Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Лечение СЦА1 мышей с водорастворимых соединений для неспецифического увеличения митохондриальной функции

10.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53758

⸱

22 января 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Program, Skidmore College, 2Chemistry Department, Skidmore College, 3Health and Exercise Science Department, Skidmore College

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем биохимический и поведенческий протокол для оценки эффективности водорастворимых соединений, нацеленных на митохондрии, для лечения спиноцеребеллярной атаксии 1 типа (SCA1) и других нейродегенеративных заболеваний мозжечка.

Аннотация

Митохондриальная дисфункция играет важную роль в процессе старения и при нейродегенеративных заболеваниях, включая несколько наследственных спиноцеребеллярные атаксии и других двигательных расстройств, отмеченных прогрессирующей дегенерацией мозжечка. Целью данного протокола является оценка митохондриальную дисфункцию в спиноцеребеллярная типа атаксии 1 (SCA1) и оценки эффективности фармакологической нацеливания метаболического дыхания через растворимое в воде соединение янтарной кислоты, чтобы замедлить прогрессирование заболевания. Этот подход применим и к другим мозжечковых заболеваний и может быть адаптирован к множеству водорастворимых терапии.

Пример естественных условиях анализа митохондриального дыхания используется для выявления и количественной оценки , связанных с болезнью изменений в митохондриальной функции. С помощью генетических данных (неопубликованные данные), а также протеомики доказательства митохондриальной дисфункции в модели СЦА1 мыши, мы оцениваем эффективность лечения с водорастворимым метаболической бустера Succinic кислоты путем растворения этого соединения непосредственно в питьевую воду домой клетке. Способность препарата проходить через гематоэнцефалический барьер может быть выведена с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Эффективность этих соединений могут быть протестированы с использованием нескольких поведенческих парадигм включая ускоряющего rotarod, испытания луча баланса и анализа следа. Cytoarchitectural целостность мозжечка можно оценить с помощью иммунофлуоресцентных анализов, которые обнаруживают клеточные ядра Пуркинье и дендритов клеток Пуркинье и сомы. Эти методы являются надежными методы для определения дисфункцию митохондрий и эффективности лечения водорастворимых соединений в мозжечковой нейродегенеративных заболеваний.

Введение

Митохондрии являются ключевыми производителями аденозинтрифосфата (АТФ), которая является основным коферментом для клеточной энергии, с большинством митохондриальной АТФ производится путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS) с использованием электронно-транспортной цепи. Мозг, учитывая его высокие метаболические потребности и зависимость от окислительного фосфорилирования для питания нейронной активности, весьма восприимчивы к митохондриальной дисфункции. В результате, митохондриальной дисфункцией срабатывает во время процесса старения 1 и участвует в патогенезе нескольких нейродегенеративных заболеваний , 2, 3, 4. Таким образом, отсюда следует, что митохондрии являются привлекательными терапевтическими мишенями для нейродегенерации.

В этом протоколе, мы приняли использование спиноцеребеллярная атаксия типа 1 (СЦА1) в качестве модели нейродегенеративных заболеваний для изучения митохондрийл дисфункции и развитие митохондриальных-целенаправленной терапии. СЦА1 вызывается мутацией полиглутаминового (polyQ) расширения повтора в гене продукта атаксина-1 , который вызывает прогрессирующей дегенерацией нейронов Пуркинье в мозжечке и нейроны других областей головного мозга. Трансгенная линия мыши используется здесь (обозначается как СЦА1 мыши), выражающее polyQ-мутант атаксина-1 трансген под контролем специфического Пуркинье-клеточного промотора, позволяет целевого анализа компонента Пуркинье-клеток СЦА1 5. SCA1 мышей подвергаются постепенной дегенерации клеток Пуркинье и развивать атаксическая походку 6.

Митохондриальная дисфункция и комплексная митохондриальным целевой эффективность лечения может быть оценена с батареей молекулярных и поведенческих анализов. Митохондриальная дисфункция комплекс измеряется с помощью экс естественных условиях дыхания анализов , которые обнаруживают измененную потребление кислорода в мозжечковой тканиналичие электронно - транспортной цепи субстратов и ингибиторов 7. Дыхательные анализы ранее использовались с проницаемыми ткани, митохондриальных локализует и цельной ткани 7, 8, 9. Они позволяют прямой оценки митохондриальной функции в отличие от морфологических методов сбора данных, таких как просвечивающей электронной микроскопии или иммунофлуоресцентного окрашивания. Использование всей ткани , а не изолированных митохондриях предотвращает предвзятое выбор здоровых митохондрий , которые могут возникнуть в процессе изоляции 7. Когда приспособлено к протоколу, как показано, анализ дыхания является ценным методом для выявления митохондриальной дисфункции в мозжечке нейродегенеративных болезненных состояний.

