Получение Крыса олигодендроцитов предшественники культур и Количественная оценка Oligodendrogenesis Использование двойного инфракрасного флуоресцентного Сканирование

Краткое содержание

Олигодендроциты являются миелинизирующими клетками центральной нервной системы. В этом протоколе описан метод выделения и культивирования их предшественников, клеток-предшественников олигодендроцитов, из коры головного мозга крыс, а также быстрый и надежный количественный метод оценки олигодендрогенеза in vitro в ответ на экспериментальные факторы.

Аннотация

Эффективный олигодендрогенез является терапевтической целью ряда областей исследований, включая травмы спинного мозга, неонатальную гипоксию и демиелинизирующие заболевания, такие как рассеянный склероз и поперечный миелит. Миелинизация необходима не только для содействия быстрому распространению импульсов в центральной нервной системе, но и для обеспечения трофической поддержки нижележащих аксонов. Клетки-предшественники олигодендроцитов (OPC) могут быть изучены in vitro для выявления факторов, которые могут способствовать или ингибировать дифференцировку олигодендроцитов. На сегодняшний день многие из доступных методов оценки этого процесса требуют либо большого количества клеток, что ограничивает количество условий, которые могут быть исследованы в любой момент времени, либо трудоемких методов количественной оценки. В данной работе мы описываем протокол выделения большого количества высокочистых OPC вместе с быстрым и надежным методом определения олигодендрогенеза из нескольких состояний одновременно. OPC выделяют из коры головного мозга новорожденных крыс P5-P7 и выращивают in vitro в течение трех дней до дифференцировки. Через четыре дня после дифференцировки олигодендрогенез оценивают с помощью двойного инфракрасного флуоресцентного сканирующего анализа для определения экспрессии белка миелина.

Введение

Эффективное нервной проводимости в центральной нервной системе млекопитающих (ЦНС) требует миелинизации аксонов путем олигодендроцитов. Во время разработки, олигодендроциты возникает из совокупности клеток олигодендроцитов предшественников (OPCS), которые считаются мигрировать из желудочковой зоны развивающегося переднего мозга и нервной трубки ^1. После миграции OPCs дифференцироваться в зрелые, myelinating олигодендроцитов, что не только способствует эффективному распространению импульса, но и обеспечить аксоны с трофической поддержки ^2. Взрослых ЦНС содержит обильные население OPCs, что разбросаны по всему серого и белого вещества, содержащего примерно 5-8% всех клеток ^3. После демиелинизирующих оскорбление, OPCs мигрируют к месту повреждения, размножаются, и дифференцируются, чтобы заменить утраченные или поврежденные миелиновые оболочки на открытых аксонов. Тем не менее, в некоторых ситуациях болезнь / травмы, этот процесс оказывается неэффективным или может не полностью ^4. В то время какхронический демиелинизация думали, чтобы добавить к бремени болезней, эффективного oligodendrogenesis и ремиелинизации может облегчить симптомы ^5. Поэтому было интересно изучить OPCs в пробирке, чтобы определить влияние экспериментальных факторов на oligodendrogenesis.

Понимание различных этапах олигодендроцитов дифференциации стало возможным путем идентификации стадии конкретных клеточных маркеров. Самообновляющихся ранние клетки-предшественники определяются их экспрессии, полученный из тромбоцитов альфа рецептора фактора роста (PDGFRα), нейронная / глии антиген 2 (NG2) и A2B5 ^{6 - 8.} Как OPCs инициировать их дифференциации программы и вывести из клеточного цикла, они подавляют экспрессию этих маркеров и начинают экспрессировать белки, свидетельствующие о premyelinating олигодендроциты включая циклические нуклеотидов 3'-фосфодиэстеразы (CNPase) и O4. Наконец, их дифференциация в более зрелом oligodendrocytes характеризуется экспрессией миелиновых белков, ассоциированных, в том числе миелиновой-ассоциированный гликопротеин (MAG), протеолипидного белка (PLP), и основного белка миелина (ОБМ). МВР является внутриклеточным периферической мембранным белком и является основным компонентом миелиновой оболочки. Мыши, лишенные MBP разработать тяжелый фенотип, в которых ЦНС миелинизации значительно снижается, ведущий к тремор, судороги и ранней смерти ^9,10. Это важная роль MBP в миелинизации привело к его использованию в качестве маркера олигодендроцитов дифференциации в пробирке и в естественных условиях ^11.

