Данная статья представляет собой быстрый и простой способ введения блеомицин непосредственно в трахею мыши с помощью интубации. Основные преимущества этого метода является то, что это очень воспроизводимые, легко освоить, и не требует специального оборудования или длительных сроков восстановления.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Усовершенствованный метод Rapid интубации трахеи у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Несмотря на некоторые анатомические и физиологические различия, мышиные модели продолжают оставаться важным инструментом для изучения заболеваний легких человека. Токсичность блеомицина является широко используемой моделью для изучения как острого повреждения легких, так и фиброза, и было разработано несколько методов введения блеомицина (и других токсичных агентов) в легкие. Тем не менее, многие из этих подходов, такие как транстрахеальная инстилляция, имеют присущие им недостатки, включая необходимость сильных анестетиков и хирургического вмешательства по выживанию. В этой статье сообщается о быстром, воспроизводимом методе интратрахеальной интубации, который включает в себя мягкую ингаляционную анестезию, визуализацию трахеи и использование суррогатного спирометра для подтверждения воздействия. В качестве доказательства концепции 8-12-недельным мышам C57BL/6 вводили либо 2,0 Ед/кг блеомицина, либо эквивалентный объем PBS, а также измеряли повреждения и фиброзные конечные точки после воздействия. Эта процедура позволяет исследователям лечить большую когорту мышей за относительно короткий период времени с небольшими затратами и минимальным уходом после процедуры.
Введение
Несмотря на некоторые анатомо-физиологические различия, 1 модели мышиных оставаться бесценным для моделирования биологии человека и патогенеза заболевания. 2 С животноводства точки зрения, мышей легки в обращении, имеют низкое время размножения, ускоренный срок, и относительно недороги в дом. С развитием различных генетических штаммов и стратегий (например., Условные нокауты, корреспондент мышей, клона трассировки подходов и т.д.), а также широкий диапазон доступных реагентов (например., Антитела, рекомбинантные белки, ингибиторы, и т.д.), мышей стали неотъемлемой модель позвоночных организм раскрыть гомеостаза и болезненных процессов человека. 3
Мыши были особенно ценны для изучения легочных заболеваний, в том числе острого повреждения легких (ALI) и фиброза легких. 4 ALI у человека может быть вызвана травмой, травмы или сепсиса и характеризуется эпителиальной иэндотелиальных утечки (т.е.., отек), воспаление и фиброз возникающий. У многих пациентов, ALI прогрессирует до тяжелой форме, острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), что часто приводит к фиброзу и смерти из-за дыхательной недостаточности. 5,6 Пневмосклероз является прогрессивным, фатальным патология характеризуется избыточным отложением внеклеточного матрикса , особенно типа коллагена, что приводит к нарушению функции легких. 7,8 администрацию блеомицин (BLM) является наиболее широко используемым и наиболее хорошо охарактеризованных модель для индукции ALI и фиброз у подопытных животных. 9 Хотя BLM-индуцированной легочный фиброз у грызунов делает не повторять полностью на фиброзные фенотипы человека, 10 исследований на мышах с этой моделью привели к открытию многих важных факторов, влияющих на возникновение и прогрессирование болезни. 11
Хотя точный механизм (ы) позади BLM-индуцированной фиброгенеза неизвестны, инициирующий травмыСчитается, что возникают из контакт-зависимые перерывов нитей ДНК в эпителиальных клетках, выстилающих проводящие дыхательные пути и альвеолы и, в частности, тип 1 пневмоцитами. 12 Необходимость прямого контакта между BLM и легочный эпителий подчеркивает важность надежной маршруту доставки , и эти проблемы также уместны в широком диапазоне процедур адресованный дистальных дыхательных путей, в том числе рекомбинантных белков, антител, миРНК, вирус, бактерии, частицы, и больше. Орофарингеального аспирации (ОРА) широко используются для этой цели 13, но основным недостатком ОРА является то, что часть поставленного агента может быть проглочена в желудочно-кишечном тракте, тем самым приводя к неточности в введенной дозы. Другой широко применяемый подход транстрахеальная закапывания, который включает в себя трахеостомии под сильным наркозом подвергать трахеи и инстилляцию агента непосредственно в дыхательные пути. 14 Тем не менее, не только может, напримерпроцедура нежелательно из-за его invasivity, но это также много времени, требует справедливый бит обучения, и вызывает мощную травмы дыхательных путей были разработаны. 15,16 Несколько протоколов, которые связаны с непосредственным управлением агентов в трахеи без необходимости хирургического вмешательства, 16,17,18,19,20, но эти способы включают расширенные сроки восстановления вызвано мощными анестетиками, использование дорогостоящего оборудования (т.е.., отоскоп / ларингоскопическая, коммерчески доступные процедура доски, волоконно-оптические провода и т.д.), избыток манипуляции в полости рта, а также неопределенность в отношении дозировки.