Неспецифические активаторы обмена веществ могут быть использованы для вывода дисфункцию митохондрий в моделях трансгенных мышах нейродегенеративных diseasе и помощь в разработке новых методов лечения. Кверцетин, коэнзим Q10 и креатин все было показано , для улучшения нейродегенеративного патологии болезни у больных и у животных моделях нейродегенеративных заболеваний 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Здесь мы представляем новый метаболический активатор, янтарную кислоту, чтобы стимулировать обмен веществ и повысить митохондриальную функцию в нейродегенеративных заболеваний. Для того, чтобы гарантировать , что активатор пересекает гематоэнцефалический барьер, ВЭЖХ использовали для обнаружения доставки в нервной ткани у мышей , обработанных 17.

Для того, чтобы оценить терапевтические эффекты метаболически целевых водорастворимых соединений, таких как янтарная кислота, можно использовать батарею поведенческих парадигм и иммунопатологические исследований. Duе к дефициту координации движений , обнаруженных в мозжечковой нейродегенеративных заболеваний, анализ ВПП след, анализа луча и ускоряющего вращающегося анализа стержня используются для обнаружения спасение поведенческой патологии 6, 18, 19. Эти меры дополняются иммунопатологической оценки мозжечковой цитоархитектуры путем оценки толщины молекулярного слоя (определяется как Пуркинье клеток дендритных длины оправки) и Пуркинье подсчета клеток Сома в пределах определенного дольки мозжечка ткани 6, 20, 21. Здесь мы представляем несколько нейропатологических и поведенческие методы для выявления и лечения митохондриальной дисфункции с метаболически целевых растворимых в воде соединений.

Мы используем ех естественных условиях анализа митохондриального дыхания для анализа митохондриальной дисфункции в СЦА1 Transgenic мыши. Более того, мы показали, что симптомы болезни и патологии улучшаются водорастворимого митохондриальной бустер янтарной кислоты, далее вовлекая митохондриальную дисфункцию в прогрессии заболевания СЦА1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол соответствует рекомендациям IACUC на Skidmore College для работы с мышами.

1. Лечение с помощью растворимых в воде соединений

  1. Растворите янтарную кислоту до концентрации 0,75 мг / мл в клетке питьевой воде. Следует отметить, что любое водорастворимое соединение интерес в нужной концентрации может быть заменен на данном этапе. Перемешать раствор, чтобы убедиться, что соединение полностью растворяется.
  2. После того, как мышей достигают желаемого возраста лечения, замены домашней клетки питьевой воды из состояния группы обработки с раствором на стадии 1.1.
  3. Измерение веса обоих лечения и контроля бутылок группа воды ежедневно, чтобы гарантировать, что и обработанных и контрольных мышей пьют такое же количество воды. Используйте эти измерения для расчета общей дозы препарата в клетку. Продолжать лечение в течение всего эксперимента и контролировать вес бутылки.

2. Анализ Footprint

  1. Поместите взлетно-посадочной полосы на пол илистол в закрытом помещении. Установите взлетно - посадочной полосы под небольшим углом вверх по направлению к дому коробки выстроились с подстилки и поощрений пищи (например , приторный зерновых). Линия длины взлетно-посадочной полосы с листом белой бумаги. Разрешить предмет акклиматизироваться в домашней коробке в течение 5 мин.
  2. Удалить тему из дома коробки и краски левый и правый задние ноги, соответственно, с синей и красной нетоксичной краски на водной основе. Краска отпечатки будут использоваться для расчета поведенческих измерений множественных выходов.
  3. Поместите объект в начале взлетно-посадочной полосы и позволяют при условии, чтобы идти к дому коробки. После того, как объект достиг домашнего окна, закрыть люк, и позволяют при условии, чтобы остаться в пределах домашней коробки в течение одной минуты, прежде чем вернуться к соответствующему вольере. Очистите коробку взлетно-посадочной полосы и домой с 30% этанола и заменить постельные принадлежности, наградить еду, и взлетно-посадочной полосы бумаги для следующего объекта.
  4. Количественно количество шагов, ширина ворот, угол шага, и число витков, принятыхпо теме в соответствии с аналитическими методами , описанными ранее 6. Успешное испытание следа определяется как минимум 5 последовательных следов, в котором субъект идет к коробке цели, не оборачиваясь или остановки.

