Методическая статья

Использование Комбинированные методики для определения роли плазмалеммы доставкой в ​​Axon ветвление и морфогенеза нейронов

DOI:

10.3791/53743

⸱

16 марта 2016 г.

 ,  , 
1Curriculum in Neurobiology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Cell Biology and Physiology, The University of North Carolina at Chapel Hill

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы световой микроскопии в сочетании с биохимическими анализами выясняют участие SNARE-опосредованного экзоцитоза в нетрин-зависимом ветвлении аксонов. Эта комбинация методов позволяет идентифицировать молекулярные механизмы, контролирующие ветвление аксонов и изменение формы клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во время развития нейронов растущие аксоны расширяются до нескольких синаптических партнеров, развивая аксональные ветви. Ветвление аксонов стимулируется внеклеточными направляющими сигналами, такими как нетрин-1, и приводит к резкому увеличению площади поверхности плазматической мембраны аксона. Ветвление нетрин-1-зависимых аксонов, вероятно, связано с временным и пространственным контролем расширения плазматической мембраны, компоненты которой поставляются через слияние экзоцитарных везикул. Этим событиям слияния предшествует образование комплексов SNARE, содержащих v-SNARE, таких как VAMP2 (везикулоассоциированный мембранный белок 2), и t-SNAREs плазматической мембраны, синтаксин-1 и SNAP25 (синаптосомно-ассоциированный белок 25). Подробно описан многосторонний подход, используемый для изучения роли SNARE-опосредованного экзоцитоза в ветвлении аксонов. Сила комбинированного подхода заключается в получении данных с диапазоном пространственных и временных разрешений, начиная от динамики единичных событий слияния везикул в отдельных нейронах до формирования комплекса SNARE и ветвления аксонов в популяциях культивируемых нейронов. В этом протоколе используются установленные биохимические подходы к анализу уровней эндогенных комплексов SNARE и микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF) корковых нейронов, экспрессирующих VAMP2, помеченных pH-чувствительным GFP (VAMP2-pHlourin), для выявления нетрин-1-зависимых изменений экзоцитарной активности в отдельных нейронах. Чтобы выяснить время нетрин-1-зависимого ветвления, используется покадровая дифференциально-интерференционно-контрастная микроскопия (ДВС) отдельных нейронов в течение нескольких часов. Иммунофлуоресценция фиксированных клеток в сочетании с ботулиническими нейротоксинами, которые расщепляют механизм SNARE и блокируют экзоцитоз, демонстрирует, что нетрин-1-зависимое ветвление аксона требует SNARE-опосредованной экзоцитарной активности.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Последние оценки показывают, что человеческий мозг содержит 1011 нейронов с 1014 синаптическими связями1, что подчеркивает важность ветвления аксонов in vivo. Внеклеточные сигналы для аксонов, такие как нетрин-1, направляют аксоны к соответствующим синаптическим партнерам и стимулируют разветвление аксонов, тем самым увеличивая синаптическую емкость2-5. Нетрин-1-зависимая аксональная арборизация включает значительное расширение плазматической мембраны6, которое, как мы предположили, требует доставки дополнительных мембранных компонентов через комплексно-зависимое слияние экзоцитарных везикулSNARE 7.

Исследование роли SNARE-опосредованного экзоцитоза в нетрин-1-зависимом ветвлении аксона осложняется несколькими факторами. Во-первых, гетерогенность нейронов коры головного мозга увеличивает размер выборки, необходимый для выявления значимых эффектов, что усложняет методы обработки одиночных клеток, такие как визуализация. Во-вторых, хотя биохимические методы позволяют наблюдать за изменениями, происходящими на популяционном уровне, им не хватает временного и пространственного разрешения, необходимого для локализации расширения плазматической мембраны к аксону во временных рамках ветвления аксонов. Наконец, хотя ветви аксонов формируются в течение нескольких часов, клеточные изменения, способствующие расширению аксонов, могут начаться в течение нескольких минут и происходить в течение нескольких секунд, тем самым расширяя временные рамки для экспериментального рассмотрения.

