 200), направленный против каждого первичного антитела в TBS, содержащем 4% сыворотки козьего.
    Примечание: Для получения оптимальных результатов, FINAл концентрация вторичного антитела в этом растворе должно быть определено эмпирически.
  9. Нанесите достаточный объем (приблизительно 30 мкл) разбавленного вторичного антитела , чтобы погрузить образец клеток. Выдержите образец клеток в течение 1 ч при 37 ° С. Промыть клетки 3 раза с блокирующим буфером.
  10. Нанесите достаточный объем TBS, содержащих DAPI (50-100 нг / мл), чтобы погрузить образец клеток. Выдержите клеточного образца в течение 5 мин при комнатной температуре. Прополощите клетки 1-2 раза с TBS.
  11. Установить защитное стекло, которое содержит образец клеток на микро слайд, как описано в 2.11.

5. Иммунофлуоресценции изображение для наблюдения, сбора, Количественный и анализ

  1. Обратите внимание на образец клеток с помощью моторизированного флуоресцентного микроскопа, оснащенного 63X и 100X иммерсионным объективом, внешний компактный источник света, и цифровой ПЗС-камеры.
  2. Выполнять сбор и обработку изображений, включая деконволюции, с помощью программного обеспеченияA, или Softwares В1 и В2 (см Перечень материалов / оборудования). Пожалуйста, смотрите Дополнительный код файлов (5.2.1) для всех команд, используемых в Software A. Для всех команд, используемых в Softwares В1 и В2, см (5.2.2) в дополнительные файлы кода.
  3. С помощью описанного выше метода 23-25 ​​для количественного определения сигналов центромерных-кинетохора белков (например, остальные сигналы CENP-A на центромеры) со следующими незначительными изменениями:
    1. Выберите область центромеры-кинетохора белков и фона следующим образом:
      1. Митотическое клеток: (центромерно-кинетохора область) Выберите область перекрытия с хромосомами окрашивали DAPI; (фоновая область) и область вне хромосом , но внутри идентичной одной клетки (т.е. цитозольного область).
      2. Interphase клеток: (центромерно-кинетохора область) Выберите область перекрытия с хроматином окрашивали DAPI; (Фоновая область) и область за пределами хроматина, но внутри идентичной одной ячейки ( т.е. цитозольная область).
        Примечание: Смотрите также Дополнительный код файлов (5.2.1.4.3) или (5.2.2.6.4) для выбора области с программным обеспечением A или Software В2 соответственно.
    2. Количественно процент оставшихся сигналов на центромерах с помощью программного обеспечения А или В. Для решения этой задачи, используйте следующую формулу:
      Остальные сигналы центромерно-кинетохорной белка в центромерной-кинетохорах
      figure-protocol-1
      где s является яркость сигнала выбранной области, что подтверждается ACA или окрашивания CENP-B; б является яркость фонового сигнала; г образца является эталонным ACA или CENP-B сигналы для миРНК (ов) -обработанной клеток; и г Ctrl является опорным ACA или сигналы CENP-B для Luc миРНК-трансфецированных клеток.
      Примечание: В этом анализе, CENP-B сигналы были использованы в качестве опорных сигналов для CUL4A и RBX1, как описано в предыдущих докладах.
    3. Используйте файл Excel для этого вычисления после копирования и вставки необработанных данных из программного обеспечения сигнала количественного описанного выше. Смотрите также дополнительные файлы Код: (5.2.1.4) и (5.2.2.6) для деталей. Одним из примеров расчета представлены в таблице 3.
  4. Анализ по меньшей мере, 20 клеток, чтобы исключить изменение окраски и получения изображений для каждого уровня измерения. Необязательно использовать "усредненное значение" оставшихся центромере-кинетохора сигналов для каждой анализируемой ячейки, чтобы сравнить эти значения между различными центромерных-кинетохора белков.

6. Вестерн-блот-анализ общего белка

  1. Ресуспендируют клеток в денатурирующем буфере А (20 мМ Трис-HCl, рН 7,4; 50 мМ NaCl, 0,5% Нонидет Р-40; 0,5% дезоксихолата, 0,5% ДСН, 1 мМ ЭДТА, и полный ЭДТА-свободный ингибитор протеазы коктейль), 26 при условии подвески к озвучивания и процесса замораживания-оттаивания, и мерыКонцентрации белка в следующем порядке:
    1. Для процесса обработки ультразвуком, добавить 50 мкл буфера А к клеткам, собранных из двух лунок полистирольной пластины 6-луночного через 48-72 ч после трансфекции (см Протокол 1). Эксплуатация на ультразвуковом оборудованного разлагателей рогом и микроострия (см Перечень материалов / оборудования) в течение всего 15 сек продолжительность прерывистого импульса (рабочий цикл 50%) в расчете на одну выборку.