Эта статья описывает относительно простой метод введения через интубации, который позволяет исследователю быстро, недорого и надежно привить реагента в мышиной легкого с ограниченным риском остаточного повреждения окружающих тканей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Животное уходу и использованию Институциональные комитеты (IACUC) из Университета штата Вашингтон и Cedars-Sinai Medical Center одобрили животных работу, необходимую для этих исследований.
1. Подготовка
- Стерилизовать обе тупым концом щипцов и депрессорные через автоклав.
- Использование биологической безопасности, подготовить рабочий запас BLM в PBS с лиофилизированного порошка. Разрушать ультразвуком решение в течение 10 мин при 35 кГц, чтобы обеспечить равномерное смешивание.
Примечание: Общий объем от 30 до 45 мкл рекомендуется для предотвращения изменения пипетки на нижнем конце, и удушье с большими объемами. - Подготовьте чистую рабочую среду, которая включает в себя около 1 м 2 для самой процедуры, а также отведенных мест для клеток до и после процедуры.
- Закрепить основание процедуры борту к скамейке сразу перед исследователем путем укладки 2 или 3 полоски лабораторного ленты через основание и underlин скамейки. На рисунке 1 дальнейших уточнений по созданию доска.
- Свяжите одну длину размер 4.0 шовная нить между двумя позиционирования винтов процедуры борту.
- Генерировать самодельный спирометра путем удаления и отбрасывая поршень из трех 1 мл шприцы, и осаждение 60 мкл PBS в верхней части каждого ствола, чтобы сформировать герметичное уплотнение. Зафиксировать ступицу катетера неплотно к одному из шприцов и поместить его в одну сторону доски.
- Аспирируйте 300 мкл воздуха в 1 мл шприц и поместите его в одну сторону доски.
- Вырезать дополнительный кусок ленты около 6 дюймов в длину и отложить в сторону. Эта информация будет использоваться для обеспечения животное к доске на этапе 2.4.
- Настройка ИФ камеру. Приложить О 2, изофлуран и вакуум к соответствующим портам на обоих экспозиционной камере и вакуума зазором. В качестве альтернативы, управлять анестетик в ИФ-совместимый биологическаяБезопасность шкафа.
2. интубации
- Обезболить мышь с изофлуран в камере, пока он не теряет сознание и дыхание замедляется до соответствующей скоростью. Типичная экспозиция включает в себя 4% изофлуран и 2% O 2 от 3 до 4 мин, а идеальный результат составляет от 2 до 2,5 мин седации. Это соответствует частоте дыхания 1 вдох каждые 2 сек.
- В ожидании седации, чтобы привести в, аспирация от 30 до 45 мкл BLM в пипетки и отложить в сторону.
- Когда все будет готово, приостановить седативные мышь по его верхних резцов с резьбы, прикрепленной к позиционирующих винтов процедуры платформы. Убедитесь, что спинки животного лежит вплотную прилегает к поверхности платформы.
