Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ LINE-1 ретротранспозиции на уровне одного ядра

8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53753

⸱

23 апреля 2016 г.

 , 
1Division of Pulmonary, Allergy, Critical Care and Sleep Medicine, University of Arizona College of Medicine, 2Center for Applied Genetics and Genomic Medicine, University of Arizona College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы используем методологию FISH для отслеживания LINE-1 ретротранспозиции на одном уровне ядер в хромосомных спредов клеточных линий HepG2 , стабильно экспрессирующих синтетический LINE-1.

Аннотация

Длинно перемежающийся ядерный элемент-1 (Line-1 или L1) составляет примерно 17% ДНК, присутствующей в геноме человека. В то время как большинство L1s неактивны из-за 5'-усечений, ~80-100 из этих элементов остаются ретротранспозиционными и распространяются в различные места по всему геному через промежуточные РНК. В то время как считается, что более старые L1 нацелены на богатые АТ участки генома, хромосомные мишени новых, более активных L1 остаются плохо определенными. Здесь мы описываем методологию флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), которая может быть использована для отслеживания паттернов встраивания L1 и скорости эктопического включения L1 на уровне одного ядра. В этих экспериментах меченые флуоресцеином зонды изотиоцианата/цианина-3 (FITC/CY3) были использованы для отслеживания ретротранспозиции L1 in vitro в клетках HepG2, стабильно экспрессирующих эктопический L1. Эта методология предотвращает ошибки в оценке скорости ретроттранспозиции, вызванной токсичностью, и учитывает возникновение множественных вставок в одно ядро.

Введение

Человек Длинные перемежаются Ядерный элемент-1 (линия-1 или L1) представляет собой автономный подвижный элемент , который распространяется внутри генома через "копировать и вставить" механизм ретротранспозиции. Типичный человек L1 имеет длину ~ 6 кб и состоит из 5'UTR (Непереведенные область) , который служит в качестве промотора, две открытые рамки считывания (ORFs): L1 -ORF1 и L1 -ORF2 и 3'UTR с полиА . хвост L1 -ORF1 белок имеет три различных областях: доменное катушки катушки, РНК и распознавания Motif С-концевой домен, в то время как L1 -ORF2 белок имеет эндонуклеазы, обратной транскриптазы и цистеина богатые домены 1,2,3,4,5. L1 -ORF1 проявляет деятельность нуклеиновой кислоты Chaperone, в то время как L1 -ORF2 обеспечивает ферментативную активность, с обоих белков , необходимых для ретротранспозиции 1,2,6.

Цикл L1 ретротранспозиции начинается с транскрипции от 5' - UTR L1 , бицистронный мРНК с помощью РНК-полимеразы II, транслокации в цитоплазму, и перевод. В цитоплазме L1 -ORF1 проявляет либо цис -связывающим , где пакеты свою собственную РНК или транс -связывающим , где пакеты других РНК (т.е., синусоида / СВА / Псевдогены) с образованием рибонуклеопротеиновый частицы (RNP) с L1 -ORF2p 7, 8. Рибонуклеопротеиды транслокации в ядро , где эндонуклеаза активность L1 -ORF2p зарубок геномную ДНК (GDNA) , чтобы разоблачить ОН - группа 9, что в свою очередь , используется обратной транскриптазы для простого и обратного синтезировать РНК в ДНК с 3' - конца. Во время обратного синтеза, вторая цепь ДНК порезал 7-20 пар оснований от исходного сайта нику , чтобы создать в шахматном порядке перерывы , которые заполнены для формирования подписи вставки L1 последовательности (например, TTTTAA) называется дупликации целевой сайт (ТСД) 9,10. Этот процесс известен как целевой Prime обратной транскрипцией (TPRT) и приводит к insertiна полных или усеченных копий L1 / других ДНК с TSDs на обоих концах вставленной последовательности. L1 ретротранспозиции также было показано, опосредовано через TPRT типа негомологичный конечного присоединения в некоторых типах клеток 11.