    2. Для процесса замораживания-оттаивания, заморозить клетки с жидким азотом и размораживанию клеток при комнатной температуре.
    3. Измерение концентрации белка с использованием коммерческого анализа белка I реагента или II (см Перечень материалов / оборудования).
      Примечание: лизаты разводили соотношении 1:10 при измерении концентрации белка либо с I или II реагента. При этом разбавлении SDS присутствует в буфере А показывает, мало или вообще без помех в этом измерении.
  2. Смешайте лизата , содержащего 20-30 мкг общего белка с 2 × или 4 × SDS-PAGE буфера загрузки. 27 Закипите образцы для5 мин, а затем загрузить их на 12,0% -15.0% -ном денатурирующем ДСН-полиакриламидном геле для электрофореза.
  3. Перенос белков , разделенных SDS-PAGE на ПВДФ - мембрану с помощью Вестерн - блоттинга метод , описанный ранее. 17,24,27-31
    1. Блок сайты неспецифического связывания на мембране с помощью 5% молока обезжиренного в 1 × PBS, а затем инкубируют мембрану с растворами разбавленных первичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре. См Перечень материалов / оборудования для получения более подробной информации (например, коэффициент разбавления) каждого первичного антитела.
    2. После промывки мембрану 3-4 раза (каждый от 3 до 5 мин инкубации при встряхивании) с PBS-T-буфере (1 × PBS, и 0,1% твина-20), инкубирование мембраны в смеси в ближней инфракрасной области (ИК) флуоресцентный краситель-конъюгированные вторичные антитела (коэффициент разбавления 1: 20000), DyLight-конъюгированные вторичные антитела (коэффициент разбавления 1: 20000), и / или с пероксидазой хрена (HRP) вторичные антитела (разбавленный в PBS-T; dilutiна соотношении 1: 10000) в течение 1 ч при комнатной температуре. См Перечень материалов / оборудования для получения более подробной информации (например, коэффициент разбавления) каждого вторичного антитела.
  4. Вымойте мембраны 3 раза, а затем сканировать мембрану для анализа белков с инфракрасной системой визуализации и / или хемилюминесценции томографа для обнаружения иммуноблот (см Перечень материалов / оборудования).
    1. Для использования инфракрасной системы визуализации, см (6.4.1) в дополнительных файлов кода.
    2. Для использования хемилюминесценции тепловизора см (6.4.2) в дополнительные файлы кода. Используйте ультрачувствительный расширение Хемилюминесцентный (СТЭК) подложки (см Перечень материалов / оборудования) для этой системы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммунофлуоресценции анализ эндогенных CENP-A поддерживает гипотезу о том, что CUL4A-E3 лигаза требуется для локализации CENP-A к центромерах
Наши недавние исследования показали , что лигазная активность CUL4A-RBX1-COPS8 E3 требуется для убиквитилирования лизина 124 (K124) на CENP-А и локализации CENP-A к центромерах. 17 Первоначально интерфаза-центромерно комплекс (ICEN) был выделен анти-CENP-A: родной иммунопреципитация хроматина, 3...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние годы многие исследования были разработаны различные анализы количественной микроскопии для фиксированных клеток. 42 Прогресс в центромерно-кинетохорной биологии часто требует понимания центромерно-специфической или кинетохорной конкретной функции белков которых субклеточная пространственно-временное регулирование отражает изменение функции эти белки в течение клеточного цикла. Поэтому здесь мы разработали методы IIF окрашивания и количественного анализа IIF конкретно проанализировать относительные...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана NIH грант GM68418.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Липофектамин 2000Life Technologies/Invitrogen11668реагент для трансфекции I
Липофектамин RNAiMAXLife Technologies/Invitrogen13778реагент для трансфекции II
Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985Восстановленная среда для сыворотки, теплая при 37 °°; С водяной баней перед применением
ДМЭМ с высоким содержанием глюкозы (Dulbecco' s модифицированный Eagle' Life Technologies/BioWhittaker12-604DMEM с высоким содержанием глюкозы, теплый в 37 градусов; C водяная баня перед применением
Фетальная бычья сыворотка, сертифицированная, термоинактивированная, происхождение СШАLife Technologies/Gibco10082FBS (фетальная бычья сыворотка)