Мы описываем многометодный подход, который обращается к этим разнообразным временным и пространственным масштабам экзоцитоза и ветвления аксонов и, таким образом, улучшает наше понимание фундаментальных клеточных механизмов. Использование этих подходов дает данные, подтверждающие критическую роль SNARE-опосредованного экзоцитоза в ветвлении аксонов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Постановка исследовательской этики: Все эксперименты с участием животных , описанные здесь, могут быть с правилами и положениями UNC комитета по уходу за животными и стандартам NIH по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Подготовка и покрытие диссоциированных корковых нейронов

  1. Эвтаназии приуроченные-беременных самок СО 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков. Удалить весь мозг из черепов эмбриональных день 15,5 (E15.5) мышей и microdissect кортикальных из каждого полушария. Для получения подробных инструкций относительно микродиссекции эмбрионального мозга мыши смотрите , пожалуйста Viesselmann и др 8.
  2. Поместите не более 4 в 1 кору мл рассекающих сред в стерильном 1,6 мл микропробирок. Добавьте 120 мкл 10х трипсина и переверните трубку 3 - 5 раз перемешать.
  3. С помощью гемоцитометра, подсчет клеток семян культуры клеток блюда. Примечание: 1 корковое полушарие обеспечивает окoximately три миллиона клеток.
    1. Для SNARE комплекса биохимического анализа SDS-резистентных, плиты шесть миллионов клеток на 35 мм блюдо и использовать два блюда на каждый вариант. Примечание: Это упрощается при использовании 6-луночные планшеты при сравнении нескольких условий.
    2. Для разветвлений анализов, нейроны пластина на азотную кислоту промывают круговыми покровные при плотности 250000 клеток на 35 мм чашку для DIC визуализации аксона ветвления пластины при плотности 150000. Эти плотности избежать переполненности и упростить анализ.
  4. Для живых клеток TIRF микроскопии, ресуспендирования два миллиона нейронов за трансфекцией в nucleofection растворе при комнатной температуре.
    1. Добавляют 100 мкл суспензии клеток в микропробирки , содержащей 10 мкг плазмиды экспрессии и электропорации VAMP2-pHlourin с Nucleofector в соответствии с протоколом производителя 9.
    2. После того, как трансфекцию немедленно добавить 500 мкл трипсина закалкой сред, удалить суспензию из кювет и пластинчатых клеток в берлогеплотность 400000 клеток на 35 мм стеклянной PDL покрытием нижней тарелки.
  5. Тарелка все нейроны коры в 2 мл бессывороточной среды.

2. SNARE комплекс Формирование Пробирной

Примечание: SDS-стойкие SNARE комплексы были обработаны и проанализированы как первоначально описано 10 с изменениями , подробно описанных ниже. Для проверенных альтернативных антител к тем, которые используются здесь, в разделе материалов.