Вектор L1 ретротранспозиции используется в наших исследованиях является неэписомные и состоит из маркированного L1 -ORF1 & 2р движимый комбинированных ЦМВ-L1-5'UTR промоутеров (рис 1) 12. Более ранние версии этой конструкции были описаны в исследованиях с использованием дрожжей и клеточных культур человека 13,14,15. Два различных CMV промоторы, расположенные на 5 'и 3'-концы вектора, с 3'-конец помещен в обратной ориентации по отношению к управлению экспрессией неомицина после сращивания и интеграции. Кассета индикатор ретротранспозиции на 3' - конце состоит из ген неомицина вставляется антисмысловой по отношению к L1 -ORFs и приведены в нерабочее состояние путем разделения на две половины Глобв интроне с сращивания донора (SD) и сращены акцептор (SA) участки (рисунок 1). После интеграции в хромосому, L1 , транскрибируется из общего промотора для получения мРНК , которая состоит из бицистронной мРНК , так и неактивный неомицина мРНК. Во время обработки РНК, глобина интрон сращены из гена неомицин, чтобы восстановить полностью функциональный ген неомицина. Гибридный мРНК упаковывается в РНП в цис и транслокации в ядро , где он встроен в геном либо как полной длины или усеченных вставок с использованием TPRT.

Здесь мы опишем методологию , которая использует флуоресценции в гибридизация (FISH) с зондами , специально направленных на сращивания геном неомицин (SNeo) , чтобы отслеживать L1 -retrotransposiition модели и скорости вставки на одном уровне ядра. Эффективность и специфичность обнаружения была подтверждена с использованием ретротранспозиции компетентных и некомпетентных конструкции и зонды опрЭСТ SNeo или неомицин и глобина интрона 16. Эта методология учитывает некоторые из недостатков ретротранспозиции анализов на основе клеточных культур, таких как множественные вставки, сопротивление колонии и благоприятного расширения клона.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Все шаги должны быть выполнены при комнатной температуре, если не указано иное. Пожалуйста, обратитесь к разделу Реагенты для подробной информации о том, как подготовить отдельные реагенты.

1. Маркировка L1 Зонды

ПРИМЕЧАНИЕ: Зонды могут быть помечены с помощью химического или ПЦР-маркировки.

