Методическая статья

Транскриптом профилирование In-Vivo Производимые Бычьи Эмбрионы предимплантационной Использование Двухцветный Microarray платформы

7.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53754

⸱

30 января 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta, 2Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry, 3Laboratory of Functional Genomics of Early Embryonic Development, Université Laval

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Технология микрочипов позволяет количественно измерять и профилировать экспрессию генов транскриптов на всей геномной основе. Таким образом, данный протокол обеспечивает оптимизированную техническую процедуру в двухцветном изготовленном на заказ массиве крупного рогатого скота с использованием эмбрионов крупного рогатого скота на 7-й день, чтобы продемонстрировать возможность использования небольшого количества общей РНК.

Аннотация

Ранняя потеря эмбриона является важным фактором бесплодия у крупного рогатого скота. Кроме того, крупный рогатый скот становится интересной моделью для изучения развития человеческого преимплантационного эмбриона из-за схожего процесса развития. Хотя известно, что генетические факторы влияют на раннее эмбриональное развитие, обнаружение таких факторов стало серьезной проблемой. Технология микрочипов позволяет количественно измерять и профилировать уровни транскриптов экспрессии генов на всей геномной основе. Одно из основных решений, которое необходимо принять при планировании эксперимента с микрочипом, заключается в том, следует ли использовать одно- или двухцветный подход. Двухцветный дизайн увеличивает техническую тиражируемость, минимизирует вариативность, повышает чувствительность и точность, а также позволяет иметь петлевые конструкции, определяющие общие эталонные выборки. Несмотря на то, что микрочип является мощным биологическим инструментом, существуют потенциальные подводные камни, которые могут ослабить его мощность. Таким образом, в данной технической статье мы демонстрируем оптимизированный протокол для экстракции РНК, амплификации, мечения, гибридизации меченой амплифицированной РНК с матрицей, сканирования матрицы и анализа данных с использованием стратегии двухцветного анализа.

Введение

Ранняя эмбриональная потеря в высокопродуктивных молочных коров является одной из основных проблем в молочной промышленности 1, 2. Бычий стала интересной моделью для изучения развития предимплантационной эмбрионов человека из - за их подобного процесса развития 3, 4. Тем не менее, требуются дальнейшие исследования, чтобы иметь лучшее представление о генах, участвующих в коровьем раннего эмбрионального развития.

Через двадцать лет после первой технологии микрочипов разработан в 1995 году 5, разработка более совершенных технологий изготовления зонда уменьшенных ошибок и изменчивости чипов массива внутри , так и между различными микрочипов платформ 6 печати. Усовершенствованная технология микрочипов привело к широко применения этой технологии в области клинических исследований 7 и совсем недавно, в начале эмбриона дОценка uality 8.

Большое количество необходимого материала для микрочипов технологии является основной причиной, почему технология микрочипов изначально не удалось ввести ряд научно-исследовательских областях, таких, как раннее эмбриональное развитие. Совсем недавно, методы амплификации РНК были улучшены линейно усиливать РНК до уровня микрограммов из суб-нанограмм исходного материала РНК 9. Есть несколько коммерческих наборов РНК амплификации на рынке; Тем не менее, более популярные хорошо разработанные комплекты связаны с Рибо-Single Праймер изотермическом Amplification 10 и T7 промотор приводом 11 методов. Самой популярной антисмысловых РНК амплификации использует в пробирке транскрипции с олиго - дТ праймера , соединяющего с Т7 промотора на 5 'конце 12. Эта технология позволяет поддерживать наиболее представительных антисмысловых транскриптов после линейного усиления Fили массивы гибридизация 13. Этот метод был адаптирован для усиления пикограммов уровня тотальной РНК , выделенной из бычьего эмбриона 8.

Универсальная система Рычажный (ULS) является метод маркировки , который непосредственно включает ДНК или РНК , амплифицированной с платиной-сшитый флуоресцентного красителя либо цианиновыми 547 или цианиновыми 647, путем формирования координационную связь на N7 положении гуанина 14. Этот метод был адаптирован в исследовании эмбрионов для создания более стабильной усиливается Арна без изменений по сравнению с aminoallyl модифицированным Арна , порожденного ферментативным способом 15. Оба одного красителя и маркировки два красители методы были адаптированы с помощью универсальной системы Linkage в микрочипе. Большое исследование микрочипов сравнения в том , что существует хорошая корреляция качества данных между одно- и двухцветных массива платформ 6.

