Онколитическая виротерапия находится в стадии разработки в качестве нового терапевтического средства для лечения гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). В данной статье мы описываем метод локорегионарной терапии ГЦК путем введения онколитического вируса через печеночные артерии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Трансартериальная Администрация онколитической Вирусы для Локорегионарные терапии Ортотопическая НСС у крыс
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) — это заболевание с ограниченными возможностями лечения и плохим прогнозом. В последние годы онколитическая виротерапия зарекомендовала себя как потенциально мощное средство борьбы со злокачественными новообразованиями. Благодаря уникальному двойному кровоснабжению печени можно применять методы лечения локально при ортотопических опухолях печени, которые преимущественно питаются артериальным кровотоком. Ранее мы продемонстрировали, что доставка онколитических вирусов через печеночные артерии приводит к безопасной и эффективной эффективности трансдукции мультифокальных поражений ГЦК, что приводит к значительному увеличению выживаемости у иммунокомпетентных крыс. Эта процедура очень похожа на применение трансартериальной эмболизации у пациентов, которая является стандартной паллиативной помощью, оказываемой многим пациентам с ГЦК. Возможность проведения терапии опухолей через печеночную артерию у крыс позволяет создать очень сложную доклиническую модель для оценки новых вирусных векторов, находящихся в стадии разработки. В данной статье мы подробно опишем протокол микродиссекции печеночной артерии для инфузии онколитических вирусных векторов для лечения ортотопической ГЦК.
Введение
Гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) является пятым самым распространенным раком во всем мире, и третьей ведущей причиной рака , связанных смерти, что делает его значительное беспокойство здоровья 1,2. Для пациентов , которые не имеют права на резекции опухоли, или лиц , ожидающих трансплантации печени, локорегионарной терапии с участием Трансартериальная эмболизации (TAE) или трансартериального Химиоэмболизация (ТАХЭ) применяются в качестве стандартной паллиативной помощи 3,4. Эти методы используют уникальную особенность двойного кровоснабжения в печени в результате чего опухоли кормили почти исключительно печеночным артериального кровотока, в то время как окружающие печень получает большую часть своих поставок крови из воротной вены 5,6.
Из-за крайне ограниченных эффективностей установленных методов лечения ГЦК, онколитические вирусы появились в качестве перспективных альтернативных терапевтических средств. JX-594, который недавно был переименован Pexa-VEC, является киназа удаленные коровьей вектор тимидина, вооруженный гранулоцитов-мacrophage колониестимулирующий фактор (GM-CSF), которая завершила фазу II клинических испытаний для ГЦК 7. Совсем недавно, рекомбинантный вирус везикулярного стоматита вектор (VSV) экспрессирующих человеческий интерферон-бета вступила в фазу I клинических испытаний для сорафениба-огнеупорный ГЦК (NCT01628640). Как онколитических вирусов двигаться ближе к получению одобрения для клинического применения при НСС у пациентов, необходимость эффективного способа введения целевой мультифокальной болезнь очевидна. В то время как системная доставка в значительной степени неэффективным из-за неэффективного трансдукции опухоли, внутриопухолевой приложения могут ограничить эффективность терапии нагнетаемого опухоли, оставляя uninjectable микроскопические повреждения, восприимчивых к прогрессирования заболевания.
Мы установили способ выделения печеночной артерии у крыс для введения онколитического вируса терапию в локорегионарной образом целевому ортотопическая HCC. Мы показали, что этот путь введения приводит к безопасным и effectiве трансдукции многоочаговых узелков ГЦК, что приводит к значительному увеличению продолжительности выживаемости у иммунокомпетентных крыс 8-10. Здесь мы опишем метод доступа, рассечения, и введение в печеночную артерию у крыс. Схема процедуры показана на рисунке 1 (ранее опубликована 9)
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: Следующие шаги были выполнены в соответствии с руководящими принципами нашего учреждения и местного самоуправления в Баварии, Германия. Все попытки воспроизвести этот протокол должен быть сделан при строгом соблюдении с местными руководящими принципами гуманного обращения с животными, как это диктуется местного ухода за животными и использование комитета. Например, многие институты требуют, чтобы стерильные перчатки изнашиваются во время операции на грызунах. Кроме того, работа с вирусами должны выполняться в соответствии с местными правилами, заботясь о личной и экологической безопасности. Необходимо соблюдать осторожность , чтобы правильно распоряжаться загрязненных отходов и для очистки инструментов и рабочее пространство (т.е. автоклавированием и очистки с помощью соответствующего противовирусного дезинфицирующего средства в соответствии с инструкциями завода - изготовителя).
1. Подготовка Прежде чем приступить к хирургии
- Стерилизовать хирургических инструментов (т.е. автоклавированием).