  1. Химическая маркировка
    1. Сделать 0,7-1% -ном агарозном геле в трис-ацетат-ЭДТА (ТАЕ) буфера, тепла в микроволновой печи до тех пор, пока расплавится, дайте гелю остыть, а затем добавляют этидий бромид (0,5 мкг / мл). Налейте в лоток гель, добавьте гребешки и дайте гелю затвердевать при комнатной температуре.
    2. Этикетка зонда SNeo (1-2 мкг) с Су3 или FITC при 37 ° С в течение 1 ч в соответствии с протоколом производителя.
      Примечание: SNeo обозначает S pliced ​​Neo ген Mycin , выраженное после полного цикла ретротранспозиции. Зонд ~ 1000 п.о.. SNeo может быть ПЦР-амплификации из любого вектора или из геномаIC ДНК. См Таблицу материалов и реагентов для получения информации о стрептавидин-Cy3 / FITC маркировки реагентов.
    3. Смешать раствора меченого зонда SNeo с погрузкой ДНК 1x буфер, загрузку в каждую лунку и работать на 75-100 вольт в течение 15-20 мин.
    4. Визуализируйте группу зонда с использованием ультрафиолетового (УФ) осветитель. Обратите внимание , что размер зонда SNeo можно регулировать и блокировки ядра кислоты (МШУ) , могут быть также добавлены (рисунок 2).
    5. Вырезать меченый зонд SNeo из геля с чистым лезвием, растворять и очистить зонд SNeo из геля с использованием набора для ПЦР-Clean-Up в соответствии с протоколом производителя.
      ВНИМАНИЕ: Крышка каждый открытая часть тела с защитными экранами (т.е. лабораторный халат и УФ - прозрачного маски для лица) при просмотре и резки геля. Таблицу материалов и реагентов для получения информации в гель очистки продуктов ПЦР.
    6. Повторно пробежать 5 мкл SNeo меченным зондом с ООН-меченых SNeo зонда на агарозном геле 0,7% (см 1.1.1) для конразмер фирмы увеличение и потеря интенсивности сигнала (рисунок 2).
    7. Количественную оценку количества меченого зонда SNeo путем измерения оптической плотности при 260 нм и разбавить зонд SNeo до 10 нг / мкл аликвоты в нуклеазная свободной H 2 O. Храните аликвоты при -20 ° C.
  2. ПЦР Этикетировочное (Альтернативный способ маркировки зонда)
    1. Объединить SNeo специфических праймеров (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 'и 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') с ПЦР - реагентов в одну пробирку: 13,6 мкл нуклеазная свободной H 2 O; 0,1 мкл дАТФ, дЦТФ, дГТФ (10 нМ); 0,05 мкл дТТФ (10 нМ); 0,05 мкл дУТФ-биотин / дУТФ-ФИТЦ / Су3 (10 нМ); 4 мкл Go Tag 5х буфера; 0,4 мкл Go Tag полимеразу; 1 мкл шаблон SNeo (10 нг). См Таблицу материалов и реагентов для получения информации о реагентов для ПЦР.
    2. Регулировка количества каждого реагента путем умножения на общее количество образцов.
    3. Используйте следующий ПЦР параметр велосипедныйs для усиления и этикеток SNeo зондов: 95 ° C в течение 2 мин; 35 циклов при 95 ° С в течение 30 сек, 62 ° C в течение 30 сек, 72 ° С в течение 60 сек; 72 ° С в течение 2 мин; Держите при температуре 4 ° С до бесконечности.
      Примечание: Температура отжига может быть отрегулирована или градиент ПЦР может быть завершен, чтобы определить оптимальные температуры отжига для других зондов.
    4. Сделать 0,7-1% геля, как и в разделе 1.1.1, нагрузки и визуализировать полосу зонда, как в разделе 1.1.4.
    5. Вырезать и очистить меченый зонд SNeo, как и в разделе 1.1.5.
    6. Повторно пробежать 5 мкл SNeo меченным зондом с ООН-меченых SNeo зонда для подтверждения увеличения размеров и потерю интенсивности сигнала (см рисунок 2).
    7. Количественную оценку количества меченого зонда SNeo путем измерения оптической плотности при 260 нм и разбавьте SNeo зонд до концентрации 10 нг / мкл аликвоты в нуклеазная свободной H 2 O.