В последнее время, как Т7 промотор приводаN антисмысловой РНК амплификации и мечения ULS методы были разработаны , чтобы обеспечить более надежный протокол для создания достаточного количества высококачественных меченый ARNA материалов для микрочипов гибридизации 8, 16. Таким образом, данное исследование обеспечивает протокол, чтобы продемонстрировать некоторые из важных этапов от экстракции РНК к анализу данных, участвующих в двухцветной микрочипов с использованием 7-й день эмбрионы крупного рогатого скота в качестве примера.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Животное часть этого исследования была проведена на исследовательское подразделение Метаболический Университета Альберты, Эдмонтон, Канада, со всеми экспериментальными процедурами животных утвержден (Протокол № AUP00000131) Университета Альберты уходу и использованию животных комитета, и животные заботятся в соответствии в канадский совет руководящих принципов по уходу за животными (1993).

1. Эмбрион Производство, Выделение тотальной РНК и ДНКазы лечения

  1. Для экспериментальных протоколов животных и сбора эмбрионов см в наших предыдущих публикациях 17, 18.
  2. Бассейн и оснастке замораживать подобные эмбрионы стадии от каждой коровы в жидком азоте, а затем хранить при -80 ° C до экстракции РНК.
  3. Экстракт тотальной РНК с помощью набора для экстракции РНК колонке на основе , которая позволяет извлекать РНК из пико масштаба образцов (комплект информационных материалов доступен в список материалов).
    Примечание: Рекомендуемый набор содержит: Кондиционер Буфер, извлечение BufFER, 70% этилового спирта, промывочный буфер 1, промывочного буфера 2, буфера для элюции, колонны очистки РНК со сбором трубок и микропробирок.
  4. Добавьте 10 мкл буфера для экстракции в пробирку, содержащую эмбрионов и инкубировали в течение 30 мин при 42 ° С. Центрифуга трубки при 800 мкг в течение 2 мин для сбора клеточного экстракта в микроцентрифужных трубки.
  5. Пипетировать 250 мкл буфера для кондиционирования на мембрану Очистка на колонке фильтра. Выдержите колонны очистки РНК с Conditioning буферным раствором в течение 5 мин при комнатной температуре. Центрифуга колонны очистки в пробирку при 16000 мкг в течение 1 мин.
  6. Пипетка по 10 мкл 70% этанола в смесь РНК-экстракционном буфере и эмбрионов. Хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Пипетка смесь в переобусловленного колонне очистки.
  7. Для связывания РНК, Центрифуга колонны очистки в течение 2 мин при 100 х г и следуют непосредственно за центрифугированием при 16000 х г в течение 30 с, чтобы удалить поток через.
  8. Пипетка 10081, L промывочного буфера 1 в колонну очистки и центрифугировать в течение 1 мин при 8000 х г.
    Примечание: ДНКазы лечение рекомендуется при проведении обратной транскрипции или амплификации после выделения РНК.
  9. Дайджест геномную ДНК сразу после шага 1.8.
    Примечание: Рекомендуется ДНКазы комплект доступен в списке материалов. Рекомендуемый комплект содержит: маточный раствор ДНКазы I и буфера.
  10. Подготовка ДНКазную инкубационный смеси путем смешивания 5 мкл ДНКазы I исходного раствора с 35 мкл буфера. Смешайте аккуратно переворачивая.
  11. Внесите мкл ДНКазы инкубационную смесь 40 непосредственно в мембрану колонны очистки. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин.
  12. Пипетка 40 мкл промывочного буфера 1 в мембрану колонку очистки, а затем центрифуге при 8000 мкг в течение 15 сек.
  13. Пипетка 100 мкл промывочного буфера 2 в колонну очистки и центрифугировать в течение 1 мин при 8000 х г.
  14. Пипетировать еще 100 мкл моющего буфера 2 в колонну очистки и центрифугев течение 2-х минут при 16000 х г.
  15. Перенести колонны очистки на новый 0,5 мл микроцентрифужных трубки. Пипетка 11 мкл буфера для элюции непосредственно на мембрану колонны очистки. Для того, чтобы обеспечить максимальное поглощение Буфера для элюции в мембрану, осторожно потрогать кончик пипетки к поверхности мембраны, в то время дозирования элюирующего буфера.
  16. Инкубируйте колонку в течение 1 мин при комнатной температуре. Центрифуга колонку в течение 1 мин при 1000 х г распределить буфера для элюции в колонке, а затем вращаться в течение 1 мин при 16000 х г для элюции РНК.
  17. Используйте Bioanalyzer прибор в соответствии с инструкциями изготовителя , чтобы оценить качество и количество РНК 19.
  18. Хранить образцы РНК при температуре -80 ° С до использования.