  1. Стимулируют E15.5 корковых нейронов 2 дня в пробирке (DIV) с 250 нг / мл Netrin-1 или мнимого управления в течение 1 ч до лизиса.
  2. До обработки проб, охлаждают центрифуге до 4 ° C, установленная температура и водяной бане до 37 ° С, и тепло блока до 100 ° С.
  3. Удалить клеточные блюда из инкубатора и место на льду.
    1. Вытяжку средств массовой информации из клеток, заменить ~ 2 мл охлажденного льдом фосфатно-солевой буфер (PBS) нежно 2 раза в течение 1 - 2 мин на каждую промывку.
    2. Для этого теста с помощью 2 скважин в кондition.
    3. Отберите PBS от первой скважины состояния и заменить 250 мкл буфера для гомогенизации. Оставьте на льду в течение 5 мин, а затем с помощью мобильного толкатель, гомогенизацию клеток на льду.
    4. Аспирируйте PBS из следующей скважины того же условия и добавьте недавно гомогенизированной смеси в скважину. Это приведет к увеличению концентрации белка. Повторите эти действия для всех условий.
    5. После завершения пипетку гомогенизируют раствор до предварительно охлажденный 1,6 мл микропробирок на льду и добавляют 20% Тритон Х-100 до конечной концентрации 1% Тритон Х-100. Triturate смешать 10 раз с 1000 мкл пипетки при сведении к минимуму пузырьки.
  4. Инкубируйте пробирки на льду в течение 2 мин для солюбилизации белков. После инкубации Центрифуга в течение 10 мин при 6,010 RCF при 4 ° С до гранул, не солюбилизированный материал. Перемещение лизата супернатант в новую охлажденной 1,6 мл пробирку на льду.
  5. Выполнить анализ концентрации белка с использованием Бредфорда 11 и разбавленные образцы в FINAл концентрация белка в 3 - 5 мг / мл с оставшимся гомогенизацию буфера с добавлением 1% Тритон Х-100 и 5X буфера для образцов, дополненной B-Mercaptethanol (BME).
  6. Разделите каждый опытный образец равномерно в 2 пробирки. Выдержите один образец при температуре 37 ° С в течение 30 мин (SNARE комплексы), а другой при температуре 100 ° С в течение 30 мин (SNARE мономеров). Обратить трубки с перерывами, чтобы сохранить образцы в растворе.
  7. Замораживание образцов при -20 ° С до готовности разделить с помощью SDS-PAGE. Перед запуском образцов с помощью электрофореза с использованием стандартных методик, Reboil ранее вареных образцов в течение 5 мин при 100 ° С, но оттаивают 37 ° С образцов при комнатной температуре.
  8. Запуск дубликатами образцов (30 - 40 мкг белка на образец) на обоих 8% и 15% геле; 8% обеспечивает идеальное разделение комплекса, в то время как 15% используют для количественного определения SNARE белковых мономеров (SNAP-25 ~ 25kDa, VAMP2 ~ 18kDa, синтаксин-1 ~ 35kDa). Поддерживать источник питания на 70 V, пока линия красителя через НТККкороль геля и повышение напряжения до 90V. Запуск гели, пока краска не стекает.
  9. Чтобы сохранить мономеры, переносить белки на нитроцеллюлозную мембрану 0,2 мкм на льду с использованием буфера передачи холода с добавлением 20% -ного метанола (MeOH), при 70 В в течение 45 мин.
  10. Сухая мембрана в закрытой чашке в течение 2 ч до O / N при комнатной температуре (O / N обеспечивает лучшие результаты).
  11. Блок SNARE сложных мембран в 10% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  12. Подготовка первичных антител (распознающие специфические компоненты SNARE комплекс) в разведении 1: 1000 и зонда O / N при 4 ° С на ротационном шейкере.
    1. Промыть блотов в Трис буферным раствором плюс 0,1% Tween-20 (TBS-T) 3 раза в течение 5 минут каждый.
  13. Готовят флуоресцентные растворы вторичными антителами в разведении 1: 20000 в 1% БСА в TBS-T и зонд в течение 1 ч, охватываемого при комнатной температуре. Повторите шаг 2.12.1 после 1 ч.
  14. Изображение кляксы на флуоресцентной сканирования машины оснащены программным пакетом и количественно оцениваются как SNARE белка COmplex (иммунореактивных полос выше 40 кДа) и мономерных полосы (иммунореактивного полосы при 25 кДа, 18 кДа, 35 кДа для SNAP-25, VAMP2 и синтаксин-1, соответственно), используя инструкции производителя для рисования прямоугольных трансформирования.

3. Exocytic визуализации событий с помощью TIRF микроскопии

Примечание: Этот протокол требует специальной микроскопии оборудования , включая климатическую камеру для поддержания температуры, влажности и CO 2, инвертированный TIRF микроскоп , снабженный эпифлуоресцентной подсветкой, / высокой числовой апертурой (NA) TIRF цели высокого увеличения, автоматизированной стадии XYZ, и чувствительный прибор с зарядовой связью (CCD) детектор. Этот протокол использует полностью автоматизированный инвертированный микроскоп, снабженный 100x 1.49NA TIRF объективного твердого состояния 491 нм лазера и электронного умножителя CCD (EM-CCD). Все оборудование управляется с помощью получения изображения и управления лазером программного обеспечения. До начала питания протокол формирования изображения на Environmental камера, сцена, лампа, компьютер и фотоаппарат.