2. Подготовка спреды Хромосомные

  1. Создавать стабильные клоны, экспрессирующие вектор позвоночника (CONTROл) или ретротранспозиции компетентен L1 с использованием стандартных методик отбора. 12,16 В то время как неэписомальные репортеры были использованы для корреляции результатов с исследованиями транскрипции, могут быть также использованы векторы эписомные. Рост клеток , стабильно экспрессирующие контроль или L1 вектор (1 × 10 6 клеток на 10 см пластины, скорректированные размером пластины , изготовленной по мере необходимости) в полной среде роста. Для клеток HepG2, используют RPMI-1600, 10% FBS и 200 мкг / мл гигромицину. Grow культур до 70% слияния при 37 ° С и 5% СО 2.
    Примечание: Выбор среды для роста, зависит от типа клеток. Учитывая, что Плазмиды, используемые здесь, несут кассеты отбора как гигромицину и неомицина, стабильный отбор клонов, также может быть сделано с неомицин после выбора на гигромицину, но количество неомицина должен быть оптимизирован, чтобы установить уровни допустимых отклонений для каждого типа клеток.
  2. Добавить колцемид (0,4 мкг / мл) в культуральной среде и инкубировать в течение 90 мин, чтобы арестовать клетки в metaphаза. При использовании различных типов клеток, определяют оптимальную концентрацию колцемид и времени воздействия (60, 90 и 120 мин) для оптимального метафазы задержания эмпирически.
  3. Промыть клетки 2 раза с 10 мл PBS 1X Дульбекко (DPBS), Trypsinize добавлением 3-5 мл 0,25% раствора трипсина в клетки и инкубируют в течение 5 мин, чтобы отделить клетки. Деактивировать трипсина с равным количеством среды, содержащей 10% FBS.
  4. Центрифуга клетки в течение 2 мин при 1000 х г при температуре 4 ° С, аспирация среды от осадка клеток и промыть клетки с ДЗФР. Вытяжку все DPBS, оставляя 200 мкл ДЗФР повторно приостанавливать клетки. Обеспечение клетки смешивают хорошо и что все комки рассеяны. Используйте мерцающий или осторожно пипеткой, чтобы смешивать и дисперсных сгустки и избегать встряхиванием.
  5. Добавьте 5 мл гипотонический раствор (то есть, 75 мМ КСl) , который предварительно нагревают до 37 ° С по каплям при вращении 15 мл трубки в горизонтальном направлении и инкубировать при 37 ° С в течение 20 мин. Таблицу материалов и ReageNTS для получения информации о том, как получить и гипотонический раствор.
  6. Центрифуга клетки при 120 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С и повторите шаги 2.4 - 2.5 3x оставляя приблизительно 200 мкл гипотонический раствор повторно суспендирования клеток после каждой промывки. Убедитесь, что в конце 3-х промывок осадок заметно белый и опухшие.
  7. Повторное приостановить осадок в 200 мкл раствора Карной Fixative и сделать 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 разбавление в растворе Карной Fixative. Оставьте 10 мкл каждого разведения на сухую чистую горкой от приблизительно 1 см выше и сразу же выставить распространение свободной стороной к горячим паром от кипящей воды в течение 30 сек. См Таблицу материалов и реагентов для получения информации о том, как сделать решение Карной закрепителем.
  8. Сушат спреды при комнатной температуре, пятно с 0,1 мкг / мл Hoechst-33342 погружением в воду в течение 15-20 мин в Коплин Jar и мыть 3x с ДЗФР. См Таблицу материалов и реагентов для получения информации о том, как сделать решение Hoechst-33342.
  9. Просмотр распространяется на флуоресценцию / фазоконтрастного микроскопом при 40-кратном увеличении. После оптимизации подготовки распространения, спреды не должны быть окрашены Hoechst-33342. Просмотр распространяется на фазово-контрастным микроскопом при 10 - кратным увеличением для определения распространения качества и разделения , как это описано в разделе Результаты (смотри рисунок 3).
  10. Выбрать и обвести хорошие спреды с маркера точки алмазом на противоположной стороне затвора (т.е. распространяться свободной сторона).
  11. Магазин распространяется при -20 ° С в течение до одного месяца. Избегайте воздействия влаги.

3. флуоресценцию в гибридизация (FISH)