Поли-L-лизин РАСТВОРSIGMA-SLDRICHP 8920Поли-L-лизин, 0,1% вес./об., в воде
Ультрачистая дистиллированная водаLife Technologies/Invitrogen/Gibco10977Стерильная культура тканей в воде 
Микро защитное стекло (22 мм x 22 мм)Surgipath105Защитное стекло (22 мм x 22 мм)
6-луночный кластер клеточных культурFisher/Corning Incorporated07-200-836-луночная полистирольная пластина 
Пенициллин, стрептомицин; ЖидкостьFisher/Gibco15-140Пенициллин-стрептомицин
PAP PEN Сайтсвязывания AD100.1Гидрофобная барьерная ручка (для водоотталкивающего барьера при иммунофлуоресцентном окрашивании)
Паклитаксел (Таксол)SIGMA-SLDRICHT7402Таксол для анализа митотических клеток
TN-16, ингибитор микротрубочек (TN16)Enzo Life SciencesBML-T120TN16 для анализа митотических клеток
BSA (бычий сывороточный альбумин)SIGMA-SLDRICHA7906Блокирующий реагент
Triton X-100SIGMA-SLDRICHT8787Моющее средство для пермеабилизации
ПараформальдегидSIGMA-SLDRICHP6148Фиксирующий регант
DAPISIGMA-SLDRICHD9542Для ядерного окрашивания
-фенилендиаминSIGMA-SLDRICHP6001Для монтажа среды
VWR Micro Slides, матовыйVWR International48312-013Микрогорки 
Антитело против CENP-AStressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006Моноклональное антитело мыши; соотношение разведения 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)
Антитело против CENP-BNovus BiologicalsH00001059-B01PМоноклональное антитело мыши; коэффициент разведения 1:200 (IIF, фиксация метанола/ацетона)-1:400 (IIF, фиксация параформальдегида)
Антитело против CENP-B abcamab25734Кроличье поликлональное антитело; коэффициент разведения 1:200 (IIF, фиксация метанола/ацетона)-1:400 (IIF, фиксация параформальдегида)
Антицентромерные антитела (ACA)Fitzgerald Industries International, Inc.90C-CS1058Антисыворотка против центромеры человека; коэффициент разведения 1:2000 (IIF)
Антитело против CENP-HBethyl LaboratoriesBL1112 (A400-007A)Поликлональное антитело кролика; коэффициент разведения 1:200 (IIF)
Антитело против CENP-HBD612142моноклональное антитело мыши; коэффициент разведения 1:200 (IIF)
Антитело против CENP-IN/A, д-р Катусми Китагава N/A, д-рКатусми КитагаваКроличье поликлональное антитело; коэффициент разведения 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)
Антитело против KNL1Novus BiologicalsNBP1-89223Поликлональное антитело кролика; соотношение разведения 1:100 (IIF)Антитело
против Hec1Novus Biologicals / GeneTexNB 100-338 / GTX70268Моноклональное антитело мыши; коэффициент разведения 1:100 (IIF)
Антитело против Hec1GeneTexGTX110735поликлональное антитело Rabbit; коэффициент разведения 1:100 (IIF)
Антитело против Ska1abcamab46826Поликлональное антитело кролика; соотношение разведения 1:100 (IIF)
Антитело против флагаSIGMA-ALDRICHF3165Моноклональное антитело мыши; соотношение разведения 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Антитело против флагаSIGMA-ALDRICHF7425Поликлональное антитело кролика; соотношение разведения 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Антитело против CUL4A антителоН/А, Д-р Прадип РайчаудхуриН/А, Д-р Прадип РайчаудхуриКролик поликлональные антитела; коэффициент разведения 1:3000 (ВБ); Шиянов и др., Журнал биологической химии, 35309-35312 (1999)
Антитело против RBX1Cell Signaling4397Поликлональное антитело кролика; отношение разведения 1:2000 (WB)
Антитело против GAPDHChemiconMAB374Моноклональное антитело мыши; отношение разведения 1:5000 (WB)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies/InvitrogenA11001флуорофор-конъюгированное вторичное антитело (аффинно-очищенное вторичное антитело)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies/InvitrogenA11005флуорофор-конъюгированное вторичное антитело (аффинно очищенное вторичное антитело)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-rabbit IgGLife Technologies/InvitrogenA11008флуорофор-конъюгированное вторичное антитело (аффинно очищенное вторичное антитело)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgGLife Technologies/InvitrogenA11012флуорофор-конъюгированное вторичное антитело (аффинити-очищенное вторичное антитело)
Обезжиренное сухое молоко (одобренная замена сухого молока с гвоздикой)Fisher ScientificNC9255871 (Повторный заказ No 190915; Лот # 90629)