- Развести вирус к approprIate концентрация, которая будет варьироваться в зависимости от токсичности конкретного вируса используется и восприимчивость штамма крыс.
Примечание: Например, при использовании вируса везикулярного стоматита у самцов крыс Буффало, мы , как правило , вводят 10 7 КОЕ в объеме 1 мл, что максимальная допустимая доза в этой модели.- Предварительного заполнения вируса (с использованием асептической техники) в 1 мл шприцы, и прикрепить 30 G иглы, следя за тем, чтобы удалить воздух из шприца и иглы.
- Подготовьте хирургическое пространство со всеми материалами и оборудованием, необходимых, и распылите область с этанолом, чтобы продезинфицировать. Заполните небольшой сосуд с стерильным физиологическим раствором (0,9% NaCl) для увлажнения марлевые тампоны и ватным наконечником аппликаторы.
2. Подготовка крыс
- Администрирование обезболивающее (как указано местное по уходу за животными и использование комитета), в соответствующей дозе 30 мин до начала хирургической процедуры. Например,введение высокой дозы метамизол (100-200 мг / кг).
- Обезболить крысу с помощью ингаляции (изофлуран) или инъекционные (то есть смесь медетомидин (0,15 мг / кг), мидазолам (2 мг / кг), и фентанил (0,005 мг / кг), также известный как ММФ) наркозом. Администрирование isolflurane через испаритель на 1-3% и при необходимости отрегулировать для поддержания нормального дыхания и частоты сердечных сокращений.
- Прежде чем продолжить, убедитесь, что крыса полностью успокоены и не в состоянии чувствовать боль, зажимая ноги площадку и наблюдая за реакцией.
- Нанесите ветеринарную мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
- Бритье области живота от грудины до чуть выше половых органов с помощью небольшого ветеринарную машинки для стрижки волос. Позаботьтесь, чтобы достичь бритье, не повредив кожу.
- Зафиксировать крысу хирургической кровати с помощью липкой ленты на передних и задних конечностей, а также, при использовании ингаляционной анестезии, поместите морду в подходящего размера носовой конус. Поместите грелкупод крысу для поддержания температуры тела. Лечить брюшной области с использованием хирургического класса дезинфицирующее, с последующим промыванием спиртом и применением антисептического краски.
3. Лапаротомию
- С помощью небольшой изогнутый скальпель, например, # 15, сделать небольшой вертикальный разрез в скин-слое непосредственно вдоль средней линии. Расширьте надрез до мечевидный отросток. Затем надрезать мышечный слой, осторожно поднимая вверх с парой Adson щипцами, чтобы сделать скальпелем надрез, а затем продлить надрез до мечевидный отросток с хирургическими ножницами. Будьте осторожны, чтобы не проколоть органы брюшной полости или повредить мелкие сосуды по обе стороны от мечевидный отросток.
- Поместите втягивающим поперек живота, чтобы распространить мышцы и кожу и раскрыть всю область живота.
- Смочить два 7,5 х 7,5 см 2 марлевые тампоны со стерильным физиологическим раствором и распространять один в верхней части хирургическогооткрытие и один в нижней, как показано на рисунке 2А.
4. Выделение Артерии печени
- С помощью двух увлажненную ватную аппликатора тампоны, смоченные стерильным физиологическим раствором, осторожно поднимите кишечник и слепую кишку из брюшной полости, и поместите их на нижнюю марлевым тампоном. Сложите марлю над держать органы влажной и держать их из пути.
- С помощью двух смоченные хлопка аппликатора тампона, осторожно поднимите левую боковую лопасть печени, которая будет наиболее преобладающим лопасть с точки зрения на данном этапе. Флип мочку вверх, и, используя маленькую пару пружинных ножниц, разрезать через волокнистую мембрану на нижней стороне лопасти, что позволяет мочка быть полностью перевернуть вверх и отдохнуть на верхней части ранее размещенных марлевый тампон. Сложите марлевую тампон над лепестка, чтобы удерживать его на месте.
- Продолжить со следующей доли (передняя хвостатого), которая является в настоящее время наиболее передней доли в поле зрения. С ее помощь из рассекает микроскопа и тонким пинцетом, рассекают тонкую мембрану, окружающую лопасть для того, чтобы освободить его и дать ему возможность свободно перевернуть вверх. Поместите лопасть под марлевым тампоном вместе с левой боковой лопасти.
- Обратите внимание на заднюю хвостатого мочку, который теперь будет виден. Повторите шаг 4.3 полностью рассекают заднюю хвостатого мочку и перевернуть его вверх и внутрь марлю вместе с ранее размещенных долей печени.