  1. Выберите цель в ПО для обработки изображений. После того, как цель находится в месте, закрепить объективный нагреватель вокруг воротника.
  2. Убедитесь, что цель полностью опущенной до обеспечения стадии инкубатора в пазу стадии. Залить дистиллированную воду в стадии инкубатора входные отверстия равномерно для предотвращения разлива.
  3. Включите систему инкубации. Откройте клапан в CO 2 бака и убедитесь , что давление соответствует системе , в соответствии с инструкциями изготовителя. Дайте камере из некоторое время , чтобы достичь 5% CO 2 и 37 ° C. Перед тем как добавить блюдо изображения, поместить пустое блюдо в инкубаторе, чтобы избежать конденсации воды на цели.
  4. Питание от источника лазерного излучения.
  5. Открытая сцена инкубатора и добавить масло погружения в объектив. Поместите образец в инкубатор и стабилизации с оружием стабильности или веса тарелки. Повысить цель, пока масло не вступает в контакт с нижней части образца. печ к проходящего света освещения и найти нейронную фокальной плоскости, проходящей через окуляры.
  6. Запустите лазерное программное обеспечение и подключить к программному обеспечению управления лазером. Установить подсветку Widefield и выбрать цель используется (100X 1,49 NA TIRF рекомендуется). Установка показателя преломления образца (клетки ~ 1,38). Регулировка интенсивности лазерного излучения, отключив "TTL" на 491 нм лазер. Установите ползунок 100 затем вернуть его обратно вниз до значения между 20 - 40%. Перепроверьте "TTL".
  7. Фокус на образце снова в проходящем свете освещения. Перейти к ПО для обработки изображений и выберите 491 нм лазерного излучения и открытого затвора. Точная настройка точки фокусировки лазера на потолке и в центре точки в центре замкнутого поля диафрагмы с конденсатором удалены. Поместите конденсатор вверх дном на оптической скамье, чтобы не поцарапать линзы.
  8. Заменить конденсатор и перейти к TIRF и настройка программного обеспечения глубины проникновения (PD) до 110 нм. Переход от Widefield освещения до TIRF IllumРежим минации для работы с изображениями.
  9. Найти VAMP2-phluorin, выражающую клетки через окуляры с использованием эпифлуоресцентной с широким полем зрения источника света эпифлуоресцентной.
    1. Настройте параметры изображения (время экспозиции, усиления и мощности лазера), чтобы максимально увеличить соотношение сигнал-шум и динамический диапазон, используя минимальное время экспозиции и интенсивность лазерного излучения, чтобы уменьшить фотообесцвечивания и фототоксичности (например: экспозиции между 50 - 100 мс, с 15 - 30 получить на 30% максимум мощности лазера).
    2. Установка непрерывной автоматической фокусировки на одну ячейку. Приобретают интервальной съемки изображение, установленное с приобретением происходит каждые 0,5 сек в течение 5 мин. Для вынужденного состояния Netrin-1, добавить 500 нг / мл Netrin-1 блюдо из клеток в ламинарный и вернуть блюдо в инкубаторе в течение 1 ч до визуализации.
  10. Для количественной оценки частоты exocytic событий , нормированные на единицу площади и времени ячейки, открытые стеки изображений в ImageJ путем перетаскивания файла в окно или перейдите в меню Файл> Открыть> Имя файла (рис0; 2А врезке 1).
    1. Для удаления устойчивых сигналов флуоресцентные, которые не представляют слияние пузырьков события, создают среднюю г проекцию всего стека с помощью Image> Стопка> Z-Project> Тип проекции: Средняя интенсивность. Вычтите это среднее изображение от каждого изображения в интервальной съемки с помощью процесса> Calculator Image> image1: ваш стек Операция: Вычтите image2 вновь созданный средняя проекция г. Это подчеркивает exocytic события (рис 2A Врезка 2 - 3).
    2. Граф exocytic слитые события на глаз. Exocytic события определяются как появление сигнала флуоресценции дифракционной расходимостью , который быстро диффундирует в качестве VAMP2-phluorin диффундирует в плазматической мембране (рис 2А Inset 6).
    3. С помощью команды Threshold для выделения первого изображения с помощью Image> Adjust> Threshold> отрегулируйте ползунок , пока вся ячейка не является порог выделенный (рисунок 2A Inset 7 - 8).
    4. Под Anaлизировать, выберите SetMeasurements и проверить область и метку дисплея. Выберите порогами сотовой области с помощью инструмента отслеживания палочки и нажмите на кнопку "М" для измерения (рис 2A Inset 7 - 8).
    5. Передача , как отсчитывать exocytic слитые события, измерения площади ячейки, а также время , прошедшее изображения в электронную таблицу для подсчета количества exocytic событий / мм 2 / времени (рис 2A Inset 9).