  1. Стабилизирующие и дегидратацией спреды
    Примечание: Равновесие метафазы хромосома распространяется до комнатной температуры при хранении при температуре -20 ° C. См Таблицу материалов и реагентов для получения информации о том, как получить и реагенты.
    1. Выдержите метафазы хромосомы распространяется с 200 мкл РНКазы А для1 час при температуре 37 ° С.
    2. Мытье скользит в 2х SSC-буфером дважды в течение 5 мин каждый с последующей промывкой 10 мМ раствором HCl.
    3. Выдержите спреды с добавлением 1% пепсина в течение 10 мин при температуре 37 ° С, промывают деионизированной H 2 O и дважды промывали 2Х SSC буфером в течение 5 мин каждый.
    4. Выдержите спреды 4% параформальдегидом в течение 10 мин и моют в 2 x SSC буфера в два раза в течение 5 мин каждый.
    5. Обезвоживают распространяться путем инкубации в течение 2 мин в серии этанола: 70%, 80% и 95% этанола.
    6. Воздушно-сухой слайдов.
  2. Гибридизация раздвигает с L1 меченных ретротранспозиции зондов (т.е. SNeo)
    ВНИМАНИЕ: Для прямых меченных зондов, держаться подальше от света во все времена. См Таблицу материалов и реагентов для получения информации о том, как получить и реагенты.
    1. Добавьте 30 нг SNeo гибридизации буфера, нагревают при 72 ° С в течение 10 мин и охладить в течение 2 мин при комнатной температуре.
    2. Добавить 30 мкл раствора зонда SNeo на еACH спрэд, крышка с покровное и запечатать края с резиновым клеем. Убедитесь в отсутствии образования пузырьков.
    3. Нагреть скольжение при 72 ° С в течение 5 мин на тепловом блоке, постепенно понизить температуру до 37 ° С, и инкубировать в течение ночи в темной увлажненной камере при 37 ° С.
  3. Стиральная и просмотр (или добавление вторичного антитела)
    ВНИМАНИЕ: Для прямых меченных зондов, держаться подальше от света во все времена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: См Таблицу материалов и реагентов для получения информации о том, как подготовиться. Использование достаточного объема, чтобы охватить весь разброс хромосом рекомендуется. Следует помнить, что избыточный объем будет потеряна при добавлении покровное.
    1. Погрузитесь слайдов в буфер 2x SSC для удаления покровные.
    2. Промыть слайды путем погружения в 2х SSC-буфере при 45 ° С в течение 5 мин.
    3. Промыть слайды путем погружения в промывном буфере при 45 ° С в течение 5 мин, 2 раза.
    4. Промыть слайдов путем погружения в 0.1x SSC буфере при 45 ° С в течение 10 мин.
    5. Промыть слайды путем погружения в 2Х SSC буфере при 45 ° С в течение 10 мин.
      Примечание: Поместите Jar Коплин, содержащий рекомендованный буфер на водяной бане, регулировать температуру до 45 ° C.
    6. Классные слайды до комнатной температуры и уравновешивания слайды в буфере обнаружения.
    7. Для прямых меченых зондов, перейдите к шагу 3.4.10.
    8. Для непрямых меченых зондов, блок в блокирующем буфере в течение 20-30 мин и промойте 3 раза в ДЗФР.
    9. Инкубируют 50 мкл вторичного антитела (например, 5 мкг / мл стрептавидин-FITC или αCY3 в блокирующем буфере) в течение 1 ч.
    10. Вымойте слайды в 2х SSC в течение 5 мин дважды.
    11. Проводят контрастное с Hoechst-33342 раствором (0,1 мкг / мл) в течение 10 мин.
      Примечание: это окрашивание делается для окрашивания хромосом для совместной локализации с зондом.
    12. Стирать в DPBS 3x, добавить каплю монтажной среды, поместите покровное и запечатать края с лаком для ногтей.
    13. Анализ L1 ретротранспозиции с помощью флуоресцентного микроскопа в 40х маgnification.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Принципиальная схема ретротранспозиции вектора L1 представлена ​​на рисунке 1. Вектор состоит из неомицину гена в антисмысловой ориентации на L1 ORF , которая прерывается глобина интрона в смысловой ориентации и зажат SD и SA сайтов. Когда стабильно интегрирована в хромосому, мРНК L1 транскрибируется с комбинированной ЦМВ и L1-5'UTR промотор (рисунок 1). Во время процессинга РНК, глобина интрон сплайсируется из геном неомиц...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Методологии , такие как целого генома, обратной ПЦР и Саузерн - блоттинга были использованы для изучения L1 ретротранспозиции. Хотя эти методики являются чрезвычайно ценными в поиске , где L1 вставки происходят в геномах, Поразительным вызов для всех из них является необходимость в-силикомарганца программирования повторно собрать последовательности. Методика FISH , описанная здесь, предназначена , чтобы дополнить эти методы, особенно в случае исследований , требующих анализа внематочной ретрот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют нет потенциальных конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана грантами от Национального института наук о гигиене окружающей среды (ES014443 и ES017274) и AstraZeneca для KSR.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Labeling Probes