3. Анализ луча

  1. Установите аппарат луча в соответствии с поперечиной характеристикам , описанным ранее 6 со следующими 6 лучей: луч 1 = прямоугольный, ширина 28 мм; луч 2 = круглый, диаметром 28 мм; балка 3 = прямоугольный, ширина 12 мм; луч 4 = круглый, диаметром 12 мм; балка 5 = прямоугольная, ширина 6 мм; луч 6 = круглый, диаметром 6 мм. На одном конце балки, создать затемненный домашний ящик с вознаграждением еды.
  2. Обучить предметы на пучке, собрать аппарат с лучом 3. Аккуратно поместите объект на конце луча напротив главной коробке, и позволяют при условии ходить поперек. Разрешить каждому предмету до трех 2-минутных испытаний для достижения успешного запуска, Определяется как пересечение луча и выходит на финишную коробку в течение 2 мин. Между испытаний, пусть предметную отдых в домашнем поле в течение 2 мин. В перерывах между субъектами, очистить поле луча и домой с 30% -ным этанолом и заменить пищу вознаграждение в рамках подготовки к следующему вопросу.
  3. Повторите шаг 3,2 один раз в день в течение следующих двух дней, в результате чего в общей сложности 3 последовательных учебных дней. Испытания день, 4 день, должны последовательно следовать тренировочные дни.
  4. Для проверки предметов на 4-й день, сначала соберите аппарат с балкой 1 и настроить домашний ящик, как описано в пункте 3.1. Поместите видеокамеру в передней части устройства и убедитесь, что полное устройство луч может быть четко запечатлен на видео. Начните запись и поместите первый предмет на балку напротив главной коробки, что позволяет до 3-х 2-х мин попыток успешно завершить судебный процесс. Между испытаний, позволяют при условии отдыха в течение 2 мин в домашнем поле.
  5. Продолжайте испытуемый на каждой из шести лучей в числовом порядке,позволяя тему отдыхать в течение 2 минут в домашнем поле перед началом следующего луча. Между субъектами, прочистить каждый луч и домашний ящик с 30% -ным этанолом и заменить пищу вознаграждение в рамках подготовки к каждому предмету.
    1. Видеокассета каждое испытание и записать число успешных испытаний по каждому предмету на пучок следующим образом: "1" означает предмет был успешным на первом испытании, '2' указывает на то предмет был успешным на втором испытании, '3' указывает на то предмет был успешным на третьем и последнем испытании, и '4' указывает на то предмет не был успешным ни на одном из трех испытаний.
  6. Использование видеозаписи испытаний измерительных footslips по бомбардиров, ослепленные условиям эксперимента субъекта. Определение footslip как заднего отдела стопы, который находится в прямой видимости погружного камеры ниже теоретической средней линии по всей длине балки. Средние показатели footslip из нескольких бомбардиров.
  7. Для анализа количества Successful испытания и количество данных footslips, вычислить среднее значение и стандартное отклонение в пределах каждого генотипа и условия эксперимента когорты. Провести одну сторону ANOVA и множественные сравнения апостериорных анализ , чтобы определить, есть ли эффект лечения и генотипа по числу успешных испытаний и количество footslips.

4. Ускорение Rotarod

  1. Акклиматизироваться предметы в комнате анализа за 10 минут до начала судебного процесса. В течение этого периода акклиматизации, подготовить аппарат rotarod, очистке каждой из полос аппарата с 30% -ным этанолом.
  2. Откройте программу rotarod и установить параметры запуска до 4 оборотов в минуту, параметры ускорения до 5 установок мин и конечной скоростью до 40 оборотов в минуту. Эти параметры обеспечивают постоянное ускорение от 4 - 40 оборотов в минуту в течение 5 мин. Мыши могут оставаться на rotarod при 40 оборотах в минуту в течение еще 5 мин после периода ускорения для максимальной длины пробега 10 мин.
  3. Пост-акклиматизации, место предметы оNto в rotarod в их соответствующих полос движения в то время как стержень вращается со скоростью 4 оборотов в минуту. После того, как все предметы в своих коммуникациях, начать первый судебный процесс. Запись задержки падать с помощью программного обеспечения прибора; вторичный таймер может быть использован в качестве резервного.
  4. После завершения исследования, позволяют каждому предмету отдохнуть в их соответствующих полос движения резервуаров в течение десяти минут до начала следующего судебного процесса, чтобы предотвратить усталость.
  5. Повторите шаги 4.3 и 4.4 в общей сложности четырех испытаний.
  6. Повторите шаги 4.3 - 4.5 в общей сложности четыре дня подряд, продолжая лечение в течение всего испытательного срока. После завершения количественной оценки задержки упасть вращающийся стержень для каждого испытания по каждому предмету 6.