- Соблюдая осторожность, чтобы не ограничивать вентиляцию, поместите кусок ленты свободно поперек нижней (хвостовой) части грудной полости, чуть выше диафрагмы. Размещение должно быть достаточно жесткой, чтобы поддерживать надлежащее выравнивание во время прокаedure, но не настолько плотно, что он ограничивает дыхание.
- Включите осветитель, чтобы между 80% и 100% интенсивности и ориентировать на шток так, чтобы он составляет от 1 до 2 см от поверхности кожи, около солнечного сплетения. Периодически проверяйте наконечник гузнеке за тепло для того, чтобы она не травмировать мышь.
- Стоя позади платформы, использовать стерильные тупым концом щипцов, чтобы найти язык. Соблюдая осторожность, чтобы избежать нижних резцов, мягко сцепление и сделать язык из полости рта.
- Используя оставшуюся руку, вставьте Депрессор и использовать его, чтобы сгладить язык к полу полости рта. Отпустите щипцы, но оставить Депрессор на месте в течение следующих двух шагах.
- Направление освещения таким образом, чтобы трахеи видна, направляя на шток проксимально от уровня солнечного сплетения, пока не достигнет уровня mainstem бронхов.
Примечание: трахеи можно легко отличить под действием дыхания, беч вызывает испускаемый свет будет колебаться в интенсивности. При правильном положении, эта структура будет заметной в осевой плоскости в качестве центрально расположенным штифтом света с минимальным окружающим светом в самой ротовой полости. - Угол шприц так, чтобы она вытекает естественный путь трахеи, и понизить наконечник катетера 22-G, с присоединенным шприцем, содержащим каплю, прямо в просвет. Пузырь PBS начнет подниматься и опускаться с каждым вдохом после успешного размещения.
Примечание: Это действие может быть отложено на несколько секунд в результате глубокой седации. - Поток катетер в дополнительных 5 мм. Удалить язык депрессорных.
- Сдвиг шприц в противоположную стороны, и захватывающий ступицу, аккуратно удалите шприц.
- Депозит от 30 до 45 мкл BLM в центре внутренней части втулки катетера, закрепления второго шприц и обойтись 300 мкл воздуха в ступицу.
- Заменить второеШприц с первым содержащий пузырь PBS. Пузырь будет продолжать расти и падать, если процедура была выполнена успешно.
3. постабортных Уход
- Удалите катетер и ленту, и поместите животное в сухом теплом месте, пока он не приходит в сознание - как правило, в течение нескольких минут.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Интубированы мышей контролировали ежедневно для потери веса и тесноты, и умерщвляли 4, 10 или 17 дней спустя с помощью внутрибрюшинного введения 2,5% 2,2,2 tribromoethanol. Бронхоальвеолярный лаважа (БАЛ) было собрано в три моет PBS, как описано в другом месте 21 и правое легкое была зафиксирована в 10% формалине, парафин и окрашивали Trichrome Массона по Вашингтонского университета гистологии и изображений Ядра 22.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В случаях, когда аэрозолизации непрактично из-за ограниченной доступности реагентов, безопасности или стоимости, непосредственное введение трахеи является превосходным способом доставки экзогенных агентов в легкие 16 транстрахеальная закапывания широко используется для достижения этой цели. Однако, как и со всеми хирургического вмешательства, он также несет с собой потенциал для осложнений, вызванных самой процедуры, а не обязательно агент будучи привили. 13 По этим причинам, он ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы благодарят Брайан Джонсон из гистологии и визуализации керн при Университете штата Вашингтон за помощь в окрашивании трихромом и анализа. Эта работа была поддержана NIH гранты HL098067 и HL089455.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Бломицин для инъекций, 30 единиц / флакон | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | Для достижения наилучших результатов BLM следует суспензировать в PBS, аликвотировать и хранить в виде одноразовых лиофилизированных аликвот |
| Тупой конец щипцов | |||
| для языка Депрессор языка (т.е. изогнутый лезвийный электрод Valleylab, 2,4 ") | Covidien | E1551G | Перед использованием создайте изгиб на 45 градусов на 1,5 см от кончика лезвия. Подходящий депрессор также может быть создан из любого металлического орудия аналогичных размеров. |