Моторизованный флуоресцентный микроскоп Leica DM IRE2 Моторизованный флуоресцентный микроскопLeica
HCX PL APO 63x масляный иммерсионный объективLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 МАСЛЯНЫЙ PH 3 CS63X масляный иммерсионный
объектив HCX PL APO 100x масляный иммерсионный объективLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE100X масляный иммерсионный объектив
Leica EL6000 компактный источник светаLeicaВнешний компактный источник света для флуоресцентного возбуждения
ORCA-R2 Цифровая ПЗС-камера Цифровая ПЗС-камераHamamatsuC10600-10B
Openlab версия 5.5.2 Программное обеспечение для научной визуализации Perkin Elmer/ImprovisionДля наблюдения, получения, количественной оценки и анализа изображений
Velocity версия 6.1.1 Программное обеспечение для анализа 3D-изображений Perkin Elmer/ImprovisionДля наблюдения, получения, количественного определения и анализа изображений
Полный коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТАRoche11873580001/11836170001Коктейль ингибиторов протеазы в таблетках
PlusOne 2-D Quant KitAmersham Biosciences80-6483-56Коммерческий реагент для анализа белка I для измерения концентрации белка (совместим с 2% SDS)
Bio-Rad Protein AssayBio-Rad500-0006Коммерческий реагент для анализа белка II для измерения концентрации белка (совместимый с 0,1% SDS)
Мембрана Immobilon-FLEMD MilliporeIPFL00010PVDF для переноса
IRDye 800CW Goat Anti-mouse IgGLI-COR Biosciences926-32210IR флуоресцентный краситель-конъюгированное вторичное антитело (аффинно очищенное вторичное антитело); коэффициент разведения 1:20000 (IIF)
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgGLI-COR Biosciences926-32221IR флуоресцентное вторичное антитело, конъюгированное с красителем (аффинно-очищенное вторичное антитело); коэффициент разведения 1:20000 (IIF)
козий анти-мышиный IgG DyLight 549Fisher ScientificPI35507DyLight-конъюгированное вторичное антителоIR флуоресцентное вторичное антитело, конъюгированное с красителем (аффинно-очищенное вторичное антитело); коэффициент разведения 1:20000 (IIF)
Goat anti-Rabbit DyLight 649Fisher ScientificPI35565DyLight-конъюгированное вторичное антителоIR флуоресцентное краситель-конъюгированное вторичное антитело (Affinity-очищенное вторичное антитело); коэффициент разведения 1:20000 (IIF)
Козье антимышиное IgG-HRPSanta CruzSC-2005HRP-конъюгированное вторичное антителоDyLight-конъюгированное вторичное антителоIR флуоресцентное красящее-конъюгированное вторичное антитело (Affinity-очищенное вторичное антитело антитела); коэффициент разведения 1:10000 (IIF)
Козий антикроличий IgG-HRPSanta CruzSC-2004HRP-конъюгированное вторичное антителоDyLight-конъюгированное вторичное антителоIR флуоресцентное красящее вторичное антитело (аффинно-очищенное вторичное антитело); коэффициент разведения 1:10000 (IIF)
Openlab версии 5.5.2. Программное обеспечение для научной визуализации Improvision/PerkinElmerSoftware A
Volocity version 6.3 Программное обеспечение для анализа 3D-изображений (Volocity Acquisition)PerkinElmerSoftware B1
Volocity version 6.3 Программное обеспечение для анализа 3D-изображений (Volocity Quantification)PerkinElmerSoftware B2
Branson SONIFIER 450 Sonifier 450
Ультразвуковой ультразвуковой аппарат Branson Microtip Step, Solid, Резьбовой 9,5 ммVWR Scientific Products Inc.  33995-325Разрушительный рупор для ультразвуковой обработки ультразвуком
Branson Ультразвуковой ультразвуковой аппарат Микронаконечник конический 6,5 ммVWR Scientific Products Inc.  33996-185Микронаконечник для ультразвуковой
инфракрасной визуализации Odyssey CLx LI-COR BiosciencesИнфракрасная система визуализации для иммуноблоттинга
Программное обеспечение для анализа Image Studio Ver 4.0 LI-COR BiosciencesSoftware C
Молекулярный имиджер Versadoc MP4000 System Bio-RadХемилюминесцентный томограф для обнаружения иммуноблоттинга
Number One 1-D программное обеспечение для анализа Bio-RadSoftware D
SuperSignal West Femto Подложка максимальной чувствительностиThermo34095Сверхчувствительная улучшенная хемилюминесцентная (ECL) подложка
   системы

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeLuca, J. G., et al. Hec1 and nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites. Molecular biology of the cell. 16, 519-531 (2005).