5. мозжечка Добыча и фиксация

  1. Эвтаназии мышей с помощью асфиксии диоксида углерода в соответствии с ведомственным руководящим принципам IACUC. Поместите объект в камеру диоксида углерода, и выпускают углекислый газ в камеру. Смотретьживотное в любое время во время стадии эвтаназии и не оставлять животное без присмотра.
  2. После того, как дыхание прекратилось, и предметы не показывают оставшееся восприятие боли Хинд давления стопы, удалить предмет из камеры и сделать превосходную срединный разрез через эпителиальной ткани с середины черепа каудально к основанию черепа через эпителиальной ткани.
  3. Использование рассечение ножницами, вырезать череп от основания в спинном мозге через стреловидного шва к темени. Вырезать в поперечном направлении через каждую венечного шва, прежде чем стаскивать лобной, теменной и interparietal кости тупыми щипцами.
  4. Используйте тупой пинцет, чтобы разорвать кости латерального мозжечка. Используйте пинцет, чтобы отделить мозжечок от бугров четверохолмия и стволе головного мозга и выталкивать ее из остальной части ткани. Отделить мозжечок в левое и правое полушария с пинцетом.
  5. Немедленно поместите правую мозжечка в жидкий азот , чтобы сохранить для ВЭЖХ анализис и левый мозжечка в предварительно охлажденный 4% параформальдегида (PFA) для фиксации ткани. Урожай любой другой ткани интерес, прежде чем разрывая аорту и отбрасывая тушу в соответствии с правилами институциональным IACUC.
    ВНИМАНИЕ: PFA является высокотоксичным, легковоспламеняющиеся и коррозионные.
  6. Через двадцать четыре часа после экстракции, моют ткани зафиксированный в PFA (4% в ПБС) в фосфатном буферном растворе (PBS) (три раза, 5 мин / промывку) перед помещением ткани, в 30% сахарозы при температуре 4 ° С в течение до 2 недели.