- Просто под исходным положением хвостатой доли, найти общей печеночной артерии, которая теперь будет видна и легко узнается по сильной пульсацией. После артерию к анатомической справа, наблюдать толстый материал мембранную затемнение гастродуоденальной и соответствующие печеночные артерии от точки зрения. Использование тонких щипцов, поднимите этот материал и аккуратно разорвать ее, следя за тем, чтобы избежать каких-либо небольших судов в этом районе. Используйте хлопок аппликаторы тампонов, чтобы остановить любое кровотечение, которое может возникнуть.
- Найдите Arterial ветви, которые будут хорошо видны с помощью микроскопа рассекает когда мембраны правильно расчленены.
- С помощью двух тонких, атравматичные щипцов, тщательно препарировать общей печеночной артерии, гастродуоденальной артерии и надлежащего печеночной артерии таким образом, чтобы они освободились от окружающих мембран (рис 2В).
5. Подготовка артерию для инъекций
- Проходят 7-0 Prolene шов под гастродуоденальной артерии, а также использовать микро-иглы держатель , чтобы связать постоянную лигатуры на дальнем конце, как раз над бифуркацией (см рисунок 1 для правильного размещения). Разрешить около 2 дюймов шовного материала , остающиеся на концах, и зажим их с держателем иглы , чтобы вытащить артерию преподается, как показано на Рисунке 2С.
- Поместите небольшой зажим на общей печеночной артерии, временно блокировать кровоток (рис 2С).
Примечание: Это импortant, чтобы предотвратить массивное кровотечение, как только игла удаляется из артерии. Кроме того, закупорка артериального кровотока позволит более медленного введения вируса и лучшей эффективности трансдукции.- Важно: Работают быстро, чтобы ограничить количество времени, что кровоток останавливается - производить инъекцию и последующее лигирование артерии в течение 5 мин зажима общей печеночной артерии.
- Если это возможно, увеличить увеличение на рассекает микроскопом, таким образом, что гастродуоденальной артерии находится в резком фокусе, и оказывается достаточно большим, чтобы точно вставить 30г иглу. Поместите иглу шприца в просвет гастродуоденальной артерии и медленно толкать на поршень.
Примечание: Правильное размещение иглы приведет введенного раствора, протекающего непосредственно через соответствующую печеночной артерии и к печени.- Выполнение инъекции очень медленно, чтобы максимизировать эффективность трансдукции.
<литий> После того, как весь объем инъекции был введен, медленно втягивать иглу из артерии.
Примечание: Там не должно быть кровотечение из места инъекции. В случае, когда кровотечение имеет место, это указывает на то, что зажим не правильно установлен и должен быть быстро регулировать.
6. Закрытие
- Пропустите второй 7-0 Prolene шов под гастродуоденальной артерии, и связать вторую постоянную лигатуры выше места инъекции.
- Снимите зажим с общей печеночной артерии. Убедитесь, что поток крови через соответствующую печеночной артерии к печени была восстановлена.
- Отрежьте свободные концы лигатур.
- Убедитесь, что нет кровотечения перед возвращением кишечника и печени в брюшной полости. Позаботьтесь о том, что приложение возвращается в исходное положение.
- Шовный мышцы и кожу в отдельных слоях с использованием 4-0 викрил шовный материал с изогнутой иглой. Место continuouые швы примерно 1 мм друг от друга и вытянуть плотно.
- Во время фазы сшивающих, администрировать обезболивающее, такие как бупренорфин (0,05 мг / кг).
- Удалить крысу от наркоза. Если изофлуран была использована, крыса должна прийти в сознание в течение нескольких минут. Если ММФ был использован в качестве инъекционной анестезии, антагонизм его с подкожной инъекцией атипамезола (0,75 мг / кг) флумазенил (0,2 мг / кг) и налоксон (9,12 мг / кг), который будет полностью изменить эффекты анестезии и дают животным восстановить сознание в течение 20 мин. Держите крыс теплые с инфракрасной лампой потепления во время начальной фазы пробуждением.
- Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее.
- Не возвращать животное, которое перенес операцию на компании других животных, пока полностью не выздоровел.