4. Дифференциальная интерференционного контраста (DIC) Timelapse микроскопия Axon ветвящихся

Примечание: Полный протокол и демонстрация для общего подхода к визуализации DIC доступно 12. Хотя этот протокол использует DIC, другие проходящем свете методы микроскопии могут быть использованы для тех же целей (например, фазовый контраст).

  1. На 2 DIV, место со стеклянным дном тарелки формирования изображения, содержащего нетрансфецированные нейроны в подогретого экологической камере для поддержания влажного окрironment с 5% CO 2 и 37 ° С. Использование микроскопа, оснащенного 60X Plan-Apochromat, 1.4 NA DIC объектива и высокой конденсатор NA для лучшего качества изображения и разрешение.
  2. Регулировка фокальной плоскости, чтобы найти нейроны через окуляры с использованием проходящего света освещения.
  3. Использование функции мультимиллионера приобретения область на ПО для обработки изображений, найти и сохранить места XYZ, по крайней мере, 6 ячеек. Расположите стадию так, что нейроны, представляющие интерес вписываются в поле зрения для достижения наилучших результатов.
    1. Стимулируют с 250 нг / мл Netrin-1 и нажмите кнопку 'начать мульти приобретения области. Последовательно получать изображения в каждой позиции через каждые 20 секунд в течение 24 часов, делая паузу приобретение и переориентацию по мере необходимости.
  4. Обзор изображений в ПО для обработки изображений с помощью Программы> Обзор многомерные данных> имя файла открытого. Определить стабильные аксонов ветви (20 мкм в длину), которые образуются во время сеанса визуализации. С помощью инструмента Линия вытяжки для измерения stableaxon Brancч от основания на аксона к наконечнику, чтобы обеспечить 20 мкм длина квалификации удовлетворяется.
    1. В таблице, запишите номер кадра после Netrin стимуляции, когда мембранные выступы инициируют в тех областях, где ветви позже форме, а также номер кадра после Netrin стимуляции, когда нарождающиеся ветви достигают 20 мкм в длину.
    2. Умножьте количество кадров между протрузии и формирования ветви на 20 сек, чтобы вычислить время формирования каждой ветви.

5. токсинного Манипуляции и фиксированной ячейки Immunofluoresence

  1. На 2 DIV, лечить нейроны в условиях эксперимента с 250 нг / мл Нетрин-1 и / или 10 нМ ботулинический токсин А (ботулотоксина А ), который расщепляет силки белка SNAP-25 и эффективно ингибирует опосредованную SNARE экзоцитоза 13, плюс 250 нг / мл netrin- 1. Оставьте один набор необработанных нейронов в качестве контрольной группы.
    ВНИМАНИЕ: ботулотоксина требует использования глаз и средств защиты органов дыхания при подготовке и использованиирешения. Поддерживать все загрязненные материалы, как и биологически опасными материалами автоклава как можно скорее.
  2. В 3 -х DIV (24 ч после обработки) аспирата средств массовой информации, и немедленно заменить, по меньшей мере , 1 мл ФЭУ FIX (см таблицу 1 для деталей) нагревали до 37 ° С. Инкубировать в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре.
  3. Промыть 3 раза с PBS (для будущего использования печати с парафином и хранить при температуре 4 ° С).
  4. Место покровные в темном, увлажненной камере окрашивания и проницаемыми клеточные мембраны в течение 10 мин в свеже разбавленного 0,2% Тритон Х-100 в PBS (получен с 10% Тритон Х-100 штока).
  5. Удалить пермеабилизирующего раствор и промыть 50 мкл 1x с PBS. Блок в течение 30 мин в ~ 50 мкл 10% бычьим сывороточным альбумином в PBS (BSA-PBS), или 10% Вареный Donkey сыворотки в PBS при комнатной температуре.
  6. Полоскание с 1x PBS снова. Инкубируйте покровные в 50 мкл первичного антитела (1: 1000 βIII тубулина, чтобы подтвердить идентичность нейронную) в 1% BSA-PBS в течение 1 ч при комнатной температуре, во тьме.
  7. Выполните 3x 5 мин промывок в PBS. Инкубируйте покровные в 50 мкл спектрально-различных вторичных антител для тубулина (1: 400) и флуоресцентного фаллоидином (варьируется в зависимости от возбуждения: 488 фаллоидином в соотношении 1: 400, 647 фаллоидином в соотношении 1: 100) в 1% BSA-PBS в течение 1 ч ,
  8. Вымойте 3x 5 мин в 1x PBS и смонтировать покровные на слайды в монтажных средах.
  9. Вакуумный избыток монтажа средств массовой информации от краев покровного и печатью с прозрачным лаком для ногтей.
  10. Сбор Widefield изображения эпифлуоресцентной на инвертированный микроскоп с объективом 40X 1.4NA, эпифлуоресцентной возможностей и EM-CCD.
    1. Вручную анализировать ветвления с помощью ImageJ. Открытые стеки изображений в ImageJ путем перетаскивания файла в окно или перейдите в меню Файл> Открыть> Имя файла (рис 4A Врезка 1).
    2. Используя линию> сегментированный линию, проследить аксона, определяемый как самый длинный нейритов , простирающейся от сомы (рис 4A врезке 2 - 3).
    3. Использование Анализ> Инструменты> Диспетчер ROI, сохранить аксона трассировку в интересующей области. Трассировка и сохранить каждую ветвь аксона, определяемой как аксонов ≥20 мкм в длину. Только основные ветви (наросты непосредственно отростков аксона) в анализе (рис 4A врезке 3 - 4).
    4. Нажмите 'M' для измерения сохраненных областей, представляющих интерес, и передавать длину в пикселях в электронную таблицу для расчета длины в мкм.
    5. Разделить количество аксонов ветвей ≥20 мкм в длину, по длине аксона в мкм, деленный на 100, чтобы получить число аксонов ответвлений на длине 100 мкм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование в пробирке биохимических методов для анализа количества SDS-устойчивых комплексов SNARE в популяции нейронов. На рисунке 1 показан результат Вестерн - блот после завершения SDS-стойкого SNARE комплекса анализа зондировали SNAP-25, syntaxin1A и VAMP2.