Количественное определение MBP может быть достигнуто с использованием нескольких различных методик. ОТ-ПЦР и Вестерн-блоттинга позволяют количественно оценить уровни ОБМ при различных схемах лечения. Иммуноцитохимическая является общей качественный подход, который также может быть количественным, когда используются подходы микроскопии камеры на основе. Хотя эти системы являются надежными и фундаментальное значение дляизучение олигодендроцитов дифференциации, каждый из них имеет свои собственные недостатки, которые ограничивают их использование в скрининге лекарственных. Во-первых, количество первичных OPCs, которые необходимы для ОТ-ПЦР и Вестерн-блот-анализа снижает количество переменных, которые могут быть рассмотрены одновременно. В то время как требование ячейка для иммуноцитохимию значительно ниже, существенное время должно быть посвящено каждого эксперимента, если количественное и есть цель. Многочисленные изображения должны быть захвачены, а затем количественно для облегчения анализа экспериментальных. Эти оговорки стали важными препятствиями, которые следует учитывать для исследований, которые требуют высокую оценку пропускную способность. Здесь мы описываем способ, который использует основные аспекты от обоих иммуноцитохимию и западных методик блоттинга для миелина количественного, при этом значительно снижая как количество клеток, необходимых и времени, чтобы завершить количественный анализ.

Протокол

Процедуры, связанные с предметов животного были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) и Джона Хопкинса Школе медицины.

1. Подготовка Планшеты исходные растворы и OPC медиа базу

Примечание: Крыса OPC базовые (Sato) СМИ, описанные здесь, была получена из ранее опубликованных исследований ^12,13. Альтернативные препараты СМИ могут также быть совместимы с этой процедурой.