6. Анализ иммунопатологии

  1. Закрепить трубку из саней микротома к раковине кран и блок управления температурой. С помощью блока управления температурой для охлаждения микротомных стадии до -25 ° C. Установите секционирования толщину диск до 50 мкм.
    Примечание: Если диск на санно микротомом не достигает 50 мкм, установите диск на более тонкой настройки и умножить толщину путем сдвига настройки соответствующим образом (например, установить дМВЛ до 10 мкм и сдвиг в пять раз , прежде чем секционирования для общей толщиной 50 мкм).
  2. Приложите часть гривенник размера оптимальной температуры резания (OTC) раствора на сцену. Перед ПВР замерзает, используйте пинцет, чтобы позиционировать полушарие, так что в середине сагиттальной вырезать поверхность лицевой стороной вниз на слое OTC. Работая быстро, аккуратно сориентировать ткани с щипцами так, что боковая вершина полушария направлена ​​в сторону ножа, превосходящей на сцену. Дайте OTC заморозить полностью.
    1. Работа в слоях, добавить дополнительный OTC вокруг ткани, позволяя ПВР полностью заморозить перед добавлением следующего слоя. Добавьте тонкий слой OTC на верхней части ткани и замораживанию.
  3. Раздел ткань, распределяя одинаковый вес тела на режущего лезвия в то время как секционирования. Соберите секции с помощью тонкой кисти художника и место в соответствующей маркировкой луночного планшета, содержащего 1x PBS. Между секциями, повторно установить толщину порезки насанках микротомных диск, в случае необходимости, до 50 мкм.
  4. Заменить PBS в каждую лунку луночного планшета с раствором мочевины [0,01 М мочевины в PBS] поместить пластину на льду. Когда все будет готово, удалить пластину из льда и кипятить секций в растворе мочевины три раза в течение 15 секунд каждый раз, когда разоблачить эпитопы для иммунноокрашивания. Этот шаг может быть легко достигнуто путем размещения пластины на нагревательном блоке, установленного до температуры кипения. Между каждой стадией кипения, охлаждают пластину, содержащую срезах тканей на льду.
    Примечание: При выполнении мочевины, блокирование, первичное антитело, вторичное антитело и шаги DAPI в 96-луночный планшет, то в 100 мкл объемы по всему. Если другой хорошего размера используется, регулировать объемы реагентов соответственно. Вместо нагревательного блока, микроволновая печь может быть использована для кипячения образцов ткани в мочевине. Образцы микроволновой печи на установки в течение трех 15 с интервалами высокой мощности.
  5. Сообщение кипения, мыть секциям три раза, каждый раз удаляя текущее решение, заменив решениес 1x PBS и встряхивания в течение 10 мин.
  6. Блочные участки с раствором осле в сыворотке крови (3% нормальной сыворотки осла, 0,3% Triton X-100 в PBS) путем инкубирования ткани в сыворотке крови в течение одного часа при осторожном перемешивании при комнатной температуре. Удалить осла раствор сыворотки.
  7. Разделы этикетка с 0,2 мкг / мл анти-кальбиндин и 1: 2000 анти-атаксина-1 антитела (11NQ) 16 в ослиного растворе сыворотки и инкубируют при 4 ° С в течение 72 ч при осторожном перемешивании.
  8. Промыть участки с PBS, как на шаге 6.5 перед инкубацией секций в соответствующем вторичного антитела (1: 500 Alexa Fluor-488-анти-козел и 1: 500 Alexa Fluor-594-анти-кроличьи антитела, разбавленного в растворе осле сыворотки) при 4 ° С в течение 48 ч при осторожном перемешивании.
  9. Промыть секциям три раза ПБС, как на стадии 6,5 до ядер мечения клеток с использованием DAPI (4 ', 6-диамидино-2-phenylindol) раствора, разбавленного до конечной концентрации 0,5 мкг / мл в PBS. DAPI инкубации не должна превышать десяти минут. Удалить SOLUTIOп и промывают PBS, как на этапе 6.5.
  10. Крепление ткани на 2% покрытые желатином слайды с монтажной средой для снижения фотообесцвечивания. Покровное и печать с лаком для ногтей.
  11. С помощью сканирующего конфокального микроскопа найти первичную борозду мозжечка при светлопольному свете. С целью 10X UIS2, сканирование и последовательно возбуждают DAPI, AlexaFluor-488 и AlexaFluor-594 каналов с использованием диодного лазера 405 нм, аргон газовый лазер на 488 нм и диодный лазер 559 нм соответственно, в сочетании с DM488 / 559 нм дихроичный делитель луча. Отдельные и собирать свет, излучаемый с помощью SDM490 и светоделители SDM560 и BA575-675 полосовой фильтр, соответственно.
    1. Для каждого канала, построить Z-стек в пределах первичной борозды с г = 20 мкм и шаг = 0,1 мкм. С помощью программного обеспечения последующей обработки, поставляемый с конфокальной микроскопии, чтобы добавить в размер маркера для конечного изображения.
      Примечание: Альтернативные лазеры, фильтры и флуорофоры могут быть замещенными основаны на Доступностти. Если AlexaFluor-488 или AlexaFluor-594 обнаружения слабых, фосфид галлия (GaAsP) высокочувствительный детектор может быть использован для усиления сигнала и при их наличии.

7. Количественная Молекулярный Толщина слоя и клеток Пуркинье Числа

  1. Использование ImageJ, открыть Z-стека образ окрашенного первичного трещине и разделить каждое изображение в его красный, синий и зеленый каналы, выбрав 'Image' из строки меню, "цвет" на вкладке Изображение и "разбитого каналов" от цвета вкладка.
  2. Создать максимальную Z проекцию каждого канала, который был разделен. Когда канал изображения интереса открыт, выберите 'Image' из строки меню, "Разделы" на вкладке Image и "Z-проекта" на вкладке "Разделы". В меню "Z-проекта" команду, выберите "Max Z проекцию" и нажмите "Хорошо". Повторите эти действия для каждого канала.
  3. Откройте Счетчик клеток плагин, выбрав пункт "Плагины" из-йе Строка меню "Анализ" на вкладке Плагины и "Счетчик клеток" на вкладке Analyze.
    Примечание: ImageJ и ImageJ Счетчик клеток плагин можно загрузить на веб-сайтах, представленных в таблице материалов и оборудования.
  4. Количественно количество клеток Пуркинье путем подсчета атаксина-1-меченых ядер, которые расположены вдоль заранее определенного участка передней и задней длины первичного трещине 200 мкм. С помощью пороговой карты, выбрав "Image" из строки меню "Настройка" на вкладке Image и "Threshold" на вкладке Adjust, чтобы сделать пороговый карту канала, представляющего интерес (красный в случае атаксина-1 меченых ядер ).
    1. Выберите диапазон пикселей, которые могут быть нормализованы по всей количественной оценке (31-225 пикселей, например). Откажитесь шум от изображений, проверяя "темный фон" окно в окне Threshold. Сигнал изображения может быть инвертирован для простоты подсчета.
  5. Количественно thic молекулярного слояkness в зеленом канале, используя "Разделить каналы" и "Порог" Карта инструмента, как в шагах 7.1 и 7.2. С помощью маркера на размер каждого изображения в качестве ориентира, случайным образом измерить три длины молекулярного слоя внутри каждого из двух назначенных 200 мкм участки каждого первичного фиссур изображения. Проводите измерения от проксимального конца дендритов Пуркинье у основания сомы Пуркинье к дистальному концу дендритов Пуркинье.
  6. Запись Пуркинье количества клеток и толщина молекулярного слоя как средство плюс или минус стандартная ошибка. Выполните односторонний ANOVA с множественными сравнениями ретроспективном анализа для оценки влияния условий обработки или генотипа по количеству клеток и длины дендритов.