TIRF микроскопия на мембране базальных клеток обеспечивает высокое разрешение изображения отдельных exocytic слитых событий в одиночных кам...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ветвление аксонов является фундаментальным процессом нейроразвития и лежит в основе обширной нейросвязи нервной системы млекопитающих. Понимание механизмов, участвующих в локализованном расширении плазматической мембраны, является неотъемлемой частью нашего понимания как нормального, так и патологического развития нервной системы. Использование многостороннего подхода, включающего методологии как на уровне популяции, так и на уровне отдельных клеток, улучшает воспроизводимость и увеличивает пространственное и временное р...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья: RO1-GM108970 (SLG) и F31-NS087837 (CW).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
6-луночные обработанные тканевые культуры планшетыOlympus Plastics25-105
стеклянные покровные стеклаFisher scientific12-545-8112CIR-1.5; должны быть обработаны азотной кислотой в течение 24 часов, промыты в деионизированной воде 2x и высушены перед использованием. Должен быть покрыт 1 мг/мл поли-d-лизином и промыт перед нанесением покрытий на клетки.
Амакса нуклеофекционный растворLonzaVPG-1001100 мл/трансфекция
Амакса Нуклеофектор/электропораторLonzaprogram O-005
35 мм Стеклянное дно Чашки для визуализации живых клетокMatek Corporationp356-1.5-14-Cдолжны быть покрыты 1 мг/мл поли-d-лизином и промыты перед нанесением покрытия на клетки
Olympus IX81-ZDC2 инвертированный микроскопOlympus
Лямбда LS ксеноновая лампаSutter Instruments Company
Environmental Stage топ-инкубаторTokai Hit
100x 1.49 NA TIRF объективOlympus
Andor iXon EM-CCDAndor
Odyssey Licor Инфракрасная система визуализацииLI-COROdyssey CL-XИспользуется для сканирования блотов
Image studio программный комплексLI-CORиспользуется для сканирования на инфракрасной системе Odyssey; Image studio lite используется для автономного анализа блоттинга
Metamorph for OlympusMolecular devices, LLCверсия 7.7.6.0Программное обеспечение используется для всей визуализации и анализа покадровой съемки DIC
CELL TIRF программное обеспечениеOlympusПрограммное обеспечение используется для управления лазерами для визуализации TIRF
Фиджи (Image J)NIHImageJ Version 1.49t
60x Plan Apochromat 1.4 NA объективOlympus
40x 1.4 NA План Апохромат объективOlympus
Нейробазальные средыGIBCO21103-049Базовый раствор для бессывороточных и трипсиновых гасящих сред
Добавка B27GIBCO17504-044500 мл/50 мл Сыворотка без сыворотки и среда для гашения трипсина
L-глутамин35050-0611 мл/50 мл Сыворотка без сыворотки
Бычий сывороточный альбуминBio Basic Incorporated9048-46-810% раствор в 1x PBS для блокировки покровных покрытий; 5% раствор в TBS-T для блокирования нитроцеллюлозных мембран.
10x  ТрипсинSigma59427C
HEPESCELLGRO25-060-Cl
Фосфатный буферный физиологический раствор Дульбекко (DPBS)+ Ca + MgCorning21-030-см
Фетальная бычья сывороткаCorning/CELLGRO35-010-CV
Сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS)Corning/CELLGRO20-021-CV
NaClFisher scientificBP358-10
EGTAFisher scientificCAS67-42-5
MgCl2Fisher scientificBP214-500
TRIS HClSigmaT5941-500
TRIS baseFisher scientificBP152-5
N-пропилгаллатMP Biomedicals102747
Глицерин фотометрический сортAcros Organics18469-5000
Глицерин (не оптический класс)Fisher scientificCAS56-81-5
B-меркаптоэтональныйFisher ScientificBP176-100
SDSFisher scientificBP166-500
Дистиллированная вода GIBCO152340-147
Поли-D-лизинSigmap-7886Растворенный в стерильной воде в концентрации 1 мг/мл
Токсин ботулотоксина А BoNTAList Биологические лаборатории128-A
Кролик поликлональный античеловеческий VAMP2Клеточная сигнализация11829
Мышиный моноклональный антикрысиный Синтаксин1АСанта-Круз Биотехнологияsc-12736
Козий поликлональный античеловеческий SNAP-25Santa Cruz Biotechnologysc-7538
Мышиный моноклональный античеловеческий &бета; III-тубулин CovanceMMS-435P
Alexa Fluor 568 и Alexa Fluor 488 фаллоидин, или Alexa Fluor 647Invitrogen
LI-COR IR-dye вторичные антителаLI-CORP/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022800 ослик против мыши, 680 осел против кролика, 680 осел против козы
0.2 μ m размер пор нитроцеллюлозная мембранаBiorad9004-70-0
Tween-20Fisher scientificBP337-500
МетанолFisher ScientificS25426A
Бромпфенол Blue SigmaB5525-5G
СахарозаFisher scientificS6-212
ПараформальдегидFisher scientificO-4042-500
Triton-X100Fisher scientificBP151-500
TEMEDFisher scientificBP150-20
40% бис-акрилилимидFisher scientificBP1408-1
НазваниеCompanyКаталожный номер<strong>Комментарии
Alternative Validated Антитела
Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 клонSigma AldrichS0664
  Мышиный моноклональный Synaptobrevin 2 (VAMP2)Synaptic Systems104-211
Мышиный моноклональный SNAP25Synaptic Systems111-011