1. Ресуспендируют поли-L-лизин (PLL) до концентрации 10 мкг / мл в стерильной деионизированной воде. Внесите 400 мкл разбавленного PLL в каждую лунку черной стеной, ясно нижней 24 и тканей класса культура блюдо.
2. Coat блюда культуры тканей в течение 2 часов в 37 ° C культуре ткани инкубатор или на ночь в 4 ° C холодильнике.
3. Аспирируйте PLL из блюд с покрытием не менее 20 мин до обшивки. Разрешить оставшиеся PLL высохнуть из колодца путем размещения 24-луночные планшеты с крышкой частично приоткрыта в тканевой культурекапот. Убедитесь, что лунки полностью высохнуть, прежде чем покрытие изолированных OPCs. Клетки не будет придерживаться пластика, который имеет жидкую PLL подарок.
4. Подготовьте N-Ацетил-L-цистеин (NAC) маточного раствора (1,000x): Растворить 100 мг N-ацетил-L-цистеин (NAC) в 20 мл среды Игла в модификации Игла (DMEM). Алиготе и хранить при температуре -20 ° C.
5. Подготовьте гидрокортизон маточного раствора (1,000x): Добавить 1 мл этанола до 1 мг гидрокортизона и водоворот, чтобы растворить. Добавить 19 мл DMEM, перемешать раствор, аликвоты и хранят при -20 ° С. Добавление гидрокортизона к базовой сред было показано для повышения выживаемости клеток глии ^14.
6. Подготовьте D-Биотин маточного раствора (5,000x): Растворить 2,5 мг Д-биотин в 50 мл PBS. Добавьте 1-2 х 5 мкл капель 0,1 N NaOH, чтобы помочь в растворения. Алиготе и хранить при температуре -20 ° C.
7. Подготовьте Инсулин маточного раствора (100x): Растворить 25 мг Инсулин в 50 мл очищенной воды тканевой культуральной. Добавить 250 мкл OF 1 N HCl и перемешивают до раствор не станет прозрачным. Стерилизация с фильтром 0,22 мкм и хранят при температуре 4 ° С в течение до 6 недель.
8. Подготовьте Sato маточного раствора (100x):
   1. Подготовьте прогестерона маточного раствора (25 мкг / мкл): Растворить 2,5 мг прогестерона в 100 мкл этанола.
   2. Подготовьте селенит натрия маточного раствора (400 нг / мкл): Растворить 4 мг селенита натрия в 100 мкл 0,1 N NaOH. Добавьте 10 мл DMEM и перемешать.
   3. К 100 мл DMEM, добавляют 1 г человеческой апо-трансферрина, 1 г бычьего сывороточного альбумина и 160 мг путресцина и перемешать до полного растворения. Добавить 25 мкл исходного раствора прогестерона, 1000 мкл селенит натрия маточного раствора, и перемешать. Алиготе и хранить при температуре -20 ° C.
9. Подготовьте OPC медиа базу: на 100 мл DMEM (с 4,5 г / л D-глюкозы, L-глутамина, и 110 мг / л пирувата натрия), добавьте 100 мкл NAC 100 мкл гидрокортизон, 20 мкл D-биотин, 1 мл инсулина, 1 мл Сато складе, 100 мкл микроэлементы B,2 мл B-27 добавка (50x), и 1 мл пенициллина / стрептомицина (100х). Стерилизация с фильтром и магазина 0,22 мкм при 4 ° С.
10. Подготовьте PDGF-AA маточного раствора (1,000x): Растворить 250 мкг в 12,5 мл PBS с 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), чтобы сделать 20 мкг раствора / мл. Алиготе и хранить при температуре -80 ° C.
11. Подготовьте OPC носитель пролиферации: OPC базовые дополненной 20 нг / мл PDGF-AA.
12. Подготовьте OPC среде для дифференцировки: OPC базовых дополненной 45 нМ трийодтиронина.
13. Подготовьте буфер столбец: К 500 мл PBS, добавить 2,5 г BSA и 2 мл 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) и доведения рН до 7,2. Стерилизация с фильтром и магазина 0,22 мкм при 4 ° С.

2. мозга крысы Препарирование

Примечание: щенки P5-P7 крысы используются в данном протоколе. Каждый крысят кора дает примерно 1,5-2,0 ^{× 10 6} A2B5 положительных клеток.