8. Анализ ВЭЖХ мозжечковой янтарной кислоты концентрации отходов после обработки

  1. Подготовка пробы для анализа
    1. Взвесить каждую заготовленную правое полушарие мозжечка доиспользовать в анализе ВЭЖХ. Фарш Полушарные половин по одному за раз в предварительно охлажденный гомогенизатора Даунса гомогенизатора и добавляют 0,5 мл 75:25 (по объему) воды: метанол раствора в каждую половину гомогенизированный 17.
    2. Используя узкую предварительно охлажденный гомогенизатора, грубо распадаться ткань с 5 Доунса инсультов. Продолжайте мелко рубите каждый образец ткани с более широким гомогенизатор, применяя 20 Доунса инсультов.
    3. Передача гомогенатах предварительно охлажденной микроцентрифужных трубки. После каждой пробы прополоскать гомогенизатор с 0,5 мл охлажденного льдом вода: метанол раствор и добавьте ополаскивание в микроцентрифужных трубки.
    4. Образцы гомогената центрифуге при 1300 мкг в течение 30 мин при 25 ° С и собирают супернатант в чистую центрифужную пробирку.
    5. Фильтр супернатант через центробежную блок фильтра размещалась с регенерированного целлюлозного фильтра 10 килодальтон (кД), номинальным молекулярным весом не. Если сразу не работает анализ ВЭЖХ, хранить образцы фильтруют при температуре -80 °C.
  2. ВЭЖХ - измерительные приборы и условия
    1. Вложить хроматографическую колонку ионом эксклюзионной с длиной по меньшей мере 30 см и размером частиц 7 мкм в жидкостном хроматографе высокого разрешени.
    2. Готовят и дегазацию достаточное количество 1 мМ ацетатного буфера доводили до рН 5.
    3. Установите ВЭЖХ с подвижной фазовой скоростью 0,8 мл / мин. При использовании UV-VIS детектор, детектор выбрать длину волны 224 нм. Типичное время элюирования для янтарной кислоты в этих условиях составляет от 10 до 12 мин.
  3. Запуск и анализ стандартов и образцов
    1. Подготовить набор стандартов в ацетатного буфера подвижной фазы с концентрациями янтарной кислоты от 0 до 250 частей на миллион.
    2. Запуск каждого стандарта и подготовки калибровочной кривой с использованием площади пика, измеренный от каждого прогона.
    3. После того, как точная стандартная кривая получается, запустить предварительно подготовленные образцы разводили в ацетатном буфере.Для большей точности измерений, образцы могут быть подсыпали известными концентрациями янтарной кислоты, которые были разведенных в подвижной фазе. Выполнить все образцы в трех экземплярах.
    4. Анализ ВЭЖХ хроматограммы для определения концентрации янтарной кислоты в образцах с помощью калибровочной кривой, а затем умножением на объем образца, и деления исходной массы образца.