2. РНК и амплификация Этикетировочное для Microarray анализа

Примечание: Для первого пользователя время работы с процедурами амплификации РНК и маркировки, используют пять нг шип-РНК в АОТнг с фактическими образцами Арна для мониторинга измерения контроля качества РНК-амплификации и гибридизации. Шип-РНК в смеси содержит десять в пробирке синтезированные, Полиаденилированная транскриптов в заранее определенном соотношении. Когда процедура выполняется должным образом, меченые транскрипты специфически гибридизоваться только с комплементарными зондами управления в массивах, и данные могут быть отсканированы для отслеживания обеспечения качества управления с минимальным само- или перекрестной гибридизации. Подробнее описание относительно пичковый в интенсивности контроля и нормализации процедуры после сканирования массива и анализа данных является ссылаться на предыдущие публикации 20, 21. Следующая процедура дается рутинных пользователей микрочипов.

  1. Приготовьте (значение числа РНК Целостность (РИН) по крайней мере> 7,0) высокое качество 100 пг образец РНК в общем объеме 10 - 11 мкл.
  2. Amplify образцы РНК с помощью комплекта усиления возможностиработать с пико масштаба образцов (всего лишь 100 пг).
    Примечание: Рекомендуемый комплект информационных усиления доступен в списке материалов и следует инструкциям изготовителя без каких-либо изменений.
  3. С помощью флуоресцентного на основе количественного для оценки профиля диапазона размера амплифицированного АРНА.
  4. С помощью спектрофотометра инструмент (на основании оптической плотности при 260 и 280 нм) для измерения концентрации усиливаемого АРНА.
  5. Хранить усиленную ARNA при -80 ° С до готовности к маркировке.
  6. Используйте 2 мкг амплифицированной РНК для флуоресцентной маркировки в соответствии с ULS Арна комплект маркировки инструкция пользователя.
    Примечание: Так как цианиновыми 547 и 647 цианиновыми краситель чувствительны к фото-деградации и цианиновыми 647 краситель легко разрушается озоном, процедура маркировки происходит в минимальном количестве света и под озоновой свободной среды.
  7. Включите поле озона (рис 1А) , пока уровень озона составляет 0,001 частей на миллион.
  8. Выполните настройку реакции внутри коробки озона (Фиг.1В) путем добавления 2 мкл цианиновыми 547 или цианиновыми 647, 2 мкл буфера для мечения, а затем отрегулировать до конечного объема 20 мкл с помощью РНКазы воды под безопасного освещения. Добавить фотолаборатории фильтр к источнику света.
  9. Осторожно перемешать и инкубировать пробирки в амплификатор при 85 ° С в течение 15 мин. Место образцы на льду в течение не менее 1 мин. Спин вниз собрать содержимое пробирки перед продолжением набора для экстракции РНК, за исключением шагов, связанных с лечением ДНКазы (от 1.9 до 1.11), для очистки Cy-краситель-меченого амплифицированной РНК.
  10. С помощью спектрофотометра прибор для измерения и определения концентрации меченого амплифицированной РНК и держать меченый ARNA при -80 ° C максимум в течение 3-х дней перед использованием.