1. Стерилизовать все рассечение оборудование, используя 2506 С подогревом шарик стерилизатор.
2. Добавить 15-20 мл ФБР (без Ca ^{2+ и} Mg ²⁺⁾ до 50 мл конические пробирки. Один 50 мл коническую трубку достаточно для 3-4 крысят коры. Поместите 50 мл конические пробирки на льду. Используйте 50 мл конические пробирки провести нарезанный кубиками коры ткани во время вскрытия.
3. Добавить холодным ФСБ в 10 см чашку Петри. Это блюдо будет использоваться для рассечения под световым микроскопом.
4. Жертвоприношение крысят путем декапитации с большими хирургическими ножницами. Спрей голову с 70% этанола.
5. Выписка весь мозг
   1. Использование маленькие ножницы порезать кожу вниз по средней линии и за ушами и очистить кожных лоскутов обратно. Вырезать череп вниз среднюю линию, начиная с мозга и заканчивая глазами. Будьте осторожны, чтобы не зайти слишком далеко, чтобы сохранить структуру основного коры.
   2. Сделать две боковые порезы уступает мозжечка, вставив небольшие хирургические ножницы в затылочное отверстие. Сделать дополнительный разрез между глазами, муравейerior к обонятельной луковицы.
   3. Аккуратно снимите каждую половину черепа обратно. Удалить весь мозг и место в 10 см чашке Петри заполнены холодной PBS.
6. Под рассечение световом микроскопе, удалить обонятельные луковицы и мозжечок с мелкими хирургическими щипцами.
7. Флип мозг таким образом, что вентральная поверхность видна в световом микроскопе.
8. Использование тонких прямые щипцы выполнить тупым путем размещения закрытые щипцы советы между корой и гипоталамуса на глубину около 2/3 мозга. После щипцы на месте позволяют концы, чтобы открыть. Повторите для другой полушарии.
9. Дразнить кору от гипоталамуса и среднего мозга регионов.
10. Удалить гипоталамус, таламус, а средний мозг, удерживая средний мозг на ее задней поверхности и шелушение его к переднему концу мозга. Север передние соединения.
11. Удалить гиппокамп от пилинг его наружу, а затем разрывая ее связь скора с использованием тонких изогнутых рассечение пинцет.
12. Удалить остатки полосатое тело, избавляясь его от основной коры в наружу диагонали движения с использованием тонких изогнутых рассечение пинцет.
13. Очистить все кровеносные сосуды и мозговые оболочки из вентральной поверхности коры.
14. Флип мозг таким образом, что верхняя сторона видна. Мозговых оболочек и кровеносных сосудов должны быть очевидны. Пил оболочек от подстилающей коры с использованием тонких рассечение пинцет. Начало пилинг из обонятельной месте крепления лампы.
15. Полный шаги 2.4-2.14 в общей сложности 3-4 крысят.
16. Поместите 3-4 расчлененный крысят кору в сухую чашку Петри и нарезать стерилизованной лезвием до 1 мм х 1 мм куски не будут достигнуты. Собрать ткань путем промывки блюдо с PBS с одного 50 мл коническую пробирку (шаг 2) Затем поместите обратно на лед.

3. Ферментативный-механический ткани Диссоциация

Примечание: На этом этапе, рекомендуется комплект нейронная диссоциации папаин основе. Используя NeУральский диссоциация Kit (P), специальные шаги, которые являются оптимальными для выделения OPC описаны.

1. Подготовьте первую диссоциации фермент разбавлением фермента P с соответствующим буфером. Содержимое каждой 50 мл коническую (1 образец) будет ресуспендировали в общей сложности 1,950 мкл смеси ферментов. Место в ферментной смеси в бане с температурой 37 ° в течение 10 мин.
   1 Примеры: 1,900 мкл буфера + 50 мкл фермента папаина
2. Спин всех 50 мл конические пробирки, содержащие 3-4 кубиками щенок кору крыс при 300 мкг в течение 3 мин.
3. Аспирируйте супернатант и добавить 1950 мкл ферментного раствора к каждому пробирку и распадаются осадок от переворачивания пробирки и встряхивая осторожно.
4. Инкубируйте в 37 ° C культуре ткани инкубаторе в течение 15 мин с вращением непрерывной трубки.
5. В течение последних 5 мин инкубации, подготовить второй фермент смесь А. Развести фермента в его соответствующем буфере. В общей сложности 30 мкл будут добавленыКаждому 50 мл коническую пробирку.
   1 Образец: 20 мкл буфера + 10 мкл фермента
6. После инкубации завершена добавить 30 мкл второго фермента смеси в каждую пробирку и инвертировать перемешать.
7. Используя стеклянную пипетку Пастера, прикрепленный к контроллеру пипетки, механически отделить ткань с помощью пипетки в 10-15 раз или до кусочки ткани уменьшаются в размерах и раствор стал мутным. Возвращение образца на 37 ° C культуре ткани инкубаторе в течение 15 мин при непрерывном вращении.
8. Внесите каждой ткани гомогенат Sample 10-15 раз с помощью 1 мл пипетки.
9. Внесите каждой ткани гомогенат Sample 15-20 раз с помощью 200 мкл пипетки
10. Возвращение все образцы в 37 ° C культуре ткани инкубаторе в течение 10 мин при непрерывном вращении.
11. Добавьте 10 мл PBS (с ^{Са 2+} и ^{Mg 2+)} к каждому образцу и фильтровать гомогената через 40 мкм поры фильтра помещенном над 50 мл трубка. Промыть фильтр с дополнительными 1-2 мл PBS.
12. Бассейн все образцы гомогенатов в один 50 мл коническую пробирку и приобретают общую подсчет клеток.
13. После выполнения подсчет клеток, разделить гомогената равномерно в 15 мл конические пробирки (1 пробирка для каждого образца). Центрифуга в течение 10-12 мин при 300 х г.