| Exel Safelet Catheter 22G x 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 мл Одноразовый туберкулиновый шприц с скользящим наконечником (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0,2 мл Пипеттор и наконечники фильтров | |||
| Fiber-Lite Illuminator. Модель 181-1: Модель 180 в паре со стандартным двойным осветителем на гусиной шее | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Светодиодные светильники с более низкой мощностью не рекомендуются, так как они недостаточно освещают трахею. |
| для интубации | см. схему 1. | ||
| Цветная лента для этикеток: 0,5 в. Широкий | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Кислород | |||
| Фосфатно-солевой буфер, 1X | Corning | 21-040-CV | Продукт должен быть стерильным |
| Нестерильный шелковый черный плетеный шовный материал, 91,4 м, размер 4-0 | Гарвардский аппарат | 517698 | |
| настольный наркозный аппарат Изофлуран | Highland Medical Equipment | http://www.highlandmedical.net/ | |
| Slide Top Индукционная мышь Изофлурановая камера | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| ФОРАН (изофлуран, USP) жидкость для ингаляций 100 мл | Бакстер | 1001936040 | |
| Нанозумер Цифровая патологоанатомическая система | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | Бетил Лаборатории | Е90-101 |
Ссылки
- Hyde, D. M., Hamid, Q., Irvin, C. G. Anatomy, pathology, and physiology of the tracheobronchial tree: emphasis on the distal airways. J Allergy Clin Immunol. 124, S72-S77 (2009).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Peters, L. L., et al. The mouse as a model for human biology: a resource guide for complex trait analysis. Nat Rev Genet. 8, 58-69 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, 485-497 (2012).
- Sharma, S. Acute respiratory distress syndrome. BMJ Clin Evid. 2010, (2010).
- Saguil, A., Fargo, M. Acute respiratory distress syndrome: diagnosis and management. Am Fam Physician. 85, 352-358 (2012).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal Immunol. 2, 103-121 (2009).
- Wuyts, W. A., et al. The pathogenesis of pulmonary fibrosis: a moving target. Eur Respir J. 41, 1207-1218 (2013).
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Curr Opin Pulm Med. 17, 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis? Int J Biochem Cell Biol. 40, 362-382 (2008).
- Myllärniemi, M., Kaarteenaho, R. Pharmacological treatment of idiopathic pulmonary fibrosis - preclinical and clinical studies of pirfenidone, nintedanib, and N-acetylcysteine. European Clinical Respiratory Journal. 2, (2015).
- Reinert, T., Baldotto, C. S. dR., Nunes, F. A. P., Scheliga, A. A. dS. Bleomycin-Induced Lung Injury. Journal of Cancer Research. 2013, 1-9 (2013).
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Exp Lung Res. 32, 181-199 (2006).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. , (2010).
- Osier, M., Oberdorster, G. Intratracheal inhalation vs intratracheal instillation: differences in particle effects. Fundam Appl Toxicol. 40, 220-227 (1997).
- Driscoll, K. E., et al. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: Uses and Limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol (1985). 106, 984-987 (1985).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Lab Anim. 41, 128-135 (2007).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. J Vis Exp. , e50601(2013).
- Starcher, B., WIlliams, I. A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice. Lab Anim. 23, 234-240 (1989).
- Daubeuf, F., Frossard, N. Performing bronchoalveolar lavage in the mouse. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 167-175 (2012).
- Li, Y., et al. Severe lung fibrosis requires an invasive fibroblast phenotype regulated by hyaluronan and CD44. J Exp Med. 208, 1459-1471 (2011).
- Grazioli, S., et al. CYR61 (CCN1) overexpression induces lung injury in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 308, L759-L765 (2015).
- Redente, E. F., et al. Tumor necrosis factor-alpha accelerates the resolution of established pulmonary fibrosis in mice by targeting profibrotic lung macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 825-837 (2014).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. J Vis Exp. , e52261(2014).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