9. Ex Vivo Анализ мозжечковой митохондриальной Функциональность С помощью блока управления Электрод кислорода

  1. Создание Кларк типа электрод , используя имеющийся в продаже систему путем первого нанесения капли хлорида калия (50% KCl , W об /) раствора на платиновом катоде, резка 1,5 см 2 кусок коммерческого табака папиросную бумагу и аккуратно поместив бумагу платиновый катод.
    1. Накройте катод и анод , окружающий с 2,5 см 2 куска политетрафторэтилена (PTFE) бумаги и ожидающий обеспечения как MembRanes с кольцами O, убедившись, что нет никаких складок или пузырьков внутри мембран. Капельное 50% раствора хлорида калия в окружающую хорошо.
  2. Закрепите Premade электрод в аналитической камере и залить насыщенной воздухом воде. Нагреть камеру до 30 ° С, добавить 0,8 см мешалку к раствору и перемешивают при 70 оборотах в минуту с помощью программного обеспечения прибора. Калибровка камеры путем установления нулевой кислорода. Для этого последовательно добавляют несколько кристаллов восстановителя дитионита натрия агента к раствору.
    1. После того, как калибровка достигается, моют камеру один раз 70% этанолом, а затем промывают шесть раз деионизированной водой , прежде чем разрешить камеру для акклиматизации в 1,5 мл дыхания буфера (5 мМ MgCl 2, 60 мМ КСl, 100 мМ маннита, 10 мМ КН 2 РО 4, 0,5 мМ Na 2 ЭДТА, 60 мМ Трис-HCl [pH 7,4]) 7.
      Примечание: все следы дитионита натрия должны быть полностью удалены во время стадий промывки, прежде чем пытаться измеритьконцентрации кислорода во время экспериментов дыхания.
  3. Осторожно гомогенизировать весили полушарий мозжечка в 0,5 мл гомогената буфера (0,25 М сахарозы, 0,5 мМ ЭДТА, 50 мМ Трис-HCl [pH 7,4]). Передача гомогената в чистую 1,5 мл трубки микроцентрифужных и держать охлажденным до начала анализа.
  4. Добавьте гомогената в камеру, достигая конечного объема 2 мл. Проницаемыми мозжечковая гомогената путем добавления 40 мкл дигитонина или сапонина (5 мг / мл); позволяют гомогенизированной ткани инкубируют в течение 10 мин.
    Примечание: дигитониновых и сапонины токсичны, и время инкубации должно быть сведено к минимуму.
  5. Для того, чтобы начать запись потребления кислорода, определяют митохондриальную функцию посредством активации и ингибирования окислительного фосфорилирования цепи с использованием субстратов и ингибиторов, соответственно (3 мин записи на подложке).
    1. Добавить подложках с использованием чистых шприцев следующим образом: 10 мкл 2 М глутамата [конечная концентрация (к) 0,01 М],5 мкл 0,8 М малат [FC 2 мМ], 20 мкл 0,5 М аденозин дифосфат (АДФ) [FC 5 мМ], 1 мкл 1 мМ ротенон [FC 0,5 мкМ], 20 мкл 1М янтарной кислоты [10 мМ], 1 мкл 5 мМ антимицину а [2,5 мкМ FC], 1 мкл 0,8 М аскорбата [0,4 мМ FC], и 5 мкл 0,2 М тетраметил-п-фенилендиамин (TMPD). [FC 0,5 мМ] При добавлении субстратов в камеру быть осторожным, чтобы не вводить пузырьков воздуха в систему.
      Примечание: Подробная информация о функциональной эффекту , вызванному каждого субстрата и ингибитора описана в ранее опубликованной протоколу 7. Кривые индивидуальная доза-реакция может потребоваться быть сгенерированы, чтобы определить оптимальные концентрации субстратов и ингибиторов в препаратах / тканей / видов, ранее не изученных. Подобным же образом, протокол может быть оптимизирован для врожденных метаболических тенденций ткани / разновидности изучаемого, такие как предпочтения субстрата.
  6. После сбора данных завершена, мягкоspirate мозжечка гомогенаты и очистить камеру с этанолом и деионизированной водой. После очистки дополнительные мозжечковые образцы гомогената можно работать без дополнительной калибровки до тех пор, пока из PTFE мембрана остается неповрежденной. После окончательного завершения, чистый электрод деионизированной водой и этанолом и магазин с силикагелем или осушителем.
    Примечание: Между тот же день работает, заполнить камеру с деионизованной водой гарантируя, что мембрана не высыхала.
  7. Используя лист данных, созданный с помощью программного обеспечения прибора, экспорт 40 мин данных дыхания начиная с двух минут после добавления субстрата к программе электронных таблиц.
  8. Вычислить скорость дыхания на субстрат или ингибитор. Нормализация данных путем деления общего дыхания на частоту дыхания во время добавления субстрата аскорбат-ТМФД.
    Примечание: Частота дыхания может быть дополнительно нормированы на содержание белка в ткани, которая может быть особенно желательным в нейродегенерации экспериментахв которых содержание ткани может варьироваться. Для этого оставляют на 50 мкл образца гомогената (со стадии 9.3) для использования в стандартном анализе белка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Благодаря фармакологической нацеливания мозжечковой митохондрий с янтарной кислотой, мы можем предотвратить нарушение функции митохондрий в модели мыши мозжечка нейродегенеративных СЦА1 заболевания. Канонический донор электронов сукцинатдегидрогеназы, янтарная кислота, растворяли в домашней клетке питьевой воде СЦА1 мышей в течение одного месяца, с начала поведенческой оценки в течение второй недели лечения и нейропатологического оценки после окончания лечения (рис