4. Анти-A2B5 бисера Применение, колонны очистки, и покрытие

1. Выполните вычисления для буфера столбца и анти-A2B5 микросфер. Добавить 7 мкл буфер столбец за каждый 1 ^{× 10 6} клеток. Добавить 2 мкл анти-A2B5 микрошарики на каждый 1 ^{× 10 6} клеток.
2. Зерноуборочный всех образцах путем ресуспендирования клеток в общем объеме 10 мл колоночного буфера и центрифуге при 300 мкг в течение 10-12 мин.
3. Ресуспендируют осадок клеток в соответствующем количестве колоночного буфера, рассчитанный на шаге 4.1. Если осадок большой и рыхлый, только добавить примерно половину объема буфера колонку, чтобы держать антиТело в соответствующей концентрации в клеточной взмучивания.
4. Инкубируйте клеточной суспензии в течение 10 мин при 4 ° С.
5. Добавить анти-A2B5 микрошарики (вычисленное на этапе 4.1), инвертировать несколько раз и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 30-60 мин. Аккуратно переверните трубку несколько раз через каждые 10 мин. Более длительное время инкубации может повысить урожайность клеток, но может увеличить неспецифическое связывание.
6. Добавьте 5 объемами колоночного буфера. Если клетки ресуспендировали в объеме 1 мл, добавляют 5 мл колоночного буфера, тогда как, если клетки ресуспендируют в 2 мл, добавляют 10 мл колоночного буфера.
7. Центрифуга в течение 10 мин при 300 х г в.
8. Определите, сколько LS колонки будут нужны для очистки. Одна колонка LS является достаточным для 15-20 ^{х 10 6} общего числа клеток.
9. Ресуспендируют осадок клеток в 1000 мкл буфера колонку в колонке LS используется.
10. Prime каждый столбец LS добавлением 5 мл колоночного буфера. Сбор поток через в 50 мл коническую трубку. После того, как бу столбцовffer полностью проходить через верхнюю камеру, применяются 1,000 мкл клеточной суспензии в каждой колонке и позволяют клеткам проходить через самотеком.
    Примечание: Если плотность клеток слишком высок, колонна может работать медленно.
11. Сразу же после клеточную суспензию прошла через колонку, медленно добавить 3 мл колоночного буфера для каждого столбца, чтобы промыть несвязанных клеток. Если мыть легко проходит через колонку (1 капле на каждый 30-45 сек), мыть два дополнительных раза с 3 мл колоночного буфера.
12. Удалить каждую колонку и поместить его на коническую трубку 15 мл. Добавьте 5 мл колоночного буфера и погрузить буфер через колонку с высокой скоростью, используя пластиковую поршень, содержащийся с колонкой. Погружаясь будет сместить связанные клетки выпускать их из колонки.
13. Увеличение чистоты, запустив образца через второй раунд LS колонок. Используйте одну треть число столбцов, используемых во время первого прохода. Премьер столбцы с 5 мл буфера столбца.Разрешить буфер столбец проходить через верхнюю камеру.
14. Поскольку объем клеточной суспензии будет значительно больше, равномерно распределить 1000 мкл клеточной суспензии в каждой колонке и дать суспензии проходить через верхнюю камеру колонки, прежде чем пополнение с дополнительными 1000 мкл.
15. После того, как клеточная суспензия была полностью применяется ко второму раунду колонн, мыть 2-3 раза с 3 мл буфера столбца.
16. Удалить каждую колонку и поместите его над стерильной 15 мл коническую трубку. Добавьте 5 мл буфера столбца и погрузить буфер, используя пластиковую поршень, который в комплекте с колонки. Погружаясь будет сместить связанные клетки выпускать их из колонки.
17. Центрифуга клеточной суспензии при 300 мкг в течение 12-15 мин. Осадок должен появиться компактный.
18. Ресуспендируют осадок клеток в 5-10 мл подогретого СМИ OPC пролиферации (OPC базовые дополненной PDGF-AA 20 нг / мл).
19. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
20. Пластина клеток. Развести клетки до 60000 клеток / мл с массовой информации OPC пролиферации. В каждую черный, прозрачным дном 24 и, пипетки 500 мкл клеток вдоль стороны скважины для получения 30000 клеток на лунку. Смешайте клетки путем встряхивания пластины горизонтально с помощью восьмерку движение. При выполнении анализа в 48, 96 или 384-луночных планшетах, добавить 15000, 7500, или 1500 клеток на лунку, соответственно. Эти числа могут быть отрегулированы в зависимости от индивидуальных спецификации плит.
21. Подготовьте отдельную тарелку для культур базовый контроля день 0. Этот контроль пластина должна быть фиксировали 4% параформальдегидом, как описано в разделе 5.7, когда дифференциация инициируется на день 0.
22. Культуры клеток в OPC СМИ пролиферации при 37 ° С в течение 3 дней без смены носителя.