3. Microarray гибридизацию и промывку

Примечание: Следующие важные шаги адаптированы в соответствии с Двухцветный микрочипов на основе анализа экспрессии генов протокола (версия6.5, май 2010 г.).

  1. Добавить равное количество 825 нг каждого из цианиновыми 547- и цианиновыми 647-меченого Арна и смешать с 25х и 10х фрагментации блокировки буферов.
  2. Нагревают смесь при 60 ° С в течение 15 мин и охладили на льду в течение 1 мин.
  3. Добавить равное количество 2х буфера гибридизации и хорошо перемешать.
  4. Центрифуга при 13000 оборотов в минуту, после чего смесь готова к гибридизации.
  5. Нагрузка 100 мкл из смеси на слайде массива и запечатать слайд внутри камеры гибридизации.
  6. Загрузите в собранном виде камеры в печи гибридизации в течение 17 ч при температуре 65 ° C вращается со скоростью 10 оборотов в минуту в печи.
  7. Вымойте массивы в соответствии с протоколом с обработкой защиты озонового слоя путем погружения в стабилизации и высушивания раствора в течение 30 сек.
  8. Удалите массивы из раствора и убедитесь, что поверхность массива сухой, без каких-либо частиц пыли

4. Сканирование микрочипов слайдов

  1. Держите массивы в темном месте и включите scannэр, пока он не будет готов к использованию (15 мин время ожидания).
  2. Загрузите штрих-код массива на левой стороне, в сканер и запустите процесс сканирования. Сделайте анализ пятна в соответствии с руководством пользователя программного обеспечения и сохранить данные в виде (GPR) формат файла.

5. Статистический анализ

  1. Загрузите программное обеспечение FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php~~HEAD=dobj Нажмите на кнопку "импорта необработанных данных" и загружать файлы GPR в FlexArray.
  2. Выполните нормализацию и статистический анализ, если это необходимо, следуя инструкциям. Примечание: Вычислить порог для положительного отбора спот в данном исследовании , как это было описано ранее 22.
  3. Выберите выпадающий руководстве от зрителя сюжету FlexArray, чтобы просмотреть все гибридизированных пятна и фоновые сигналы. Примечание: Аналогичная картина колосовых в контрольной группе после гибридизации с микрочипом можно увидеть в предыдущем исследовании , 8.
  4. ВыберитеЛёссовое нормализация внутри массива последующим квантиль между процессом нормализации массивов из FlexArray выпадающий руководство соответствующим образом.
  5. Экспортировать все нормированные данные из FlexArray в Excel файл для дальнейшего использования.

6. Биоинформатика анализ

Оригинальный аннотирование зонда последовательностей из бычьих эмбрион конкретных транскриптов (BESTv1) микрочипов было описано ранее 8. В настоящем исследовании, были получены 20,403 уникальные символы генов (GS) ( Дополнение File1 ) через Систему EmbryoGENE Laboratory Information Management (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). Список 6765 уникальных генов ( Дополнение File2 ) был выбран и соответствовал всем положительных сигналов после процесса нормализации микрочипов (шаг 50,5) из бычьей День 7 гена эмбрионы профиля экспрессии. Порог Положительный сигнал был рассчитан на основе проницаемым публикации 16 от интенсивности сигнала значением A.

  1. Для проведения функционального анализа с PANTHER (Protein анализу на основе эволюционные отношения) система классификации 23, 24, откройте следующую ссылку (http://www.pantherdb.org/about.jsp~~HEAD=dobj).
  2. Загрузить список 6765 эмбрионов конкретных GS для идентификации конкретного биологического процесса во время эмбрионального развития с использованием статистического теста доминированию и использовать настройки по умолчанию парнокопытных (все гены в базе данных) в виде списка ссылок 25.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет идентифицировать связанные с развитием процессов с точки зрения ГО, которые статистически завышения или занижения выражается с помощью биномиального теста.
  3. Порог Установите P-значение в <0,05 в качестве программного обеспечения по умолчанию. Данные могут быть загружены и экспоrted в файл Excel для последующего выбора 16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Репрезентативный результат тотальной РНК и усиливаемого Арна из 7 -й день эмбрионов крупного рогатого скота показана на рисунке 3 и в таблице 1.