  2. Earnshaw, W. C., Halligan, N., Cooke, C., Rothfield, N. The kinetochore is part of the metaphase chromosome scaffold. J Cell Biol. 98, 352-357 (1984).
  3. Hoffman, D. B., Pearson, C. G., Yen, T. J., Howell, B. J., Salmon, E. D. Microtubule-dependent changes in assembly of microtubule motor proteins and mitotic spindle checkpoint proteins at PtK1 kinetochores. Molecular biology of the cell. 12, 1995-2009 (2001).
  4. Regnier, V., et al. CENP-A is required for accurate chromosome segregation and sustained kinetochore association of BubR1. Mol Cell Biol. 25, 3967-3981 (2005).
  5. Bernad, R., Sanchez, P., Losada, A. Epigenetic specification of centromeres by CENP-A. Exp Cell Res. 315, 3233-3241 (2009).
  6. Black, B. E., Cleveland, D. W. Epigenetic centromere propagation and the nature of CENP-a nucleosomes. Cell. 144, 471-479 (2011).
  7. Warburton, P. E., et al. Immunolocalization of CENP-A suggests a distinct nucleosome structure at the inner kinetochore plate of active centromeres. Curr Biol. 7, 901-904 (1997).
  8. Karpen, G. H., Allshire, R. C. The case for epigenetic effects on centromere identity and function. Trends Genet. 13, 489-496 (1997).
  9. Black, B. E., et al. Structural determinants for generating centromeric chromatin. Nature. 430, 578-582 (2004).
  10. Black, B. E., et al. Centromere identity maintained by nucleosomes assembled with histone H3 containing the CENP-A targeting domain. Mol Cell. 25, 309-322 (2007).
  11. Fachinetti, D., et al. A two-step mechanism for epigenetic specification of centromere identity and function. Nat Cell Biol. 15, 1056-1066 (2013).
  12. Zeitlin, S. G., Shelby, R. D., Sullivan, K. F. CENP-A is phosphorylated by Aurora B kinase and plays an unexpected role in completion of cytokinesis. The Journal of cell biology. 155, 1147-1157 (2001).
  13. Zhang, X., Li, X., Marshall, J. B., Zhong, C. X., Dawe, R. K. Phosphoserines on maize CENTROMERIC HISTONE H3 and histone H3 demarcate the centromere and pericentromere during chromosome segregation. The Plant cell. 17, 572-583 (2005).
  14. Goutte-Gattat, D., et al. Phosphorylation of the CENP-A amino-terminus in mitotic centromeric chromatin is required for kinetochore function. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8579-8584 (2013).
  15. Bailey, A. O., et al. Posttranslational modification of CENP-A influences the conformation of centromeric chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 11827-11832 (2013).
  16. Samel, A., Cuomo, A., Bonaldi, T., Ehrenhofer-Murray, A. E. Methylation of CenH3 arginine 37 regulates kinetochore integrity and chromosome segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9029-9034 (2012).
  17. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Dev Cell. , (2015).
  18. Chan, G. K., Liu, S. T., Yen, T. J. Kinetochore structure and function. Trends in cell biology. 15, 589-598 (2005).
  19. Hori, T., Okada, M., Maenaka, K., Fukagawa, T. CENP-O class proteins form a stable complex and are required for proper kinetochore function. Molecular biology of the cell. 19, 843-854 (2008).
  20. Fukagawa, T., Earnshaw, W. C. The centromere: chromatin foundation for the kinetochore machinery. Developmental cell. 30, 496-508 (2014).
  21. Kedersha, N. The Proteintech Blog.Proteintech. Grainger, D. , Proteintech Group. (2012).
  22. Clontech Laboratories, Inc. HeLa Tet-Off Advanced Cell Line. , Available from: http://www.clontech.com/CR/Products/Inducible_Systems/Tetracycline-Inducible_Expression/ibcGetAttachment.jsp?cItemId=26908&fileId=6712191&sitex=10020:22372:US (2012).
  23. Meraldi, P., Sorger, P. K. A dual role for Bub1 in the spindle checkpoint and chromosome congression. EMBO J. 24, 1621-1633 (2005).
  24. Niikura, Y., et al. 17-AAG, an Hsp90 inhibitor, causes kinetochore defects: a novel mechanism by which 17-AAG inhibits cell proliferation. Oncogene. 25, 4133-4146 (2006).
  25. Yang, Z., et al. Silencing mitosin induces misaligned chromosomes, premature chromosome decondensation before anaphase onset, and mitotic cell death. Mol Cell Biol. 25, 4062-4074 (2005).
  26. Wang, H., et al. Histone H3 and H4 ubiquitylation by the CUL4-DDB-ROC1 ubiquitin ligase facilitates cellular response to DNA damage. Mol Cell. 22, 383-394 (2006).
  27. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR? Trends Biochem Sci. 20, 257-259 (1995).
  28. Kitagawa, K., Skowyra, D., Elledge, S. J., Harper, J. W., Hieter, P. SGT1 encodes an essential component of the yeast kinetochore assembly pathway and a novel subunit of the SCF ubiquitin ligase complex. Mol Cell. 4, 21-33 (1999).
  29. Niikura, Y., Dixit, A., Scott, R., Perkins, G., Kitagawa, K. BUB1 mediation of caspase-independent mitotic death determines cell fate. J Cell Biol. 178, 283-296 (2007).
  30. Niikura, Y., Kitagawa, K. Identification of a novel splice variant: human SGT1B (SUGT1B). DNA Seq. 14, 436-441 (2003).
  31. Niikura, Y., Ogi, H., Kikuchi, K., Kitagawa, K. BUB3 that dissociates from BUB1 activates caspase-independent mitotic death (CIMD). Cell Death Differ. 17, 1011-1024 (2010).
  32. Ando, S., Yang, H., Nozaki, N., Okazaki, T., Yoda, K. CENP-A, -B, and -C chromatin complex that contains the I-type alpha-satellite array constitutes the prekinetochore in HeLa cells. Mol Cell Biol. 22, 2229-2241 (2002).
  33. Izuta, H., et al. Comprehensive analysis of the ICEN (Interphase Centromere Complex) components enriched in the CENP-A chromatin of human cells. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 11, 673-684 (2006).
  34. Obuse, C., et al. Proteomics analysis of the centromere complex from HeLa interphase cells: UV-damaged DNA binding protein 1 (DDB-1) is a component of the CEN-complex, while BMI-1 is transiently co-localized with the centromeric region in interphase. Genes Cells. 9, 105-120 (2004).
  35. Merlet, J., Burger, J., Gomes, J. E., Pintard, L. Regulation of cullin-RING E3 ubiquitin-ligases by neddylation and dimerization. Cell Mol Life Sci. 66, 1924-1938 (2009).
  36. Bennett, E. J., Rush, J., Gygi, S. P., Harper, J. W. Dynamics of cullin-RING ubiquitin ligase network revealed by systematic quantitative proteomics. Cell. 143, 951-965 (2010).
  37. Antonelli, A., et al. Efficient inhibition of macrophage TNF-alpha production upon targeted delivery of K48R ubiquitin. Br J Haematol. 104, 475-481 (1999).
  38. Codomo, C. A., Furuyama, T., Henikoff, S. CENP-A octamers do not confer a reduction in nucleosome height by AFM. Nat Struct Mol Biol. 21, 4-5 (2014).
  39. Thrower, J. S., Hoffman, L., Rechsteiner, M., Pickart, C. M. Recognition of the polyubiquitin proteolytic signal. The EMBO journal. 19, 94-102 (2000).
  40. Yoda, K., et al. Human centromere protein A (CENP-A) can replace histone H3 in nucleosome reconstitution in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 7266-7271 (2000).
  41. Shelby, R. D., Vafa, O., Sullivan, K. F. Assembly of CENP-A into centromeric chromatin requires a cooperative array of nucleosomal DNA contact sites. J Cell Biol. 136, 501-513 (1997).
  42. Majumder, S., Fisk, H. A. Quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes. J Vis Exp. , (2014).
  43. Masumoto, H., Masukata, H., Muro, Y., Nozaki, N., Okazaki, T. A human centromere antigen (CENP-B) interacts with a short specific sequence in alphoid DNA, a human centromeric satellite. J Cell Biol. 109, 1963-1973 (1989).
  44. Yoda, K., Kitagawa, K., Masumoto, H., Muro, Y., Okazaki, T. A human centromere protein, CENP-B, has a DNA binding domain containing four potential alpha helices at the NH2 terminus, which is separable from dimerizing activity. J Cell Biol. 119, 1413-1427 (1992).
  45. Sugata, N., et al. Human CENP-H multimers colocalize with CENP-A and CENP-C at active centromere--kinetochore complexes. Hum Mol Genet. 9, 2919-2926 (2000).
  46. Earnshaw, W. C., Ratrie, H. 3rd, Stetten, G. Visualization of centromere proteins CENP-B and CENP-C on a stable dicentric chromosome in cytological spreads. Chromosoma. 98, 1-12 (1989).
  47. Goshima, G., Kiyomitsu, T., Yoda, K., Yanagida, M. Human centromere chromatin protein hMis12, essential for equal segregation, is independent of CENP-A loading pathway. J Cell Biol. 160, 25-39 (2003).
  48. Liu, S. T., Rattner, J. B., Jablonski, S. A., Yen, T. J. Mapping the assembly pathways that specify formation of the trilaminar kinetochore plates in human cells. J Cell Biol. 175, 41-53 (2006).
  49. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. T time for point centromeres. Nat Cell Biol. 14, 559-561 (2012).
  50. Gascoigne, K. E., et al. Induced ectopic kinetochore assembly bypasses the requirement for CENP-A nucleosomes. Cell. 145, 410-422 (2011).
  51. Nishino, T., et al. CENP-T provides a structural platform for outer kinetochore assembly. EMBO J. 32, 424-436 (2013).
  52. Malvezzi, F., et al. A structural basis for kinetochore recruitment of the Ndc80 complex via two distinct centromere receptors. EMBO J. 32, 409-423 (2013).
  53. Schleiffer, A., et al. CENP-T proteins are conserved centromere receptors of the Ndc80 complex. Nat Cell Biol. 14, 604-613 (2012).
  54. Rago, F., Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Distinct organization and regulation of the outer kinetochore KMN network downstream of CENP-C and CENP-T. Curr Biol. 25, 671-677 (2015).
  55. Nishino, T., et al. CENP-T-W-S-X forms a unique centromeric chromatin structure with a histone-like fold. Cell. 148, 487-501 (2012).
  56. Bodor, D. L., et al. The quantitative architecture of centromeric chromatin. Elife. 3, e02137(2014).
  57. Oliver, C. Ch 58. Molecular Biomethods Handbook. Rapely, R., Walker, J. M. , Humana Press. 1063-1079 (2008).
  58. Terasima, T., Tolmach, L. J. Changes in x-ray sensitivity of HeLa cells during the division cycle. Nature. 190, 1210-1211 (1961).
  59. Levenson, G. B. R. Ch 8. Biomedical Photonics Handbook. Vo-Dinh, T. uan , CRC Press LLC. 8-19 (2003).
  60. Sanderson, J. Fluorescence bleed-though. , Available from: http://www.gum2012.fionastoreydesign.co.uk/Downloads/Bleed through text.pdf (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Immunofluorescence AnalysisCentromere Kinetochore ProteinsEndogenous Exogenous ProteinsParaformaldehyde FixationFlag tagged CENP AHuman Cell CultureIndirect Immunofluorescence StainingFluorescence MicroscopyProtein Localization QuantificationCell Fixation Protocol

Похожие статьи