5. Индукция OPC дифференциации и фиксации 4% параформальдегидом

Примечание: При тестировании влияние малых молекул на oligodendrogenesis, мы обычно dissolvе препараты в диметилсульфоксиде (ДМСО), чтобы подготовить 1,000x запасы, которые затем могут быть сохранены при -80 ° C и разбавленные непосредственно в SATO сред для получения конечной концентрации 0,1% ДМСО. Мы не наблюдали никаких изменений ни в одном OPC пролиферации или дифференцировки использовании этого концентрацию ДМСО (данные не показаны).

1. Предварительно теплой OPC база СМИ до 37 ° С и оттепели запасы лечения наркотической зависимости до комнатной температуры. При выполнении процедуры в двух экземплярах, подготовить около 1,25 мл среды на группу лечения в 1,5 мл трубки. Для трех образцов с помощью 2 мл емкость центрифужные пробирки для учета слабину.
2. Подготовьте лечения мастер смеси для повторных скважин путем разбавления акции лечения непосредственно в OPC базовой СМИ. Кратко вихрь или осторожно перемешать каждый Mastermix чтобы обеспечить однородное распределение лечения.
3. Подготовьте 45 Нм трийодтиронин (Т ₃₎ в качестве положительного контроля и соответствующей транспортном средстве в качестве отрицательного контроля. Развести 10 мм т ₃ акции1: 1000 в 1 мл OPC базовых сред, а затем дополнительно разбавить в мастер лечение смеси, чтобы снизить конечную концентрацию ДМСО в случае необходимости.
4. Аспирируйте носитель из культуральной скважин группы один лечения одновременно с тем, чтобы избежать сушки клетки. Используйте 200 мкл пипетки наконечник на конце стеклянной Пастера пипетки, чтобы избежать соскабливания черный материал от боковых сторон колодца и в культуре.
5. Медленно добавить 500 мкл лечения Mastermix вдоль стороны колодца с использованием 1 мл пипетки.
6. Инкубируйте культур для требуемого периода времени, выполняя полную обмен медиа свежей средой лечения каждые 2-3 дня. Мы регулярно наблюдаем 30-40% MBP ⁺ культуру после 4 дней в среде для дифференцировки.
7. В конце желаемого периода лечения, подготовить свежий 4% параформальдегида (PFA) или оттаивать замороженную запас до комнатной температуры. ВНИМАНИЕ: PFA является чрезвычайно токсичным и должны быть готовы в вытяжном шкафу.
8. Аспирируйте СМИ и медленно добавить 4001; л PFA в сторону скважины, чтобы зафиксировать клетки. Инкубируйте планшет в течение 20 мин при комнатной температуре.
9. Аспирируйте PFA и медленно добавить 500 мкл стерильной D-PBS (с ^{Са 2+} и ^{Mg 2+)} к стороне скважины промыть клетки. Повторите стирке в общей сложности более двух раз. Не аспирации последней промывки.
10. Обертка пластину в парафином и хранить при температуре 4 ° С для последующей обработки или сразу перейти к следующему шагу. Плиты могут быть сохранены в течение нескольких недель.