- Монитор крыс после операции патологических признаков бедствия, и последующейс анальгетиков в соответствии с требованиями местного ухода за животными и использование комитета. Например, бупренорфин можно вводить в количестве 0,05 мг / кг каждые 12 ч.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
С опытом, с вероятностью успеха почти 100% (это означает, что артерии была успешно рассекали и вводили, и животное выжили операцию) может быть достигнута. Тем не менее, состояние здоровья крысы до операции (степень опухолевой, лежащей в основе функции печени и т.д.), очевидно , будет играть определенную роль в исходе хирургического вмешательства. После хирургического вмешательства крыс можно ожидать испытывать переходную потерю веса и незначительное, кратковременное повышение пе...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Несмотря на то, что прямая внутриопухолевая инъекция, несомненно, является самым простым методом эффективной опухолевой трансдукции одного опухолевого узла, печеночная артериальная инфузия представляет собой идеальный способ введения многоочаговой ортотопической ГЦК. Этот метод доказал свою безопасность и эффективность для лечения ГЦК у иммунокомпетентных крыс с онколитическими вирусами. Кроме того, поскольку пациенты с ГЦК обычно лечатся путем трансартериального применения химиоэмболизации, описанный здесь метод легко...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа поддержана подпроектами C6 и C7 SFB 824 (DFG Sonderforschungsbereich 824), Немецкое исследовательское общество, Бонн, Германия.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Ветеринарные машинки для стрижки | Aesculap | GT415 | Маленький, беспроводной триммер идеально подходит для удаления шерсти из операционной области |
| Стереомикроскоп | Zeiss | Stemi SV6 | |
| 30 G Иглы | Braun | 4656300 | 30 G x ½ « |
| Шприцы 1 мл | Braun | 9161406V | Туберкулиновый шприц |
| Одноразовый скальпель | Перо | 2975# | 15#15 лезвие |
| Стандартные хирургические ножницы | Fine Science Tools | 14001-13 | Острый/тупой, для раскрытия кожи и мышц |
| Щипцы Адсона | Fine Science Tools | 1101-12 | С зубьями, для захвата кожи и мышц |
| Alm retractor | Fine Science Tools | 17008-07 | С тупыми зубьями, для расширения брюшной полости во время операции |
| Марлевые тампоны | Lohmann & Rauscher | 18504 | 7,5 см x 7,5 см, перед использованием должен быть автоклавирован Ватные |
| аппликаторные палочки | Lohmann & Rauscher | 11970 | Стерильный |
| Предкишечник с тонким наконечником | Fine Science Tools | 11063-07 | 0,4 мм, угловой наконечник, для рассечения печеночной артерии |
| Весенние ножницы Vannas Fine | Science Tools | 91500-09 | Для деликатной резки |
| Микроиглодержатель | Fine Science Tools | 12076-12 | Для лигирования гастродуоденальной артерии |
| Иглодержатель | Fine Science Tools | 12005-15 | Губки из карбида вольфрама |
| 7-0 Проленовые шовные нити | Ethicon | 8648H | Полипропиленовый шовный материал с изогнутой иглой, для лигирования гастродуоденальной артерии |
| 4-0 Викриловые шовные нити | Ethicon | V3040H | С прикрепленной изогнутой иглой |
| Инфракрасная согревающая лампа | Beurer | IL11 | Для поддержания температуры тела после операции |
Ссылки
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Evidence-based health policy - lessons from the Global Burden of Disease Study. Science. 274, 740-743 (1996).
- Parkin, D. M., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. Int J Cancer. 94, 153-156 (2001).
- Bruix, J., Sala, M., Llovet, J. M. Chemoembolization for hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 127, 179-188 (2004).
- Miraglia, R., Pietrosi, G., Maruzzelli, L., Petridis, I., Caruso, S., Marrone, G., Mamone, G., Vizzini, G., Luca, A., Gridelli, B. Efficacy of transcatheter embolization/chemoembolization (TAE/TACE) for the treatment of single hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 13, 2952-2955 (2007).
- Breedis, C., Young, G. The blood supply of neoplasms in the liver. Am J Pathol. 30, 969-977 (1954).
- Nakashima, T., Kojiro, M. Pathologic characteristics of hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis. 6, 259-266 (1986).
- Heo, J., et al. Randomized dose-finding clinical trial of oncolytic immunotherapeutic vaccinia JX-594 in liver cancer. Nat Med. 19, 329-336 (2013).
- Altomonte, J., Marozin, S., Schmid, R. M., Ebert, O. Engineered newcastle disease virus as an improved oncolytic agent against hepatocellular carcinoma. Mol Ther. 18, 275-284 (2010).
- Shinozaki, K., Ebert, O., Kournioti, C., Tai, Y. S., Woo, S. L. Oncolysis of multifocal hepatocellular carcinoma in the rat liver by hepatic artery infusion of vesicular stomatitis virus. Mol Ther. 9, 368-376 (2004).
- Shinozaki, K., Ebert, O., Woo, S. L. Eradication of advanced hepatocellular carcinoma in rats via repeated hepatic arterial infusions of recombinant VSV. Hepatology. 41, 196-203 (2005).
- Altomonte, J., et al. Synergistic antitumor effects of transarterial viroembolization for multifocal hepatocellular carcinoma in rats. Hepatology. 48, 1864-1873 (2008).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