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Если эти методы используются, как описано, они способны обнаруживать и облегчения окислительного фосфорилирования опосредованную дисфункцию митохондрий в мозжечке нейродегенеративных моделях мышей заболевание. Объединенные биохимические и поведенческие тесты являются многообразные методы определения степени митохондриальной вклада в мозжечковой нейродегенеративных патологии болезни. Путем обработки мышей с янтарной кислотой, чтобы стимулировать обмен веществ и повысить митохондриальную функцию, мы можем показать спасени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить доктора Гарри Орра из Университета Миннесоты за его щедрый дар трансгенных мышей. Мы также хотели бы поблагодарить следующих выпускников колледжа Скидмор за их работу по проведению вышеупомянутых экспериментов: Монику Вильегас, Портер Холл, Митчелл Спринг, Николас Токер, Дженни Чжан, Хлою Ларсон и Чейанн Слокам. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить колледж Скидмор за финансирование разработки этих методов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АденозиндифосфатSigma AldrichA2754ADP
АскорбатSigma AldrichA7631
Бычий сывороточный альбуминSigma AldrichA2153BSA
4',6-Diamidino-2-фенилиндолSigma AldrichD9542
DAPI DigitoninSigma AldrichD141
ДитиотрейтолSigma AldrichD0632DTT
Сыворотка для осликовSigma AldrichD9663
ГлутаматSigma Aldrich1446600
Малат Sigma Aldrich6994
МаннитSigma AldrichM4125
ПараформальдегидSigma AldrichP6148
Калий-лактобионатБио-сахар69313-67-3
РотенонСигма ОлдричR8875
СапонинСигма Олдрич47036
Янтарная кислотаСигма ОлдричS3674
N,N,N′,N′ -тетраметил-p-фенилендиаминSigma AldrichT7394TMPD
Triton X-100Sigma AldrichT9284
мочевинаSigma AldrichU0631
Vectashield монтажная средаVector LabsH-1000
антитела
11NQ антитела (анти-атаксин-1 )Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801
Alexa Fluor 488 вторичное антитело против мышейLife TechnologiesA-11015
Alexa Fluor 594 вторичное антитело против кроликаLife TechnologiesA-11012
антитело к кальбиндину (козье)Santa CruzC-20
Animals
Контрольные трансгенные мыши ГарриОрр, доктор философииA02Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
мышей SCA1Harry Orr, Ph.D.B05Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
мыши дикого типаЛаборатория Джексона001800
Equipment
ESM-100L микротомERMASledge
микротом Fluoview FV1200 Конфокальный микроскопOlympus
Глицерол-желатиновые стеклаFD Neuro TechnologiesPO101
Шприц HamiltonSigma AldrichVCAT 80465
OXYT1 Блок управления электродомOxytherm Hansatech Instruments
P.T.F.E. бумагаCole-ParmerUX-08277-15
Rotallion RotarodPPP & Gсвяжитесь с автором-корреспондентом для информации
Ultimate 3000 HPLCDionex
Software
ImageJНациональный институт здравоохраненияhttp://imagej.nih.gov/ij/
Плагин счетчика клеток (для ImageJ)Национальный институт здравоохраненияhttp://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html
3P& G Rota-Rod v3.3.3 (программное обеспечение rotarod)PPP& Gсвяжитесь с автором-корреспондентом для получения информации
Phidget21.dll (требуется для программного обеспечения rotarod)DLL-Files.comhttps://www.dll-files.com/phidget21.dll.html

Ссылки

  1. Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
  2. Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
  3. Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
  4. Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease. Biomed Res Int. 2014, 175062(2014).
  5. Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
  6. Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
  7. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
  8. Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
  9. Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
  10. Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
  11. Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
  12. Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
  13. Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
  14. Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
  15. Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
  16. Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
  17. Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
  18. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
  19. Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
  20. Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
  21. Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
  22. Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
  23. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  24. Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Лечение СЦА1 мышей с водорастворимых соединений для неспецифического увеличения митохондриальной функции
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.