6. Иммуноцитохимическая и количественное определение основного белка миелина

Примечание: При выполнении процедур обработки жидких в 24-луночные планшеты, рекомендуется работать быстро, чтобы избежать сушки клетки. Здесь рекомендуется использование вакуумного аспиратора многоканальной пипетки и многоканального.

1. Доведите пластину к комнатной температуре, аспирации скважин, а также добавить 250 мкл D-PBS (с ^{Са 2+} и ^{Mg 2+),} содержащих 0,1% Triton X-100 и 5%нормальной козьей сыворотки (NGS). Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 1 ч при осторожном встряхивании орбитальной.
2. Подготовьте первичный инкубационную разбавлением мышиное моноклональное анти-МВР антител 1: 1000 и кроличьи поликлональные анти-актин антитела 1: 200 в D-PBS (с Са ^{2+ и Mg 2+),} содержащий 5% NGS. Альтернативно, кроличье поликлональное антитело против Olig2 на 1: 1,000 могут быть использованы для олигодендроцитов конкретной нормализации в смешанных глиальных культур. Подготовьте достаточно первичную решение для размещения 250 мкл на лунку.
3. Инкубируйте первичных антител при 4 ° С в течение ночи для 16-18 ч при осторожном встряхивании орбитальной.
4. Аспирируйте первичный инкубационную и промыть клетки 3 х 10 мин с 500 мкл D-PBS (с ^{Са 2+} и ^{Mg 2+)} при комнатной температуре при осторожном встряхивании орбитальной.
5. Хотя промывания планшета, подготовить вторичную инкубационную разбавлением анти-мышь 680 и анти-кроличий 800 антител 1: 500 в D-PBS (с ^{Ca 2+} и ^{Mg 2+),} содержащий 5% NGS. Свести к минимуму воздействие внешней освещенности при подготовке этого решения.
6. Аспирируйте окончательной промывки и добавить 250 мкл вторичного раствора инкубации. Защита пластину от света и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч при осторожном встряхивании орбитальной.
7. Аспирируйте вторичную решение инкубации и промывки лунки 3 х 10 мин с 500 мкл D-PBS (с ^{Са 2+} и ^{Mg 2+)} при комнатной температуре при осторожном встряхивании орбитальной.
8. Сканирование пластины с использованием системы визуализации, способный обнаруживать 700 нм и 800 нм эмиссии флуоресценции. В качестве отправной точки, Установите фокусное смещение 3 и чувствительностью до 1,5 для MBP, 5,0 актина и 3,5 для OLIG2. Отрегулируйте значения чувствительности по мере необходимости, чтобы избежать сигнала передержки.
9. Количественной оценки степени oligodendrogenesis используя полу-автоматизированное программное обеспечение на основе методов.
   1. Использование программного обеспечения, установить режим пластина анализа для "24 скважина» и выровнять круги вокруг тон внешний периметр отсканированных скважин. Установите нормализации канала на "800" и экспортировать общие и относительные интенсивности флуоресценции для 700 нм (MBP) и 800 нм каналах (Olig2 / Актиновые).
   2. Разделить интенсивность при 700 нм по интенсивности при 800 нм, чтобы дать нормализованное выражение MBP в относительных единицах флуоресценции. Рассчитать среднее повторных измерений и масштабировать выражение в день 0 управления + PDGF мере необходимости для анализа.