Go Tag ДНК-полимеразаPromegaM3178
GO Tag 10x бесцветный буферPromegaM3178
Individual dNTPSigmaDNTP10Отрегулируйте концентрацию dATP, dGTP, dCTP до 2  mM и dTTP до 1,5  мМ в воде, свободной от нуклеаз.
dUTP-16-Биотин (0,5  mM)Roche11093070910
dUTP-FITC (0.5  mM)Thermo ScientificR0101
dUTP-CY3 (0.5  mM)SigmaGEPA53022
Набор для маркировки MIRUS FISH Набор для маркировкиMIRUSMIR3625
MIRUS FISHНабор для
NucleoSpin PCR Clean-Up Qiagen1410/0030Любой чистый реагент для ПЦР может быть использован вместо набора для очистки ПЦР NucleoSpin PCR
ПЦРЛюбая машина для амплификации этикеточного продукта может быть использована любая машина для амплификации этикеточного продукта.
АгарознаясигмаA9539
Подготовка хромосомных спредов
ColcemidLife Technologies 15212-012Добавить колцемид непосредственно в питательную среду до конечной концентрации 0,4&nb.л. &микро; г/мл
1  M KClSigmaP9541Разбавить 1  Решение M KCl к 75  Раствор mM для приготовления гипотонического раствора
Фиксирующий растворСмешайте 3 объема метанола и 1 объем уксусной кислоты для получения фиксирующего раствора Карной. Готовьте Fresh каждый раз.
МетанолSigma322415
уксусная кислотаSigma320099
Hoechst-33342Thermo Scientific62249Растворить Hoechst-33342 в PBS до конечной концентрации 1  мг/мл
Алмазный точечный маркерThermo Scientific750
Матовые горкиThermo Scientific2951-001
Трипсин-ЭДТА (0.25%)Life Technologies R001100Для детекации клеток инкубируйте клетки в трипсине в течение 5 мин и в неактивных количествах с равным объемом полной среды.
Крышки слайдовVWR48366067
Coplin JarsThermo Scientific107
Heat BlockДля этой цели можно использовать любой тепловой блок, хотя рекомендуется использовать блоки, подходящие для нагрева слайдов.
Стакан (600  ml)SigmaCLS1003600Наполните стакан водой, нагрейте до кипения, используйте горячий пар для разрыва хромосом.
Микроскоп NikonNikon125690Любой микроскоп можно использовать для просмотра качества разброса.
Реагенты и материалы для FISH
Trisodium CitrateSigmaS1804
Натрия ChrorideSigmaS3014
ФормамидSigmaF9037
Tween-20SigmaF1379
Detran SulfateSigmaD8906
SDSSigmaL3771
Сперма лосося ДНКLife Technologies 15632-011
Бычий сывороточный альбумин (БСА)SigmaA8531
HCl (N)Sigma38283
Этиловый спиртСигма459844
метанолSigma322415
DPBSLife Technologies 14190-250
NaOHSigmaS8045
Rnase ASigmaR4642
ПепсинSigmaP6887
Параформальдегид (PFA)SigmaP6148
Hoechst-33342Thermo Scientific62249Растворить Hoechst-33342 в PBS до конечной концентрации 1  мг/мл
Резиновый цемент/герметик Cytobond 2020-00-1
Семь коплинных банокThermo Scientific107
Темная увлажненная камераSigmaCLS2551
Cover СлайдыVWR48366067
Сухой цифровой тепловой блокVWR13259
Флуоресцентный микроскоп
20x Цитрат физиологического раствора и натрия (20x SSC)Соедините 175 г NaCl и 88,2&nbл; г тринатрия цитрата с 800 мл молекулярного H2O. Перемешайте, доводя pH до 7. Как только все соли растворятся, отрегулируйте объем до 1 л и отфильтруйте через 0,22 мкм; м Фильтровальная бумага. Хранить при температуре 4 °C.
1  мг/мл Rnase AРазбавьте 20x SSC буфер до 2x SSC буфера. Растворите РНКазу А в 2x буфере SSC до конечной концентрации 1  мг/мл Каждый раз готовьте свежее решение.
1% пепсинРастворите пепсин (W/V) в 10 мМ HCl до конечной концентрации 1% раствора. Каждый раз готовьте свежее.
4% параформальдегида (4% PFA)Смассировать 4,0 г PFA в вытяжном шкафу, добавить 50 мл 1xPBS, нагреть до 60  ° C во время помешивания и регулируйте pH каплями NaOH до тех пор, пока весь PFA не растворится и раствор не станет прозрачным. Отрегулируйте громкость до 100  мл, фильтруем через 0,22 & микро; м Процеживаем бумагу и храним 5 мл аликвот при -20  °C. Размораживание аликвоты PFA при 37 ° C в течение 10-15 минут для последующих применений. Регулируйте размер фильтра в зависимости от количества параформальдегида.
для промывкиСмешайте 100 мл формамида (20%) с 2,5 мл 20x SSC, отрегулируйте до pH 7 с 1,0 M HCl и доведите объем до 500 мл с молекулярным H2O.
для гибридизацииСочетает в себе 50% формамид, 10% сульфат декстрана, 0,1% SDS и 300 нг/мл ДНК спермы лосося в 2x буфере SSC. Количество формамида определяет, насколько сфокусированы хроматиды; Титруйте количество.
БуферУбавьте буфер SSC в 20x до 4x и добавьте 0,2% Tween-20, чтобы получить буфер обнаружения.
Блокирующий буферОбъедините 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) с 0,2% Tween-20 в 4-кратном буфере SSC.
для обезвоживанияСоздавайте 70%, 80% и 95% растворы этанола.
очистки MIRUS MIR3225 Машина для Карной Буфер Буфер обнаружения: Раствор