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drachman, D. A. Do we have brain to spare? Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).
  2. Serafini, T., et al. Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
  3. Métin, C., Deléglise, D., Serafini, T., Kennedy, T. E., Tessier-Lavigne, M. A role for netrin-1 in the guidance of cortical efferents. Development. 124 (24), 5063-5074 (1997).
  4. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  5. Sun, K. L. W., Correia, J. P., Kennedy, T. E. Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions. Development. 138 (11), 2153-2169 (2011).
  6. Pfenninger, K. H. Plasma membrane expansion: a neuron's Herculean task. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 251-261 (2009).
  7. Winkle, C. C., McClain, L. M., Valtschanoff, J. G., Park, C. S., Maglione, C., Gupton, S. L. A novel Netrin-1-sensitive mechanism promotes local SNARE-mediated exocytosis during axon branching. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 217-232 (2014).
  8. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  10. Hayashi, T., et al. Synaptic vesicle membrane fusion complex: action of clostridial neurotoxins on assembly. The EMBO Journal. 13 (21), 5051-5061 (1994).
  11. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  12. Centonze Frohlich, V. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
  13. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365 (6442), 160-163 (1993).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Axon BranchingNeuronal MorphogenesisSNARE Mediated ExocytosisTIRF MicroscopyVAMP2 pHlourinDIC ImagingWestern BlotBotulinum ToxinNetrin 1 StimulationCortical Neurons

Похожие статьи