Результаты

A2B5-положительным OPCs выделяют посредством позитивной селекции клеток с использованием магнитного разделительную систему колонка. До процедуры выделения, весь мозг удаляют из крысят, которые между Р5 и P7. После того, как весь мозг успешно отделен от черепа, обонятельной луковицы и мозжечок удаляют с использованием тонких хирургических щипцов (рис 1а). Для того чтобы выделить церебральную ткани коры гипоталамус, таламус и средний мозг иссекали путем тщательного вскрыти...

Обсуждение

Протокол, представленные здесь описывает быстрый и надежный метод для выделения OPCs крыс и количественной экстракорпоральное oligodendrogenesis в ответ на экспериментальных факторов. Используя положительный выбор, высокие урожаи жизнеспособных и чистых OPCs используются непосредственно для экспериментальных целей. Этот метод упрощает выделения, культивирования и шаги дифференцировке в сроки 1 недели, и фиксированные клетки могут быть удобно хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких недель без каких-ли...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Dissection Materials
PBS без Ca2+ и Mg2+	Mediatech	21-040-CV	1x
10 см Чашки Петри из полистирола	Fisherbrand	0857512
Light Dissection Микроскоп	Motic	SM2-168
Dissociation Материалы
трубчатый ротатор	Miltenyi Biotec	130-090-753	Диссоциативная трубка ротатора
Набор для диссоциации нервной ткани (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628	Набор для ферментативной диссоциации
PBS с Ca2+ и Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
40; m Сетчатый фильтр	Corning	352340
A2B5 Очистка колонок  Микрогранулы
Anti-A2B5	Miltenyi Biotec	130-097-864	A2B5
Антитела	Miltenyi Biotec	130-042-401	Магнитные селекционные колонки
EDTA	Corning	46-034-Cl	2 мМ
PBS с Ca2+ и Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
Бычья сыворотка альбумин	Sigma-Aldrich	A9647	0,50%
Culture Materials
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 нг/мл
Диметилсульфоксид	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 мл
трийодтиронин	Sigma-Aldrich	T6397	45 нМ
Соль фумарата клемастина	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μ
М Кветиапина соль гемифумарата	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μ M
N-ацетилцистеин	Sigma-Aldrich	A9165	5 μ г/мл
Прогестерон	Sigma-Aldrich	P8783	60 нг/мл
Поли-L-лизин	Sigma-Aldrich	P1524	10 μ г/мл
Путрецин	Sigma-Aldrich	P7505	16 μ г/мл
Селенит натрия	Sigma-Aldrich	S5261	40 нг/мл
Гидрокортизон	Sigma-Aldrich	H0135	50 нг/мл
d-биотин	Sigma-Aldrich	B4639	10 нг/мл
Инсулин	Sigma-Aldrich	I6634	5 μ г/мл
Апо-трансферрин	Sigma-Aldrich	T1147	100 μ г/мл
Бычья сыворотка альбумин	Sigma-Aldrich	A4161	100 μ г/мл
микроэлементов B	Corning	25-022-Cl	1x
Б-27 Дополнение	Лайф Технолоджис	17504044	1x
Пенициллин/Стрептомицин	Лайф Технолоджис	15140122	1x
ДМ	Лайф Технолоджис	11995-065	1х
24-луночный Черный Визиплат с крышкой	Perkin Elmer	1450-605	Культура тканей Grade
Immunocytochemistry and Quantification
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0,10%
Нормальная козья сыворотка	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
мышиный моноклональный анти-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1,000 Разведение
кролика поликлональный анти-Актин	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 Разведение
кролика поликлональный анти-Olig2 Millipore		AB9610	1:1,000 Разведение
козы анти-мышь 680RD	Licor	926-68070	1:500 Разведение
козы анти-кролик 800CW	Licor	926-32211	1:500 Разведение
Alexa Fluor 594 козий анти-мышиный	Life Technologies	A11032	1:1,000 разведение
Alexa Fluor 488 козий анти-кролик	Life Technologies	A11008	1:1,000 разведение
Prolong Gold antifade с DAPI	Life Technologies	P36931
DPBS с Ca2+ и Mg2+	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx Инфракрасная система визуализации	Licor