Ссылки

  1. Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. Reverse transcriptase encoded by a human transposable element. Science. 254, 1808-1810 (1991).
  2. Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition. Cell. 87, 905-916 (1996).
  3. Clements, A. P., Singer, M. F. The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain. Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).
  4. Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).
  5. Khazina, E., et al. Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition. Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).
  6. Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1. J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).
  7. Martin, S. L. Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells. Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).
  8. Hohjoh, H., Singer, M. F. Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA. EMBO J. 15, 630-639 (1996).
  9. Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro. EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).
  10. Szak, S. T., et al. Molecular archeology of L1 insertions in the human genome. Genome Biol. 3, (2002).
  11. Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome. Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).
  12. Bojang, P. Jr, Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1. Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).
  13. Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. Ty elements transpose through an RNA intermediate. Cell. 40, 491-500 (1985).
  14. Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses. PNAS. 85, 2219-2223 (1988).
  15. Moran, J. V., et al. High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells. Cell. 87, 917-927 (1996).
  16. Bojang, P. Jr, Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13. Genomics. 104, 96-104 (2014).
  17. Rozen, S., et al. Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes. Nature. 423, 873-876 (2003).
  18. Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. How the gene content of human sex chromosomes evolved. Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).
  19. Leem, Y. E., et al. Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators. Mol Cell. 30, 98-107 (2008).
  20. Guo, Y., Levin, H. L. High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe. Genome Res. 20, 239-248 (2010).
  21. Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin. Mol Cell. 27, 289-299 (2007).
  22. McClintock, C. B. The origin and behavior of mutable loci in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).
  23. Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine. Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).
  24. Garcia-Perez, J. L., et al. Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells. Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).
  25. Rodic, N., et al. Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma. Nat Med. 21 (9), (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Флуоресцентная гибридизация in situанализ одиночных ядерклетки HepG2маркировка зондом SNeoметафазные пластинки хромосомзонды FITC и Cy3обработка гипотоническим растворомметод фиксации по Карноипопосадочная среда с DAPI
Анализ LINE-1 ретротранспозиции на уровне одного ядра
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.