целостности и профиль РНК может быть оценена после экстракции РНК. Оценка качества РНК может быть сделано с помощью Bioanalyzer инструмента (фиг.3А) , и только те образцы с значением RIN выше 7,0 имеют право быть использованы для ампл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Первая проблема, для выполнения анализа микрочипов с использованием 7-й день эмбрионы крупного рогатого скота не получает достаточного количества РНК высокой качества для изучения экспрессии генов. Выделение РНК Традиционная фенол / хлороформ и способ осаждения этанолом не рекомендуется для 7-й день эмбрионов, что приводит к низкой урожайности и возможной остаточному фенола, ингибирующих реакции амплификации РНК. Вместо этого стандартный метод на основе столбца лучше изолировать общую РНК, а затем элюировать РНК с миним...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Исследования при поддержке Агентства по животноводству и мясу Альберты, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Milk и Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для выделения РНК PicoPureПрикладные биосистемыKIT0204
набором ДНКаз без РНКазы (50)Qiagen79254
Agilent РНК 6000 Pico KitAgilent Technologies5067-1513
Arcturus RiboAmp HS PLUS НаборApplied BiosystemsKIT0505
2100 Инструменты биоанализатораAgilent TechnologiesG2940CA
Лента для скрининга РНКAgilent Technologies5067-5576
ULS Набор для флуоресцентного меченияKreatech DiagnosticsEA-021
Пользовательские микрочипы экспрессии геновAgilent TechnologiesG2514F
Agilent Gene Expression буфер для промывки 1Agilent TechnologiesЧасть #5188-5325
Agilent Gene Expression буфер для промывки 2Agilent TechnologiesЧасть #5188-5326
2x Hi-RPM буфер для гибридизацииAgilent Technologies  Часть #5190-0403
25x Буфер фрагментовAgilent TechnologiesЧасть #5185-5974
10x GE Блокирующий агентAgilent TechnologiesЧасть #5188-5281
Решение для стабилизации и сушкиAgilent Technologies  Часть #5185-5979
Прокладочные стекла с поддержкой Agilent SureHyb techonolgyAgilent TechnologiesG2524-60012Упаковка из 20 прокладочных стекол, 4 микрочипов / слайд
Двухцветный набор для шипов РНКAgilent Technologies  Cat# 5188-5279
Матричный сканер GenePix 4000BМолекулярные устройстваGENEPIX 4000B-U
Коробка без озонаBioTrayOFB_100x200
файл GALAgilent Technologies-

Ссылки

  1. Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
  2. Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).
  3. Wrenzycki, C., et al. Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos. Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).
  4. Menezo, Y. J., Herubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).
  5. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
  6. Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
  7. Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M. Integrative analysis of the cancer transcriptome. Nat. Genetics. 37, 31-37 (2005).
  8. Robert, C., et al. Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays. Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).
  9. Nygaard, V., Hovig, E. Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling. Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).
  10. Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications. Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).
  11. Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).
  12. Phillips, J., Eberwine, J. H. Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells. Methods. 10 (3), 283-288 (1996).
  13. Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation. Nucleic Acids Res. 37 (8), 65(2009).
  14. Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique. Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).
  15. Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays. Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).
  16. Tsoi, S., et al. Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation. BMC Genomics. 13, 370(2012).
  17. Salehi, R., et al. Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid. Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).
  18. Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows. Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).
  19. Agilent 2100 Bioanalyzer User's Guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf (2016).
  20. Kerr, K. F. Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray. BMC Bioinformatics. 8, 371(2007).
  21. Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset. Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).
  22. Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species. Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).
  23. Thomas, P. D., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
  24. Mi, H., et al. The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways. Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).
  25. Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).
  26. Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos. Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).
  27. Gilbert, I., et al. The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development. Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).
  28. Vallee, M., et al. Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development. Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).
  29. Dafforn, A., et al. Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis. Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).
  30. Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A. Nuclear Reprogramming. Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. , Humana Press, Springer. NY. Chapter 15 (2015).
  31. Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи